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요약

이 프로토콜은 작은 DNA와 RNA 기판에 폴리 뉴클레오티드 키나아제 (PNKs)의 키나아제 활성을 측정하는 비 방사성 분석기를 설명합니다.

초록

폴리뉴클레오티드 키나아제(PNKs)는 DNA와 RNA 올리고뉴클레오티드의 5' 하이드록실 끝의 인산화를 촉매하는 효소이다. PNK의 활동은 직접 또는 간접 접근 방식을 사용하여 정량화될 수 있습니다. 여기에 제시된 형광표지 올리고뉴클레오티드 기판 및 폴리아크릴아미드 젤 전기포광에 의존하는 PNK 활성을 측정하는 직접적인 시험관내 접근법이 여기에 제시된다. 이 방법은 무선 표지기기의 사용을 피하면서 인산 제품의 해상도를 제공합니다. 이 프로토콜은 인산화 반응을 설정하고, 대형 폴리아크릴아미드 젤을 준비하고, 반응 제품을 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 분석의 가장 기술적으로 도전적인 부분은 큰 폴리 아크릴 아미드 젤을 붓고 실행하는 것입니다; 따라서 공통의 어려움을 극복하기 위한 중요한 세부 사항이 제공됩니다. 이 프로토콜은 Grc3, 결합 파트너, Las1 nuclease와 의무 사전 리보소말 RNA 처리 복합체로 조립 하는 PNK에 대 한 최적화 되었다. 그러나, 이 프로토콜은 다른 PNK 효소의 활성을 측정하도록 적응될 수 있다. 더욱이, 이러한 분석은 또한 뉴클레오시드 삼위산염, 금속 이온 및 올리고뉴클레오티드와 같은 반응의 상이한 성분의 효과를 결정하기 위해 수정될 수 있다.

서문

폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK)는 DNA 수리 및 리보솜 어셈블리1,,2,,3,,4,,5와같은 많은 DNA 및 RNA 처리 경로에서 중요한 역할을 한다. 이러한 근본적인 효소는 뉴클레오시드 삼위산염(NTP, 가장 자주 ATP)에서 뉴클레오티드 기판의 5' 하이드록실 끝으로 의 단말(감마) 단포산염의 전달을 촉매한다. 가장 잘 특징적인 PNK 중 하나는 광범위한 기판 특이성을,가지며 DNA 또는 RNA 기판,6,,7, 7,8,9,10,,911,,12의5종에 방사성 동위원소 라벨을 통합하기 위한 분자 생물학 실험실에서 크게 활용되는 박테리오파지 T4 PNK이다. PNK 효소의 또 다른 예는 EUKarya, 유박테리아 및 고고학에서 발견되는 CLP1이며, 여러 RNA 처리 경로4,,,13,14,,15에연루된다.

역사적으로, 폴리뉴클레오티드 키나아제 활성을 측정하는 대부분의 분석체는 방사성 동위원소 라벨링 및 후속 사인 방사선 촬영5,,16에의존한다. 최근에는 단일 분자 접근법, 마이크로칩 전기포전, 분자 비콘, 색색 및 발광 계분석17,,18,,19,,20,,21,,22를포함한 PNK 활성을 측정하기 위해 다수의 추가 분석이 개발되었다. 이러한 새로운 접근 방식의 대부분은 향상된 검출 한계를 제공하고 방사능 사용을 피할 수 있지만, 각각은 비용, 고정 수지에 대한 의존, 기판 선택의 한계와 같은 단점이 있습니다.

Grc3은 프리 리보소말 RNA,2,3,323의처리에 중추적인 역할을 하는 폴리뉴클레오티드 키나아제이다. Grc3은 사전 리보소말 RNA3의내부 전사 스페이서 2 (ITS2)를 갈라엔엔토리코나클레스 Las1을 갖춘 의무 복합체를 형성한다. ITS2의 골짜기는 Grc3 키나아제3에의해 인광되는 5' 하이드록실을 수용하는 제품을 생성한다. Grc3의 뉴클레오티드 및 기판 특이성을 조사하기 위해서는 상이한 올리고뉴클레오티드 기판의 테스트를 허용한 저렴한 분석이 필요했습니다. 따라서 형광 표지기기판을 이용한 PNK 인산화 분석이 개발되었다. 이 분석체는 Grc3이 인산화균 전송 활동에 대한 NTP를 활용할 수 있지만 ATP24를선호한다는 것을 확인하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 프로토콜은 본래 분석체를 조정하여 그 전 리보소말 RNA 기판(SC-ITS2, 표 1)의RNA 모방에 대한 Grc3의 PNK 활성을 측정한다. 이 형광 기반 접근의 한 가지 도전적인 측면은 효과적으로 인광 및 비인포인화 기판을 해결하기 위해 큰 폴리 아크라이알라미드 젤에 의존하는 것입니다. 이 프로토콜은 이러한 큰 젤을 붓고 그렇게 할 때 일반적인 함정을 피하는 방법에 대한 구체적인 세부 정보를 제공합니다.

RNA로 일하는 것은 저하에 강하게 영향을 받기 쉽기 때문에 특별한 주의가 필요합니다. ribonuclease 오염을 제한하기 위해 취할 수있는 간단한 예방 단계가 있습니다. RNase 억제제 함유 세정제로 쉽게 치료할 수 있는 별도의 RNA 워크스테이션이 종종 도움이 됩니다. 샘플을 취급하고 RNase가없는 인증 소모품을 사용할 때 항상 장갑을 착용해야합니다. 물은 오염의 또 다른 일반적인 소스이기 때문에, 0.22 μm 필터를 사용하여 갓 정제 된 물을 사용하고 모든 솔루션을 살균하는 것이 가장 좋습니다.

프로토콜

1. 준비

  1. 버퍼 및 시약을 준비합니다.
    1. 1M 트리스(pH = 8.0), 염화나트륨 40μL, 염화나트륨 2M의 2.5 μL, 염화마그네슘 2M의 2.5 μL, 50%(v/v) 글리세롤 100μL, RNase 없는 물을 결합하여 1mL의 총 부피량에 도달하여 1x 반응 버퍼를 만듭니다.
    2. 4.8g의 우레아 로딩 염료, 1M 트리의 200 μL(pH = 8.0), 0.5M EDTA(pH = 8.0), 0.5mL의 0.5mL(pH = 8.0), 1%(w/v) 브로모페놀 블루, RNase 프리 워터를 결합하여 총 10mL의 부피량에 도달합니다.
    3. 트리스 베이스 108g, 보릭산 55g, 0.5M EDTA(pH = 8.0) 및 RNase 가 없는 물을 결합하여 10배 TBE 버퍼를 만들어 총 1L의 부피에 도달합니다.
    4. 10% (w/v) 아황산염(APS)을 만드십시오. 무게0.5 g의 APS와 RNase 가 없는 물 3mL를 추가하여 고체를 용해시게 합니다. RNase 가 없는 물을 추가하여 총 5mL에 도달합니다. 튜브를 호일로 감싸고 용액을 4°C로 저장합니다.
      참고: 용해된 APS는 시간이 지남에 따라 부패합니다. 2주마다 10% APS 주식을 교체하십시오.
  2. 폴리뉴클레오티드 키나아제 효소를 얻습니다.
    1. 20 μM의 재고 농도에서 반응 버퍼 (1.1.1 참조)에저장된 순수 Las1-Grc3 PNK 효소 2를 획득하십시오. 저장소 버퍼는 특정 PNK에 따라 달라집니다.
  3. 핵산 기판을 준비합니다.
    참고: 이 프로토콜은 사카로미세스 세레비시아제 사전 리보소말 내부 전사 스페이서 2 (SC-ITS2; 참조 표 1)2,,25,,26에포함 된 Las1-Grc3 처리 사이트 (C2 사이트)를 항구 하는 27 nt RNA 기판의 5'-인포식을 모니터링 합니다.
    1. 화학적으로 3'-형광 라벨과 함께 5'-하이드록실 끝을 포함하는 RNA 올리고뉴클레오티드 기판을 합성한다. 불소는 RNA의 시각화를 위해 사용될 것이다. 형광은 인산화를 대상으로하지 않는 RNA 끝에 위치되어 있는지 확인합니다. 상용 소스에 대한 대안으로서 RNA 기판의 내부 및 말단 형광 라벨링은 비용 효율적인프로토콜(27)을사용하여 사내에서 수행될 수 있다.
    2. HPLC-정제(28)에의한 RNA 라벨링 반응으로부터 과도한 불소호를 제거한다.
    3. RNase 가 없는 물을 사용하여 500 nM으로 리오필화된 RNA를 다시 중단합니다.
    4. 장기 저장을 위해 RNA 알리쿼트 -80°C 또는 단기 저장을 위한 -20°C에 저장하십시오.
  4. ATP 농도 계열을 준비합니다.
    1. 반응 버퍼를 사용하여 ATP의 20mM 작업 재고를 만듭니다(1.1.1 단계 참조). 이 작업 재고를 사용하여 20mMM-0.02 mM에 이르는 4개의 직렬 희석을 생성합니다.
    2. 농도 계열의 첫 희석을 위해 20m ATP 작업 재고의 1 μL을 9 μL의 반응 버퍼와 혼합합니다. 이로 인해 최종 농도가 2mM인 ATP의 10배 희석이 발생합니다.
    3. 1.4.2 단계에서 생성된 2m ATP 스톡을 사용하여 농도 계열에서 다음 희석을 합니다. 반응 버퍼9 μL과 2m ATP 스톡의 1 μL을 혼합합니다. 이것은 0.2 mM의 새로운 ATP 재고 농도를 만들 것입니다.
    4. 9 μL의 반응 버퍼로 이전 ATP 주식의 1 μL을 계속 희석하여 농도 계열에서 후속 ATP 스톡을 만듭니다.

2. 시험관 내 RNA 키나아제 반응

참고: 이 분석은 시간, 뉴클레오티드 수준 또는 효소 농도와 같은 여러 변수를 측정하는 데 사용될 수 있다. 이 실험의 목표는 일정한 Las1-Grc3 복합체 및 다양한 ATP 수준이 있는 인광 RNA의 양을 평가하는 것입니다.

  1. 각 RNA 효소 키나아제 반응에 대해, 500nM RNA 기판의 1 μL, 130nM Las1-Grc3의 8.3 μL, 5mM EDTA의 0.2 μL을 결합한다.
    참고: 여러 반응을 수행하는 경우, RNA 효소 혼합물의 마스터 스톡과 각 반응 튜브에 이 마스터 믹스의 알리쿼트 9.5 μL을 준비한다.
  2. 분석기 시작.
    1. 열 블록을 37°C로 설정합니다.
    2. 10s 간격에서, 하나의 RNA 효소 혼합물과 1.4 단계에서 제조된 ATP 농도 계열로부터 ATP 서브스톡 1개 중 0.5 μL을 혼합하고 37°C 열블록에 반응을 배치한다.
      참고: PNK 음성 제어를 위해 하나의 RNA 효소 혼합물에 ATP 대신 반응 버퍼0.5 μL을 추가합니다. 또 다른 필요한 대조군도 사용한다(즉, PNK 효소가 없는 경우 RNA 기판).
    3. 37°C에서 60분 동안 반응을 배양한다.
      참고: 형광 표지 RNA는 빛에 민감하다; 따라서 호일로 반응을 덮습니다.
    4. 단계 2.2.2와 동일한 순서를 사용하여, 각 반응을 10초마다 담금질하여 10μL의 우레아 적재염으로 반응을 급증시다(1.1.2단계 참조).
      참고: 4M 우레아 이외에, 단백질 효소 K는 효소를 저하시키기 위해 이 단계에서 첨가될 수 있다. 공급 업체가 제공하는 지침을 따라 필요한 프로테아제 양 및 반응 조건을 결정합니다.
    5. 체외 RNA 키나아제 반응을 다운스트림 분석(섹션 3 참조)에 즉시 사용하거나 -20°C에 저장하여 나중에 분석한다.

3. 겔 전기 전광

  1. 아크릴아미드/8M 우레아 젤 용액을 15% 준비합니다.
    주의: 아크릴아미드는 신경독소이기 때문에 신중하게 처리해야 합니다. 항상 장갑, 실험실 코트, 고글을 착용하십시오.
    1. 150mL 유리 비커에서 22.5mL의 premixed 40% 아크릴아미드/비스 아크릴아미드 29:1 용액, 10x TBE6mL(1.1.3참조), 28.8g의 우레아, RNase 가 없는 물을 총 59mL의 부피에 결합한다. 용액을 부드럽게 저어줍니다.
      참고: RNA 기판 길이에 따라 폴리아크릴아미드의 백분율을 변경하면 포인포인및 인광RNA 사이의 해상도가 향상될 수 있다.
    2. 우레아를 녹이려면 전자레인지에 용액을 20초 간 가열하고 액체를 저어서 즉시 용액을 전자레인지에 다시 넣고 20초 간 재보갑니다. 우레아가 완전히 녹을 때까지 용액을 부드럽게 저어줍니다.
    3. 유리 비커를 차가운 물이 들어 있는 얕은 수조에 배치하여 용액을 천천히 식힙니다. 유리 비커를 둘러싼 차가운 물의 수준이 유리 비커 내부의 용액 수준 이상인지 확인하십시오. 이것은 효율적인 열 전달을 촉진할 것입니다. 5분 기다립니다.
      참고: 유리 비커가 따뜻하다고 느끼는 경우 이 프로토콜을 계속 사용하지 마십시오. 물은 25 °C 이하여야합니다. 5분 후에도 여전히 따뜻하다고 느끼면 수조의 물을 신선한 차가운 물로 대체하고 5분 정도 기다립니다.
    4. 0.22 μm 일회용 여과 장치를 사용하여 용액을 걸러내고 탈가스하여 미립자 및 미세한 기포를 제거합니다.
  2. 데니링 젤을 붓습니다.
    1. 비누와 따뜻한 물을 사용하여 31.0cm x 38.5cm의 전체 치수로 젤용으로 설계된 짧고 긴 유리 판을 청소하십시오. 각 유리 접시에 95% 에탄올을 뿌리고 유리를 닦아 습기를 제거합니다.
      참고: 유리 플레이트 샌드위치를 분리할 때 젤의 손상을 방지하기 위해 두 플레이트 중 하나가 실리콘화될 수 있습니다. 그러나, 이 프로토콜은 유리 판을 분리하지 않고 RNA를 시각화하도록 설계되었기 때문에 이 단계는 필요하지 않다.
    2. 긴 유리 판을 상자 위에 수평으로 놓아 벤치탑에서 높이게 됩니다.
      주의: 아크릴아미드는 독성이 있으므로 젤 붓기 스테이션은 유출된 액체를 흡수하고 절차가 완료된 후 즉시 폐백에 넣을 수 있는 벤치 페이퍼로 덮여 있어야 합니다.
    3. 긴 유리 판의 긴 가장자리를 따라 깨끗한 0.4mm 스페이서를 놓습니다.
    4. 긴 접시 위에 짧은 유리 판을 놓고 짧은 플레이트, 긴 접시 및 스페이서의 가장자리가 정렬되었는지 확인합니다. 균일하게 간격이 있는 세 개의 금속 클램프를 사용하여 각 면을 클램프합니다.
    5. 3.1 단계에서 준비된 15% 아크릴아미드/8M 우레아 용액에 TEMED 24 μL을 추가하고 용액을 혼합합니다.
    6. 10%(w/v) APS의 600 μL을 3.2.5단계의 용액에 넣고 용액을 부드럽게 혼합합니다.
    7. 즉시 유리 판 사이에 용액을 붓습니다.
      참고: 거품을 방지하려면 용액이 부어질 때 유리를 누릅니다.
    8. 유리 접시 샌드위치 의 상단에 깨끗한 0.4 mm, 32 잘 빗을 조심스럽게 추가합니다.
    9. 아크릴아미드가 중합할 수 있도록 최소 30분 이내로 허용한다.
  3. 데니링 젤을 실행합니다.
    1. 열 블록을 75°C로 설정합니다.
    2. 유리 판 샌드위치를 함께 들고 금속 클램프를 제거하고 철저하게 세척하고 유리 접시 샌드위치를 건조.
    3. 유리 판 샌드위치를 젤 장치에 넣고 짧은 접시를 안쪽으로 향합니다.
    4. 10x TBE 100mL100mL과 1.9L RNase 프리 워터를 결합하여 0.5배 TBE 러닝 버퍼를 준비하십시오. 젤 장치의 상부 및 하부 챔버에 실행 버퍼의 600 mL을 추가합니다.
    5. 빗을 부드럽게 제거하고 주사기를 사용하여 우물을 완전히 헹요.
      참고: 이 단계는 우물에서 요소를 제거하는 데 중요합니다.
    6. 50W. 전압에서 30 분 동안 젤을 미리 실행하면 약 2,000 V입니다.
      주의: 이 젤 장치는 높은 와트에서 작동하며 사용자는 예방 조치를 취해야합니다.
    7. 주사기를 사용하여 우물을 철저히 헹신다.
      참고: 이 단계는 샘플을 우물에 적재하는 데에도 중요합니다.
    8. 펄스는 2.2.5 단계에서 담금질 된 반응을 회전시합니다. 그런 다음 튜브를 75°C에서 3분 동안 배양합니다. 펄스 스핀을 반복합니다.
    9. 즉시 우물 당 샘플 의 10 μL을로드하고 50 W에서 3 시간 동안 젤을 실행합니다.
      참고: 형광 표지 RNA는 빛에 민감하다; 따라서, 호일로 젤 장치를 덮는다.
  4. 데니링 젤을 이미지합니다.
    1. 전원 공급 장치를 끄고 젤 장치의 상부 챔버를 배출하십시오.
    2. 비누와 물을 사용하여 유리 접시 샌드위치의 바깥쪽을 씻고 건조시다. 젤을 운반하는 동안 호일로 유리 접시 샌드위치를 덮습니다.
    3. 정량적이고 민감한 형광 검출이 가능한 레이저 스캐너의 무대에 유리 플레이트 샌드위치를 장착합니다.
      참고: 이 젤은 최대 해상도를 위해 매우 얇습니다. 이러한 이유로, 이러한 프로토콜은 유리 판을 통해 형광 표지 RNA를 직접 시각화하여 유리 플레이트 샌드위치로부터 젤을 제거하는 어려움을 피하도록 설계되었습니다. 시판되는 저형광 유리 플레이트를 사용하면 신호 대 잡음 비율을 개선하여 캡처된 신호를 증가시킬 것입니다.
    4. 원하는 불소에 대한 레이저 스캐너의 흥분 및 방출 파장을 설정합니다.
      참고: 최적의 흥분 및 방출 파장이 특정 형광에 대해 다를 수 있습니다. FAM 불소의 경우, 여기와 방출 파장은 각각 495 nm와 535 nm입니다.
    5. 레이저 스캐너 스테이지에서 시각화할 영역을 정의하고 제조업체의 지침에 따라 젤을 이미지화한다(도1).

4. 이미지 분석 및 신호 정량화

  1. 3.4.5 단계에서 획득한 디지털 젤 이미지를 이미지 프로세싱 소프트웨어에 로드합니다(재료 표참조).
  2. 마우스의 왼쪽 단추를 사용하여 사각형을 클릭하고 드래그하여 템플릿 상자를 정의하여 각 RNA 대역을 정량화하는 데 사용되는 디지털 젤 이미지의 경계를 표시합니다. PNK 효소의 부재에서 설정된 반응 혼합물에서 본 RNA 밴드는 일반적으로 이러한 템플릿을 생성하는 좋은 밴드이다.
    참고: 배경 신호로 인한 편견을 피하기 위해 측정되는 각 RNA 대역을 둘러싼 영역이 동일하다는 것이 중요합니다. 이러한 이유로 동일한 템플릿 상자를 사용하여 각 RNA 대역을 바칩니다.
  3. "도구"에서 ROITools관리자를 열고 "추가"를 클릭하여 템플릿 상자의 위치를표시합니다.
    참고: 수량 프로그램은 소프트웨어 사용자 설명서에 따라 상자를 자동으로 그릴 수도 있습니다.
  4. 마우스의 왼쪽 단추를 사용하여 템플릿 상자를 다음 RNA 대역으로 클릭하고 드래그하고 4.3 단계를 반복합니다. 각 반응에서 모든 unphosphorylated 및 인포이트 RNA 대역의 위치가 표시 될 때까지이 과정을 연속.
  5. ROI 관리자에서"측정"을클릭하여 각 상자 내의 통합 밀도를 측정합니다.
  6. 반응에서 인광RNA의 상대적 양을 계산하기 위해, 인광RNA 대역의 통합 밀도를 동일한 반응으로부터 인광 및 인광RNA 대역의 통합 밀도의 합으로 나눕니다. 이 접근법은 또한 비인포성 RNA의 상대적 양을 계산하기 위하여 적용될 수 있습니다.
  7. ATP 농도 계열을 통해 인광성 RNA 기판의 응고량 및 인광RNA 기판의 축적을 시각화하기 위해 ATP 농도에 대해 4.6 단계에서 계산된 상대적 양의 RNA를 플롯한다.

결과

Las1-Grc3 복합체의 고정된 양을 가진 ATP의 적정의 성공적인 대표적인 데스팅 젤이 도 1에도시된다. 효소의 첨가는 SC-ITS2 RNA 기판의 Las1 매개 RNA 분열의 결과로, 정의된 RNA 단편(5-OH C2 RNA)으로 이끌어 냈다. ATP의 첨가 시, C2 RNA 단편은 Grc3 PNK(5-P C2 RNA)에 의해 인포화되었다. 겔을 데스팅하는 데 인은 포인화 된 RNA가 비인포인화 대응보다 빠르게 이동합니다....

토론

설명된 것은 형광표지 뉴클레오티드 기판에 Grc3 PNK의 키나아제 활성을 측정하는 분석이다. 이 프로토콜은 반응 버퍼 및 올리고뉴클레오티드 기판을 적응시킴으로써 다른 PNK 효소를 특성화하기 위해 적용될 수 있다. 예를 들어 프로토콜은 미량의 EDTA를 요구합니다. EDTA의 첨가는 두 가지 이유로 유익합니다: 첫째, 이 접근법은 효소가 혼합물에 있는 오염 금속의 미량에 결합하는 것을 방지해서 마?...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

앤드류 시케마 박사와 안드레아 카민스키 박사에게 이 원고를 비판적으로 읽어주신 것에 감사드립니다. 이 작품은 미국 국립 보건 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다; 미국 국립 환경 보건 과학 연구소 (NIEHS; ZIA ES103247 - R.E.S) 및 캐나다 보건 연구소 (CIHR; 146626 ~ M.C.P).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4 mm 34-well combBioRad1653848
0.4 mm spacerBioRad1653812
0.5 M EDTA ph 8.0KD MedicalRGF-3130
1M Magnesium ChlorideKD MedicalCAC-5290
1M Tris pH 8.0KD MedicalRGF-3360
40% Acrylamide/Bis Solution 29:1BioRad1610146
5M Sodium ChlorideKD MedicalRGF-3720
ammonium persulfate (APS)BioRad161-0700
ATPSigmaA2383-1G
boric acidSigmaB0394
bromophenol blue sodium saltSigmaB5525-5G
Glass PlatesThomas Scientific1188K51
Hoefer SQ3 SequencerHoeferN/A
Image J SoftwareN/AN/Ahttps://imagej.nih.gov/ij/
Labeled RNA oligonucleotidesIDTCustom Order
Pharmacia EPS 3500 Power SupplyPharmaciaN/A
Steriflip 0. 22 um FilterMillipore5FCP00525
TEMEDBioRad161-0800
tris baseSigmaTRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gel imagerGE HealthcareN/A
Ultra Pure DEPC WaterInvitrogen750023
Ultra Pure GlycerolInvitrogen19E1056865
ureaFisher ChemicalU15-500

참고문헌

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