Quantification des distributions de zone d’adhérence cellule-substrat et de forme cellulaire dans les monocouches cellulaires MCF7

Résumé

L’article décrit la quantification de 1) la taille et le nombre d’adhérences focales et 2) l’indice de forme cellulaire et sa distribution à partir d’images confocales des monocouches confluentes des cellules MCF7.

Résumé

Les méthodes présentées ici quantifient certains paramètres des monocouches de cellules adhérentes confluentes à partir de multiples images confocales correctement tachées : adhérence au substrat en fonction du nombre et de la taille des adhérences focales, et de la forme cellulaire, caractérisée par l’indice de forme cellulaire et d’autres descripteurs de forme. Les adhérences focales ont été visualisées par la coloration de paxilline et les bordures de cellules-cellules ont été marquées par la plakoglobine de jonction et l’actine. Les méthodes de culture cellulaire et de coloration étaient standard; les images représentent des plans focals uniques; l’analyse d’image a été effectuée à l’aide d’un logiciel de traitement d’images accessible au public. Les protocoles présentés sont utilisés pour quantifier le nombre et la taille des adhérences focales et les différences dans la distribution de la forme cellulaire dans les monocouches, mais ils peuvent être réutilisés pour la quantification de la taille et de la forme de toute autre structure cellulaire distincte qui peut être tachée (p. ex., mitochondries ou noyaux). L’évaluation de ces paramètres est importante dans la caractérisation des forces dynamiques dans la couche cellulaire adhérente, y compris l’adhérence cellulaire et la contractilité de l’actomyosine qui affecte la forme cellulaire.

Introduction

Les monocouches épithéliales de cellules agissent comme un collectif dans lequel l’adhérence cellule-cellule et cellule-substrat ainsi que les forces contractiles et les tensions représentent des paramètres importants et leur juste équilibre contribue à l’intégrité globale de l’unité^1,2,3. Ainsi, l’évaluation de ces paramètres représente un moyen d’établir l’état actuel de la couche cellulaire.

Les deux méthodes décrites ici représentent une analyse bidimensionnelle des monocouches confluentes des cellules épithéliales adhérentes (dans ce cas mcf7 ligne cellulaire de cancer du sein). L’analyse est effectuée à l’aide d’images confocales (seules tranches de Z) provenant de différentes régions de l’axe Z; région basale près d’un substrat pour les mesures d’adhérence focale (FA) et la région apicale pour les mesures de la forme cellulaire. Les méthodes présentées sont relativement simples et nécessitent des techniques de laboratoire standard et des logiciels open-source. La microscopie confocale est suffisante pour ce protocole, de sorte qu’elle peut être effectuée sans employer plus spécialisée tirf (total internal reflection Fluorescence) microscopie. Ainsi, le protocole pourrait être mis en œuvre dans un cadre de laboratoire relativement standard. Bien que l’exactitude des méthodes soit limitée, elles peuvent distinguer les différences de base dans l’adhérence focale et la forme cellulaire.

Les deux méthodes décrites ici consistent en les procédures expérimentales standard telles que la culture cellulaire, l’immunostaining, l’imagerie confocale et l’analyse d’image effectuées à l’aide de ImageJ. Toutefois, tout logiciel de traitement d’image avec les fonctions appropriées peut être utilisé. Les méthodes présentées peuvent suivre et comparer les changements subis par le traitement pharmacologique ou la modification génétique minimale. L’obtention de valeurs précises n’est pas recommandée, en raison de la précision limitée de ces méthodes. Deux macros automatisées ont été incluses, afin de faciliter la mesure de nombreuses images.

Protocole

1. Étapes préparatoires

1. Ensemencement cellulaire pour obtenir des monocouches confluentes
   1. Avant l’ensemencement, enduisez les puits d’une lame de chambre de 4 puits de collagène I (ou d’un autre composant ECM de choix). Pour le revêtement de collagène I, suivez un protocole commercial : https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html à une concentration de 8 μg/cm².
   2. Ensemencez 400 000 cellules dans un puits d’une lame de chambre de 4 puits.
   3. Culture les cellules pendant 24 h (ou plus, selon les critères d’évaluation expérimentaux) avant la coloration, dans un incubateur à 37 °C, 5% CO₂. Cette étape permet une maturation des contacts cellule-cellule et la formation de monocouches.
   4. Utilisez un microscope optique inversé pour vérifier la confluence (environ 90% est nécessaire) et une condition générale des monocouches. Ne procédez pas si les cellules flottent ou ont l’air stressées.
2. Coloration immunofluorescente
   REMARQUE : Les cellules peuvent être tachées d’un protocole de choix. Ici, l’immunofluorescence a été effectuée comme précédemment décrit⁴.
   1. Pour l’analyse focale de l’adhérence, tachez les cellules avec une protéine d’adhérence focale de choix (dans ce protocole paxilline). Pour la tache d’analyse de forme cellulaire avec la protéine de jonction cellule-cellule de choix (dans ce protocole de la plakoglobine de protéine desmosomale).
   2. Pour la procédure, utilisez 0,5 mL de solutions spécifiées, sauf indication contraire.
   3. Fixer les cellules dans 4% de formaldéhyde dans PBS pendant 30 min sur la glace.
   4. Incuber avec 0,1 M de chlorure d’ammonium (en PBS) pendant 10 min pour étancher l’autofluorescence.
   5. Ajouter 0,5% Triton X-100 (en PBS) pendant 30 min (permeabilisation).
   6. Bloc avec 5% de lait (ou 1% BSA) dans TBS-T pendant 1 h.
   7. Incuber avec anticorps primaire à 4 °C pendant la nuit (anti-paxilline: lapin, 1:250, anti-plakoglobine: lapin, 1:400)
   8. Incuber avec un anticorps secondaire pendant 30 min (Alexa Fluor 594 chèvre anti-lapin, 1:500, 1:500)
   9. Tache avec 300 nM DAPI pendant 1-5 min, protégé de la lumière.
      REMARQUE : Éventuellement, des colorations supplémentaires d’actine avec des conjugués fluorescents de phalloïdin (conc. 1:400) peuvent être effectuées; la phalloïdine doit être ajoutée à la même étape que l’anticorps secondaire.
3. Imagerie confocale
   1. Prenez des images de tranches Z simples à l’aide d’un microscope confocal (p. ex., Zeiss LSM800).
      REMARQUE : La coloration optionnelle de l’actine peut aider à évaluer le plan focal approprié. La coloration corticale de l’actine est présente dans la région apicale tandis que les fibres de stress actine sont présentes dans la région basale, près du substrat, comme illustré sur la figure 1.
   2. Imagerie d’adhérence focale
      1. Choisissez des tranches de Z pour l’analyse de l’adhérence focale de la région basale, près du substrat.
      2. Utilisez un objectif avec l’ouverture numérique la plus élevée disponible (préférable 63x N.A.: 1.4).
         NOTE: La forme de FA est très spécifique et facilement reconnaissable. Ainsi, il est recommandé de commencer l’analyse à partir d’un plan focal sous les cellules, puis de scanner lentement vers eux, jusqu’à ce que les FA soient clairement visibles. L’analyse d’image sera plus précise à partir de petits champs de vision, qui ont tendance à être plus uniformes, mais cela implique que moins de cellules seront calculées dans un seul champ de vision.
   3. Imagerie des contacts cellule
      1. Utilisez un objectif 40x ou 63x.
      2. Sélectionnez les canaux de coloration nucléaire et la coloration des protéines de jonction préférée.
      3. Choisissez les tranches Z pour l’analyse de la forme cellulaire de la région apicale des monocouches.
      4. Prenez des photos pour au moins 3 champs de vision différents (200-400 cellules).

2. Analyse d’image

REMARQUE : Les macros fournies fonctionnent de manière optimale sur ImageJ version 1.50f ou plus récente. Utilisez pour la quantification uniquement des images avec un rapport signal/bruit élevé et sans pixels sous-ou sursaturés. Les méthodes décrites incluent des étapes nécessitant un ajustement manuel des paramètres. Ainsi, une analyse aveugle / configuration d’expérience aveuglée est recommandée. Pour chiffrer les noms de fichiers image, les plugins ImageJ tels que « Blind Analysis Tool » (disponible à l’adresse suivante : https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools) peuvent être utilisés.

1. Analyse focale de l’adhérence
   REMARQUE : Les fichiers d’entrée recommandés pour les méthodes suivantes sont les suivants : images de FA représentées en échelle de gris 8 bits enregistrées au format .tiff.
   1. Ouvrez l’image à l’aide d’ImageJ.
   2. Définir l’échelle d’une image sur pixels (Analyse | Échelle de jeu; Supprimez l’échelle et cochez l’option Global).
   3. Inclure le nom du fichier et la zone de retour sur investissement dans les options de mesure (Analyser | Définir les mesures...); vérifiez les options d’étiquette zone et affichage.
   4. Soustraire l’arrière-plan (Processus | Soustraire l’arrière-plan ; définir le paramètre de rayon de boule de roulement à 50 pixels ; vérifier l’option parabolique coulissante). Dans le cas d’images RGB pseudocolorées : fractionner les canaux RGB, quitter le canal avec des FA ouverts, fermer les canaux restants (Image | Couleur | Split Channels).
   5. Déterminer la zone de la plus petite région d’intérêt (ROI). À l’aide de sélections à main levée ou polygone, on décrit la plus petite adhérence focale et mesurent sa zone (Analyse | Mesure). Répétez cette étape pour différents ROI (FA) à partir de quelques images choisies au hasard (pour un total de 20 ROI). Calculer et enregistrer la moyenne des résultats obtenus.
      REMARQUE : Cette étape n’est requise que lorsqu’un ensemble d’images donné est analysé pour la première fois (ligne cellulaire spécifique, glissements de revêtement avec des composants spécifiques de matrice extracellulaire, conditions de culture différentes).
   6. Convertir l’image en binaire à l’aide de l’une des méthodes suivantes :
      1. Définir le seuil global (Image | Ajuster | Seuil; vérifiez les options Par défaut, B&W et Dark Background, ajustez le seuil manuellement ou définissez-le automatiquement).
      2. Définir le seuil local (Image | Ajuster | Seuil local automatique...; définir méthode sur Phansalkar et vérifier objets blancs sur l’option fond noir. Ensuite, inverser l’image (Modifier | Invert).
   7. Mesurer le nombre et la superficie des VOI. Sélectionnez Analyser | Analyser les particules; vérifiez Unités pixel, Afficher les résultats, Effacer les résultats et résumer les options, définir le paramètre Taille, comme une limite inférieure utiliser la moyenne des plus petits ROIs de l’étape 2.1.5. La limite supérieure peut être définie à 25% d’une zone cellulaire typique.
   8. Transférer des données (qui incluent le nom de l’image, le nombre d’AF, la zone totale et moyenne des FA; respectivement tranche, compte, superficie totale, taille moyenne)de la fenêtre Résumé au programme de gestion des données de choix.
   9. Déterminez le nombre de cellules par image en comptant les noyaux tachés par DAPI. Le comptage peut se faire manuellement (Plugins | Analyser | Cell Counter) ou comme dans les protocoles disponibles tels que: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.
   10. Alternativement, pour faciliter le comptage des FA, utilisez la macro ImageJ (FAs.ijm) jointe.
       1. Déplacez le fichier .ijm avec la macro vers le dossier plugins ou macros situé dans les dossiers de fichiers source ImageJ.
       2. Déterminer une zone du plus petit retour sur investissement tel que décrit à l’étape 2.1.4.
       3. Ouvrir le fichier macro (Plugins | Macros | Modifier...).
       4. Avant d’exécuter la macro, définissez la valeur de trois variables : remplir la valeur de area_of_the_smallest_region_of_interest avec un nombre acquis à l’étape 2.1.4. Définissez threshold_type valeur sur manuel ou automatique.
       5. Enregistrer les modifications (la macro doit être prête à l’emploi).
       6. Appelez la macro à partir du panneau ImageJ ou effectuez un raccourci vers celui-ci. La macro commence par la fenêtre de dialogue ouverte standard. Sélectionnez l’image à traiter.
          REMARQUE : En cas d’ajustement manuel du seuil, la confirmation manuelle de la valeur du seuil sera nécessaire (évitez d’accepter les modifications à l’aide du bouton Appliquer sur la fenêtre de dialogue Seuil, utilisez plutôt la fenêtre de dialogue personnalisée Action Required). Les résultats obtenus en travaillant avec la macro sont les mêmes que ceux décrits à l’étape 2.1.8 (inclus dans la fenêtre de dialogue Résumé). En outre, dans le cas de l’ajustement manuel du seuil, le niveau de seuil inférieur s’affiche dans une fenêtre de dialogue Journal, car cette valeur permet de reproduire les résultats obtenus à l’avenir si nécessaire. Les chiffres supplémentaires S1 et S2 ont été inclus comme un jeu de données de formation pour la macro FAs.ijm.
2. Analyse de la forme cellulaire
   1. Manuelle
      1. Ouvrez une image dans ImageJ ou un autre logiciel de traitement d’image avec un ensemble similaire de fonctions (d’autres instructions se rapportent à ImageJ). Choisissez les paramètres à mesurer en sélectionnant dans le menu Analyse | Définissez les mesures et cochez les descripteurs de forme dans la zone apparaissant.
      2. Délimiter manuellement les bordures cellulaires, marquées par des protéines de jonction de choix, à l’aide de l’icône sélections freehand. Les paramètres choisis sont automatiquement calculés pour chaque cellule. Stockez les résultats après avoir décrit chaque cellule en cliquant sur Modifier | Sélection | Ajouter au gestionnaire. Seules des cellules complètes et entièrement visibles, avec des bordures ininterrompues, doivent être comptées.
      3. Lorsque toutes les cellules du champ de vision sont décrites, effectuez la mesure en marquant tous les nombres apparaissant dans la zone gauche du Gestionnaire de retour sur investissement (correspondant aux cellules) et en cliquant sur Mesurer Les résultats apparaissent dans la zone Résultats et peuvent être transférés à la feuille de calcul de choix.
   2. Automatisé
      REMARQUE : Pour faciliter la quantification des descripteurs de forme cellulaire (CSI, rapport d’aspect, rondeur, solidité), une macro ImageJ a été préparée et jointe à cet article (CSI.ijm). La macro est principalement basée sur le plugin ImageJ appelé MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ)⁵. La macro exécute les étapes suivantes : 1) Extension de chaque bordure d’image par 10 pixels noirs [MorpholibJ]; 2) Séries de dilatations et d’érosions - filtre morphologique [MorpholibJ]; 3) Génération d’image binaire des limites des cellules par segmentation morphologique [MorpholibJ]; 4) Dilatation des limites cellulaires; 5) Inversion de la valeur des pixels; 6) Génération de sélections et mesure de la zone et du périmètre des cellules sur l’image; et 7) Enregistrement d’image avec les cellules décrites et les sélections de retour sur investissement ImageJ dans un nouveau fichier.
      1. Déplacez le fichier .ijm avec la macro vers le dossier plugins ou macros situé dans les dossiers de fichiers source ImageJ. Appelez la macro à partir du panneau ImageJ ou effectuez un raccourci vers celui-ci.
      2. Avant la quantification d’un nouvel ensemble de données, déterminez les valeurs des régions les plus petites et les plus grandes d’intérêt. Décrivez (sélection à main levée ou polygone) quelques exemples (3-10) des cellules les plus petites et les plus grandes de l’image, puis mesurez leur zone (Analyse | Mesure).
      3. Inversement, exécutez la macro avec des paramètres par défaut (la limite de taille inférieure est définie sur 0 et la limite supérieure est définie à l’infini), attendez que la macro se termine et sélectionnez Définir l’option Limites de taille de cellule. Mesurez la zone des cellules les plus petites et les plus grandes en cliquant sur leur étiquette, puis appuyez sur Mesure dans le gestionnaire de retour sur investissement ImageJ. Définissez la valeur des variables the_smallest_cell et the_biggest_cell. Enregistrez les modifications, fermez toutes les fenêtres de dialogue macro et exécutez à nouveau la macro.
         REMARQUE : La macro peut être utilisée sans fixer de limites de taille de retour sur investissement, mais elle n’est pas recommandée car elle augmente considérablement les chances de mesurer des fragments de cellules inappropriés ou des grappes de cellules.
      4. Démarrez la macro avec la fenêtre de dialogue Ouvrir standard. Sélectionnez l’image à traiter (échelle de gris).
      5. Analyser les résultats. La sortie fournie par la macro se compose de : tableau des résultats (étiquette cellulaire, étiquette d’image, zone cellulaire [pixels^2],périmètre cellulaire [pixels^2],circularité [CSI], rapport d’aspect, rondeur, solidité), image avec cellules décrites et liste de sélections de ROI (qui sera également enregistrée dans le nouveau fichier dans le sous-dossier résultats). La table des résultats sera automatiquement copiée dans le presse-papiers de l’utilisateur.
         REMARQUE : Les chiffres supplémentaires S3 et S4 ont été inclus comme jeu de données de formation pour la macro CSI.ijm.

3. Quantification

1. Quantification des FA
   1. Calculez le nombre moyen d’AF et la taille moyenne de fa par cellule/noyaux.
      REMARQUE : Pour certaines lignées cellulaires, il est possible de compter les FA séparément dans des cellules distinctes. Pour les lignées cellulaires qui ont de forts contacts cellule-cellule et se développent en tant que monocouches telles que MCF7, le nombre et la taille des FA par cellule peuvent être calculés en divisant les valeurs obtenues à partir de FA compter par le nombre de noyaux dans l’image entière.
   2. Évaluer l’importance statistique des différences potentielles entre les populations (groupes expérimentaux). Selon la distribution et la variance des données, pour la comparaison des deux groupes différents, l’utilisation du test t étudiant (distribution normale) ou du test U non paramétrique (Mann-Whitney). Pour comparer plusieurs groupes, utilisez ANOVA ou Kruskal–Wallis à sens unique en conjonction avec les tests post-hoc appropriés.
2. Analyse de la forme cellulaire
   1. Calcul des descripteurs de forme
      1. Analyse manuelle : Calculer l’index de forme cellulaire (CSI, également appelé circularité ou forme de cellule) dans la feuille de calcul de choix pour chaque cellule mesurée à partir de la zone et du périmètre appropriés à l’aide de la formule :
         
         REMARQUE : CSI assume des valeurs comprises entre 1 (circulaire) et 0 (allongée). Les exemples de différentes formes cellulaires (avec la même zone) et leurs ISC respectives sont présentés à la figure 2. Dans l’analyse automatisée, les valeurs des descripteurs de forme (enrôlés et définis ci-dessous) sont calculées automatiquement et apparaissent dans la zone de résultats :
         (1) CSI = 4π*area/(perimeter)²
         (2) AR = axe majeur/axe mineur
         (3) Rondeur = 4*zone/π*(axe majeur)²
         (4) Solidité = zone/zone convexe
   2. Histogrammes de la distribution de la forme cellulaire
      1. Tracer la distribution de la forme cellulaire comme un histogramme de circularité (CSI). Classez les cellules en fonction de leur valeur CSI (calculée pour le minimum de 200–400 cellules), à l’un des dix intervalles uniformes (plage: 0-1, largeur du bac: 0,1). L’histogramme affiche le nombre de cellules dans chaque catégorie.
         REMARQUE : L’histogramme montrant la distribution de forme de la couche cellulaire MCF7 typique montre un pic d’environ 0,7-0,8 CSI. Si la forme des cellules est déformée par un certain facteur (par exemple le traitement du paclitaxel, qui provoque l’arrêt de phase G2/M et dans la conséquence plus de cellules sont rondes), il devrait être reflété sur l’histogramme.
   3. Parcelles de distribution cumulatives
      1. Comparez les distributions cumulatives de CSI pour chaque ligne de cellule, car c’est la meilleure façon d’évaluer les différences statistiquement importantes dans les changements de forme cellulaire (ou tout autre changement dans la distribution. Par exemple, il peut être appliqué pour suivre l’évolution de la distribution des FA.
      2. Calculez la fonction de distribution cumulative (CDF) pour comparer les distributions. CDF attribue pour une valeur CSI donnée (tracée sur l’axe X) le pourcentage (ou nombre relatif) pour lequel toutes les valeurs sont inférieures ou égales à cette valeur CSI (tracée sur l’axe Y). Ainsi, à mesure que la valeur CSI augmente, le pourcentage de l’ensemble de valeurs qui sont moins ou égales à cette valeur augmente également. CDF peut être calculé par le logiciel statistique de choix, ou manuellement.
      3. Pour l’analyse statistique, utilisez le test non paramétrique kolgomorov-Smirnov.

Résultats

Analyse focale de l’adhérence
Le knockdown du gène HAX1 a été précédemment montré pour affecter les adhérences focales⁶. Les cellules ont été cultivées sur la surface enduite de collagène I pendant 48 h. Des images des cellules témoins MCF7 et des cellules MCF7 avec un knockdown HAX1 (HAX1 KD) de trois expériences indépendantes tachées de paxilline de protéine d’adhérence focale ont été obtenues à l’aide d’un microscope co...

Discussion

L’adhérence cellule-cellule et cell-substrat constitue des attributs inhérents des cellules épithéliales et jouent le rôle critique dans la morphogenèse des tissus et l’embriogenèse. Dans les tissus adultes, la régulation appropriée des propriétés mécaniques de la couche cellulaire est cruciale pour maintenir l’homéostasie et prévenir les réponses pathologiques comme la progression et la métastase de tumeur. La taille et le nombre d’adhérences focales dépendent de la force de l’adhérence cell...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	goat anti-rabbit, 1:500
Ammonium chloride	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
Collagen from calf skin	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
Junction plakoglobin	Cell Signaling	2309S	rabbit, 1:400
Laminar-flow cabinet class 2	Alpina		standard equipment
MCF7-basedHAX1KD cell line	Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019		MCF7 cell line withHAX1knockdown
MCF7 cell line (CONTROL)	ATCC	ATCC HTB-22	epithelial, adherent breast cancer cell line
Olympus CK2 light microscope	Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	rabbit, 1:250, Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
Phalloidin-TRITC conjugate	Sigma	P1951	1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST – NaCl	Sigma	S9888
TBST – Trizma base	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
Zeiss LSM800 Confocal microscope	Zeiss