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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive un saggio nonradioattivo per misurare l'attività della chinasi delle chinasi polinucleotide (PNKs) su piccoli substrati di DNA e RNA.

Abstract

Le chinasi polinucleotide (PNK) sono enzimi che catalizzare la fosforilazione dell'estremità idrossile 5' del DNA e dell'RNA oligonucleotidi. L'attività dei PNK può essere quantificata utilizzando approcci diretti o indiretti. Qui è presentato un approccio diretto in vitro per misurare l'attività PNK che si basa su un substrato oligonucleotide etichettato fluorescente e elettroforesi gel poliacrilammide. Questo approccio fornisce la risoluzione dei prodotti fosforilati evitando l'uso di substrati con etichettatura radio. Il protocollo descrive in dettaglio come impostare la reazione di fosforilazione, preparare ed eseguire grandi gel di poliacrilammide e quantificare i prodotti di reazione. La parte più tecnicamente impegnativa di questo saggio è versare ed eseguire i grandi gel di poliacrilammide; vengono quindi forniti dettagli importanti per superare le difficoltà comuni. Questo protocollo è stato ottimizzato per Grc3, un PNK che si assembla in un complesso di elaborazione dell'RNA pre-ribosomico obbligatorio con il suo partner vincolante, il nucleasi Las1. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato per misurare l'attività di altri enzimi PNK. Inoltre, questo saggio può anche essere modificato per determinare gli effetti di diversi componenti della reazione, come il triphosfato nucleoside, gli ioni metallici e gli oligonucleotidi.

Introduzione

Le chinasi polinucleotide (PNK) svolgono un ruolo fondamentale in molti percorsi di elaborazione del DNA e dell'RNA, come la riparazione del DNA e l'assemblaggio delribosoide 1,2,3,4,5. Questi enzimi fondamentali catalizzano il trasferimento del monofosfato terminale (gamma) da un triphosfato nucleoside (NTP, il più delle volte ATP) all'estremità idrossile da 5' di un substrato nucleotide. Uno dei PNK più caratterizzati è il batteriofago T4 PNK, che ha un'ampia specificità del substrato ed è fortemente utilizzato dai laboratori di biologia molecolare per incorporare etichette di isotopi radioattivi sul 5 capolinea di un sottostrato DNA o RNA6,7,8,9,10,11,12. Un altro esempio di enzima PNK è CLP1, che si trova in Eukarya, Eubacteria e Archaea, ed è implicato in diversi percorsi di elaborazione dell'RNA4,13,14,15.

Storicamente, la maggior parte dei saggi che misurano l'attività della chinasi polinucleotide dipendono dall'etichettatura degli isotopi radioattivi e dalla successiva autoradiografia5,16. Negli ultimi anni sono stati sviluppati una serie di analisi aggiuntive per misurare l'attività PNK, tra cui approcci a singola molecola, elettroforesi microchip, fari molecolari, così come saggi colorimetrici e a base di luminescenza17,18,19,20,21,22. Mentre molti di questi nuovi approcci forniscono limiti di rilevamento avanzati ed evitano l'uso della radioattività, ognuno presenta svantaggi, come il costo, la dipendenza dalla resina immobilizzata e le limitazioni nella scelta del substrato.

Grc3 è una chinasi polinucleotide che svolge un ruolo fondamentale nella lavorazione dell'RNA pre-ribosomico2,3,23. Grc3 forma un complesso obbligato con l'endoribonuclease Las1, che fasi la Spacer 2 (ITS2) interna trascritta dell'RNA pre-ribosomico3. Cleavage dell'ITS2 di Las1 genera un prodotto che ospita un idrossilo da 5' che viene successivamente fosforilato dalla chinasi Grc33. Per studiare la specificità nucleotide e substrato di Grc3, è stato necessario un saggio economico che permettesse di testare diversi substrati di oligonucleotide. Pertanto, è stato sviluppato un saggio di fosforilazione PNK utilizzando substrati con etichetta fluorescente. Questo saggio è stato utilizzato con successo per determinare che Grc3 può utilizzare qualsiasi NTP per l'attività di trasferimento del fosforile, ma favorisce ATP24. Questo protocollo adatta il saggio originale per misurare l'attività PNK di Grc3 su un RNA che imita il suo substrato di RNA pre-ribosomico (SC-ITS2, Tabella 1). Un aspetto impegnativo di questo approccio basato sulla fluorescenza è la dipendenza da grandi gel poliacrilammide per risolvere efficacemente i substrati fosforilati e non fosforilati. Il protocollo fornisce dettagli specifici su come versare questi grandi gel ed evitare insidie comuni quando si fa.

Lavorare con l'RNA richiede particolare attenzione perché è fortemente suscettibile alla degradazione. Ci sono semplici misure preventive che si possono adottare per limitare la contaminazione da ribonucleasi. Una postazione di lavoro RNA separata che può essere facilmente trattata con un agente di pulizia contenente inibitori RNase è spesso utile. È necessario indossare sempre i guanti durante la manipolazione dei campioni e l'uso di consumabili certificati senza RNase. Poiché l'acqua è un'altra fonte comune di contaminazione, è meglio usare acqua appena purificata e sterilizzare tutte le soluzioni utilizzando un filtro da 0,22 m.

Protocollo

1. Preparazione

  1. Preparare buffer e reagenti.
    1. Fare 1x Buffer di reazione combinando 20 L di 1 M Tris (pH - 8,0), 40 L di cloruro di sodio 5 M, 2,5 L di 2 M di cloruro di magnesio, 100 L del 50% (v/v) glicerolo e acqua senza RNase per raggiungere un volume totale di 1 mL.
    2. Fare il colorante di carico dell'urea combinando 4,8 g di urea, 200 L di 1 M Tris (pH - 8,0), 20 L di 0,5 M EDTA (pH - 8,0), 0,5 mL dell'1% (w/v) di blu bromofenolo e acqua senza RNase per raggiungere un volume totale di 10 mL.
    3. Fare 10x TBE buffer combinando 108 g di base Tris, 55 g di acido borico, 40 mL di 0,5 M EDTA (pH - 8,0) e acqua libera da RNase per raggiungere un volume totale di 1 L.
    4. Fare 10% (w/v) persulfato di ammonio (APS). Pesare 0,5 g di APS e aggiungere 3 mL di acqua senza RNase per sciogliere il solido. Aggiungere acqua senza RNase per raggiungere un volume totale di 5 mL. Avvolgere il tubo in un foglio e conservare la soluzione a 4 gradi centigradi.
      NOTA: L'APS disciolto decade nel tempo. Sostituire il 10% di stock APS ogni 2 settimane.
  2. Ottenere l'enzima chinasi polinucleotide.
    1. Acquisire l'enzima las1-Grc3 PNKpuro 2 immagazzinato nel buffer di reazione (c'è il punto 1.1.1) in una concentrazione di magazzino di 20 M. Il buffer di archiviazione varia a seconda del PNK specifico.
  3. Preparare il substrato acido nucleico.
    NOTA: questo protocollo monitora 5'-fosforilazione di un substrato di RNA da 27 nt che ospita il sito di elaborazione Las1-Grc3 (sito C2) contenuto all'interno del distanziale interno pre-ribosomale 2 (SC-ITS2; vedi Tabella 1)2,25,26.
    1. Sintetizzare chimicamente un substrato di oligonucleotide all'RNA contenente un'estremità 5'-idrossile insieme a un'etichetta a fluorescente da 3'. Il fluoroforo verrà utilizzato per la visualizzazione dell'RNA. Assicurarsi che il fluoroforo sia posizionato sull'estremità dell'RNA non mirata alla fosforilazione. In alternativa alle fonti commerciali, l'etichettatura fluorescente interna e terminale dei substrati di RNA può essere eseguita in-house utilizzando protocolli convenienti27.
    2. Rimuovere il fluorforo in eccesso dalla reazione di etichettatura dell'RNA da HPLC-purificazione28.
    3. Rispendere l'RNA lyophilized utilizzando acqua senza RNase a 500 nM.
    4. Conservare gli aliquots di RNA a -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine o a -20 gradi centigradi per lo stoccaggio a breve termine.
  4. Preparare la serie di concentrazione ATP.
    1. Creare un materiale di lavoro di 20 mM di ATP utilizzando Reaction Buffer (vedere il passaggio 1.1.1). Utilizzare questo magazzino di lavoro per generare quattro diluizioni seriali che vanno da 20 mM-0,02 mM.
    2. Per effettuare la prima diluizione della serie di concentrazione, mescolare 1 L del magazzino di lavoro ATP da 20 mM con 9 L di Buffer di reazione. Questo si tradurrà in una diluizione 10 volte dell'ATP con una concentrazione finale di 2 mM.
    3. Utilizzare il titolo ATP da 2 mM generato nel passaggio 1.4.2 per effettuare la diluizione successiva nella serie di concentrazione. Miscela 1 L del titolo ATP da 2 mM con 9 L di Buffer di reazione. Questo farà una nuova concentrazione di stock ATP di 0,2 mM.
    4. Continuare a diluire 1 L del precedente titolo ATP con 9 L di Reaction Buffer per rendere il successivo stock ATP nella serie di concentrazione.

2. Reazione di chinasi dell'RNA in vitro

NOTA: Questo saggio può essere utilizzato per misurare diverse variabili come il tempo, i livelli di nucleotidi o la concentrazione di enzimi. L'obiettivo di questo esperimento è quello di valutare la quantità di RNA fosforilato in presenza di costanti livelli di ATP complessi Las1-Grc3 e diversi.

  1. Per ogni reazione di chinasi RNA-enzimatica, combinare 1 L di substrato RNA 500 nM, 8,3 L di 130 nM Las1-Grc3 e 0,2 L di 5 mM EDTA.
    NOTA: Se si effettuano diverse reazioni, preparare uno stock master della miscela RNA-enzima e aliquot 9,5 L di questo mix master per ogni tubo di reazione.
  2. Inizia il saggio.
    1. Impostare il blocco di calore a 37 gradi centigradi.
    2. A intervalli di 10 s, mescolare 0,5 L di un sottosoccante ATP della serie di concentrazione ATP preparato al punto 1.4 con una miscela RNA-enzima e posizionare la reazione nel blocco di calore di 37 gradi centigradi.
      NOTA: Aggiungere 0,5 L di Buffer di reazione invece di ATP a una miscela RNA-enzima per un controllo negativo PNK. Utilizzare anche un altro controllo necessario (cioè il substrato dell'RNA in assenza di enzima PNK).
    3. Incubare le reazioni per 60 min a 37 gradi centigradi.
      NOTA: L'RNA con etichetta fluorescente è sensibile alla luce; quindi, coprire le reazioni con un foglio.
    4. Utilizzando lo stesso ordine del punto 2.2.2, spegnete ogni reazione ogni 10 s con il richiamo della reazione con 10 L di colorante di carico dell'urea (c'è il punto 1.1.2).
      NOTA: Oltre all'urea 4 M, a questo passaggio può essere aggiunta la proteinasi K per degradare l'enzima. Seguire le istruzioni fornite dal fornitore per determinare l'importo della proteasi richiesto e le condizioni di reazione.
    5. Utilizzare immediatamente le reazioni di chinasi dell'RNA in vitro per l'analisi a valle (vedere la sezione 3) o per conservarlo a -20 gradi centigradi per essere analizzato in un secondo momento.

3. Elettroforesi gel

  1. Preparare la soluzione di gel di urea 15% acrilammide/8 M.
    CAUTION: L'acrilammide deve essere maneggiata con cura, perché è una neurotossina. Indossare sempre guanti, un camice da laboratorio e occhiali da gioco quando lo si maneggiano.
    1. In un bicchiere da 150 mL, unire 22,5 mL di acrylammide/bis-acrylamide 29:1, 6 mL di 10x TBE (vedi punto 1.1.3), 28,8 g di urea e acqua senza RNase ad un volume totale di 59 mL. Mescolare delicatamente la soluzione.
      NOTA: A seconda della lunghezza del substrato dell'RNA, alterare la percentuale di poliacrilammide può migliorare la risoluzione tra RNA non fosforilato e fosforilato.
    2. Per sciogliere l'urea, scaldare la soluzione nel forno a microonde per 20 s, mescolare il liquido e posizionare immediatamente la soluzione nel forno a microonde per altri 20 s. Mescolare delicatamente la soluzione fino a quando l'urea si scioglie completamente.
    3. Raffreddare lentamente la soluzione mettendo il bicchiere di vetro in un bagno d'acqua poco profondo contenente acqua fredda. Assicurarsi che il livello di acqua fredda che circonda il bicchiere di vetro sia al di sopra del livello di soluzione all'interno del bicchiere di vetro. Ciò promuoverà un trasferimento di calore efficiente. Attendere 5 min.
      NOTA: Non continuare con questo protocollo se il bicchiere di vetro si sente caldo; l'acqua deve essere al di sotto dei 25 gradi centigradi. Se si sente ancora caldo dopo 5 minuti, quindi sostituire l'acqua nel bagno d'acqua con acqua fredda fresca e attendere altri 5 minuti.
    4. Filtrare e degasre la soluzione utilizzando un'unità di filtrazione usa e getta da 0,22 m per rimuovere il particolato e le bolle d'aria microscopiche.
  2. Versare il gel denaturing.
    1. Utilizzare sapone e acqua tiepida per pulire una lastra di vetro corta e lunga progettata per gel con dimensioni complessive di 31,0 cm x 38,5 cm. Spruzzare ogni lastra di vetro con il 95% di etanolo e pulire il vetro per rimuovere l'umidità.
      NOTA: Una delle due piastre può essere siliconizzata per evitare danni al gel quando si separa il panino con la piastra di vetro. Tuttavia, questo passaggio non è necessario perché questo protocollo è progettato per visualizzare l'RNA senza separare le lastre di vetro.
    2. Posizionare la lunga lastra di vetro orizzontalmente sopra una scatola in modo che sia elevata dal piano della panca.
      CAUTION: L'acrilammide è tossica, quindi la stazione di versamento di gel deve essere coperta in carta da banco in grado di assorbire qualsiasi liquido versato ed essere immediatamente collocata in un sacchetto di rifiuti dopo che la procedura è stata completata.
    3. Posizionare un distanziale pulito di 0,4 mm lungo i lunghi bordi della lunga lastra di vetro.
    4. Disporre la piastra di vetro corta in cima alla piastra lunga e assicurarsi che i bordi della piastra corta, la piastra lunga e i distanziatori siano allineati. Bloccare ogni lato utilizzando tre morsetti metallici estasiati uniformemente.
    5. Aggiungere 24 L di TEMED alla soluzione di acrilammide 15%/8 M urea preparata al punto 3.1 e mescolare la soluzione.
    6. Aggiungere 600 L del 10% (w/v) APS (vedere il punto 1.1.4) alla soluzione nel passaggio 3.2.5 e mescolare delicatamente la soluzione.
    7. Versare immediatamente la soluzione tra le lastre di vetro.
      NOTA: Per evitare le bolle, toccare il vetro mentre la soluzione viene versata.
    8. Aggiungere con cura un pettine pulito, 0,4 mm, 32 ben sulla parte superiore del panino alla piastra di vetro.
    9. Lasciare un minimo di 30 min per l'acrilammide di polimerizzare.
  3. Eseguire il gel denaturing.
    1. Impostare il blocco di calore a 75 gradi centigradi.
    2. Rimuovere i morsetti metallici che tengono insieme il panino con la piastra di vetro e lavare accuratamente e asciugare il panino con piastra di vetro.
    3. Inserire il panino in vetro nell'apparato gel con la piastra corta rivolta verso l'interno.
    4. Preparare il buffer di esecuzione TBE 0,5x combinando 100 mL di 10x TBE con acqua libera da 1,9 L RNase. Aggiungere 600 mL del buffer di corsa alle camere superiore e inferiore dell'apparato gel.
    5. Rimuovere delicatamente il pettine e sciacquare accuratamente i pozzetti con una siringa.
      NOTA: Questo passaggio è fondamentale per rimuovere l'urea dai pozzetti.
    6. Pre-eseguire il gel per 30 min a 50 W. Voltage è di circa 2.000 V.
      CAUTION: Questo apparato gel funziona ad un alto wattaggio e gli utenti dovrebbero mostrare precauzione.
    7. Sciacquare accuratamente i pozzetti con una siringa.
      NOTA: Questo passaggio è fondamentale anche per il caricamento del campione nei pozzetti.
    8. L'impulso ruota le reazioni dissezionate dal punto 2.2.5. Quindi incubare i tubi a 75 gradi centigradi per 3 min. Ripetere il giro dell'impulso.
    9. Caricare immediatamente 10 L di campione per pozzo ed eseguire il gel per 3 h a 50 W.
      NOTA: L'RNA con etichetta fluorescente è sensibile alla luce; quindi, coprire l'apparato gel con lamina.
  4. Immagine del gel denaturante.
    1. Spegnere l'alimentazione e drenare la camera superiore dell'apparato gel.
    2. Lavare e asciugare il lato esterno del panino alla piastra di vetro con acqua e sapone. Coprire il panino con lastra di vetro con un foglio durante il trasporto del gel.
    3. Montare il panino a lastra di vetro sul palco di uno scanner laser in grado di rilevare la fluorescenza quantitativa e sensibile.
      NOTA: Questo gel è estremamente sottile per la massima risoluzione. Per questo motivo, questo protocollo è progettato per evitare le difficoltà di rimuovere il gel dal panino lastra di vetro visualizzando direttamente l'RNA etichettato fluorescente attraverso le lastre di vetro. L'uso di lastre di vetro a bassa fluorescenza disponibili in mercato aumenterà il segnale catturato migliorando il rapporto segnale-rumore.
    4. Impostare le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione dello scanner laser per il fluorforo desiderato.
      NOTA: Le lunghezze d'onda ottimali per l'eccitazione e l'emissione possono differire per fluorofori specifici. Per il fluorforo FAM, le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione sono rispettivamente di 495 nm e 535 nm.
    5. Definire l'area da visualizzare sullo stage dello scanner laser e selezionare il gel in base alle istruzioni del produttore (Figura 1).

4. Analisi delle immagini e quantificazione del segnale

  1. Caricare l'immagine digitale acquisita al punto 3.4.5 nel software di procesing delle immagini (vedere Tabella dei materiali).
  2. Utilizzando il pulsante sinistro del mouse, fare clic e trascinare un rettangolo per definire una casella modello per contrassegnare i contorni dell'immagine gel digitale che verrà utilizzata per quantificare ogni banda di RNA. La banda di RNA vista nella miscela di reazione impostata in assenza di enzima PNK è di solito una buona banda per generare questo modello.
    NOTA: Per evitare la distorsione causata dal segnale di fondo, è fondamentale che l'area che circonda ogni banda di RNA misurata sia identica. Per questo motivo, è meglio usare la stessa casella modello per delimitare ogni banda di RNA.
  3. Aprire Gestione ROI in "Strumenti" e contrassegnare la posizione della casella del modello facendo clic su "Aggiungi".
    NOTA: i programmi di quantificazione possono anche disegnare automaticamente le caselle seguendo il manuale dell'utente del software.
  4. Utilizzando il pulsante sinistro del mouse, fare clic e trascinare la casella del modello sulla banda RNA successiva e ripetere il passaggio 4.3. Continuare questo processo fino a quando non è stata contrassegnata la posizione di tutte le bande di RNA non fosforilate e fosforilate in ogni reazione.
  5. Misurare la densità integrata all'interno di ogni casella facendo clicsu" Misura " in Gestione ROI.
  6. Per calcolare la quantità relativa di RNA fosforilato in una reazione, dividere la densità integrata della banda di RNA fosforiata per la somma delle densità integrate delle bande di RNA non fosforilate e fosforilate dalla stessa reazione. Questo approccio può essere applicato anche per calcolare la quantità relativa di RNA non fosforilato.
  7. Per visualizzare l'accumulo di prodotto fosforilato dell'RNA e il corrispondente esaurimento del substrato di RNA non fosforilato nella serie di concentrazioni ATP, tracciare la quantità relativa di RNA calcolata al punto 4.6 rispetto alla concentrazione di ATP.

Risultati

Nella Figura 1è illustrato un gel rappresentativo di successo di una titolazione di ATP con una quantità fissa di complesso Las1-Grc3 . L'aggiunta dell'enzima ha portato alla scissione dell'RNA mediata da Las1 del substrato di RNA SC-ITS2, portando a un frammento di RNA definito (5-OH C2 RNA). Dopo l'aggiunta di ATP, il frammento di RNA C2 è stato fosforilato da Grc3 PNK (5-P C2 RNA). Nei gel denaturing l'RNA fosforilato migra più velocemente della sua co...

Discussione

Descritto è un saggio per misurare l'attività della chinasi di Grc3 PNK su substrati nucleotidi etichettati fluorescentemente. Questo protocollo può essere applicato per caratterizzare altri enzimi PNK adattando il buffer di reazione e il substrato di oligonucleotide. Ad esempio, il protocollo richiede una quantità di traccia di EDTA. L'aggiunta di EDTA è vantaggiosa per due motivi: in primo luogo, questo approccio favorisce Grc3 legato al magnesio impedendo all'enzima di legarsi alla traccia di tracce di metalli co...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo il Dr. Andrew Sikkema e Andrea Kaminski per la loro lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health Intramural Research Program degli Stati Uniti; Istituto Nazionale delle Scienze della Salute Ambientale degli Stati Uniti (NIEHS; ES103247 a R.E.S) e i Canadian Institutes of Health Research (CIHR; da 146626 a M.C.P).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4 mm 34-well combBioRad1653848
0.4 mm spacerBioRad1653812
0.5 M EDTA ph 8.0KD MedicalRGF-3130
1M Magnesium ChlorideKD MedicalCAC-5290
1M Tris pH 8.0KD MedicalRGF-3360
40% Acrylamide/Bis Solution 29:1BioRad1610146
5M Sodium ChlorideKD MedicalRGF-3720
ammonium persulfate (APS)BioRad161-0700
ATPSigmaA2383-1G
boric acidSigmaB0394
bromophenol blue sodium saltSigmaB5525-5G
Glass PlatesThomas Scientific1188K51
Hoefer SQ3 SequencerHoeferN/A
Image J SoftwareN/AN/Ahttps://imagej.nih.gov/ij/
Labeled RNA oligonucleotidesIDTCustom Order
Pharmacia EPS 3500 Power SupplyPharmaciaN/A
Steriflip 0. 22 um FilterMillipore5FCP00525
TEMEDBioRad161-0800
tris baseSigmaTRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gel imagerGE HealthcareN/A
Ultra Pure DEPC WaterInvitrogen750023
Ultra Pure GlycerolInvitrogen19E1056865
ureaFisher ChemicalU15-500

Riferimenti

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