MCF7 세포 단층층의 세포 기판 접착 영역 및 세포 모양 분포의 정량화

요약

이 기사는 1) 초점 접착의 크기와 수 및 2) 세포 형상 지수및 MCF7 세포의 컨런트 단층의 공초점 이미지로부터의 분포를 정량화하는 것을 설명합니다.

초록

여기에 제시된 방법은 여러 개의 적절하게 스테인드 된 공초점 이미지에서 컨런트 셀 단층의 일부 매개 변수를 정량화 : 초점 접착의 수와 크기의 함수로 기판에 접착, 및 세포 모양, 세포 모양 인덱스 및 기타 모양 설명자가 특징입니다. 초점 접착은 팍실린 염색에 의해 시각화되었고 세포 세포 경계는 접합 플라코글로빈과 액틴으로 표시되었다. 세포 배양 및 염색 방법에 대한 방법은 표준이었다; 이미지는 단일 초점 평면을 나타냅니다. 이미지 분석은 공개적으로 이용 가능한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 제시된 프로토콜은 단층의 초점 접착력의 수와 크기와 세포 형상 분포의 차이를 정량화하는 데 사용되지만, 염색될 수 있는 다른 뚜렷한 세포 구조의 크기와 형상의 정량화를 위해 재사용될 수 있다(예를 들어, 미토콘드리아 또는 핵). 이러한 매개 변수를 평가하는 것은 세포 모양에 영향을 미치는 세포 접착력 및 actomyosin 수축도를 포함하여 부착 된 세포 층에서 동적 힘의 특성화에 중요합니다.

서문

상피 세포 단층은 세포 세포 및 세포 기질 접착뿐만 아니라 수축력 및 장력이 중요한 매개 변수를 나타내고 적절한 균형이 단위^1,,2,,3의전반적인 무결성에 기여하는 집단으로서 작용한다. 따라서 이러한 매개 변수를 평가하는 것은 셀 레이어의 현재 상태를 설정하는 방법을 나타냅니다.

여기서 설명된 2개의 방법은 지지체, 상피 세포의 컨런트 단층층의 2차원 분석을 나타낸다(이 경우 MCF7 유방암 세포주). 분석은 Z축의 다른 영역의 공초점 이미지(단일 Z-슬라이스)를 사용하여 수행됩니다. 세포 형상 측정을 위한 초점 접착(FA) 측정 및 정량 영역을 위한 기판 근처의 기저 영역. 제시된 방법은 비교적 간단하며 표준 실험실 기술과 오픈 소스 소프트웨어가 필요합니다. 공초점 현미경 검사는 이 프로토콜에 충분하므로 보다 전문적인 TIRF(총 내부 반사 형광) 현미경 검사를 사용하지 않고 수행할 수 있습니다. 따라서 프로토콜은 비교적 표준 실험실 설정에서 구현될 수 있습니다. 방법의 정확도는 제한적이지만 초점 접착 및 세포 모양의 기본 차이를 구별 할 수 있습니다.

여기서 설명된 두 가지 방법은 ImageJ를 사용하여 수행된 세포 배양, 면역스테인링, 공초점 이미징 및 이미지 분석과 같은 표준 실험 절차로 구성됩니다. 그러나 적절한 기능을 갖춘 모든 이미지 처리 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 제시된 방법은 약리학 처리 또는 최소한의 유전 수정에 의해 가해진 변경을 추적하고 비교할 수 있습니다. 이러한 메서드의 제한된 정밀도로 인해 명확한 값을 얻는 것은 권장되지 않습니다. 많은 이미지의 측정을 용이하게하기 위해 두 개의 자동화 된 매크로가 포함되었습니다.

프로토콜

1. 준비 단계

1. 컨서적 단층층을 얻기 위한 세포 시딩
   1. 시드하기 전에 4웰 챔버 슬라이드의 웰을 콜라겐 I(또는 다른 ECM 성분)로 코팅합니다. 콜라겐 I 코팅의 경우, 상용 프로토콜을 따르십시오 : 8 μg /cm^2의농도에서 https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html.
   2. 4웰 챔버 슬라이드의 한 웰에 400,000 개의 세포를 시드하십시오.
   3. 염색 하기 전에 24h(또는 실험 종점에 따라 더 이상) 세포를 배양하고, 37°C, 5% CO_2에서인큐베이터에서. 이 단계는 세포 세포 접촉의 성숙과 단층의 형성을 허용합니다.
   4. 광학, 반전 된 현미경을 사용하여 통합 (약 90 %가 필요함) 및 단층의 일반적인 상태를 확인하십시오. 세포가 떠 있거나 스트레스를 받는 경우 진행하지 마십시오.
2. 면역형광 염색
   참고: 셀은 선택 프로토콜로 염색할 수 있습니다. 여기서, 면역형광은 이전에 설명된^4와같이 수행되었다.
   1. 초점 접착 분석을 위해, 선택의 초점 접착 단백질로 세포를 얼룩 (이 프로토콜 paxillin에서). 셀-세포 접합 단백질을 선택한 세포 모양 분석 얼룩(이 프로토콜에서 데모소말 단백질 플라코글로빈).
   2. 프로시저의 경우 달리 지정하지 않는 한 지정된 솔루션의 0.5mL을 사용합니다.
   3. PBS에서 4% 포름알데히드에서 30분 동안 세포를 얼음으로 고정합니다.
   4. 0.1 M 염화암모늄(PBS)을 10분 간 배양하여 자동 형광을 해소합니다.
   5. 30분(퍼메아빌리제이화)에 0.5% 트리톤 X-100(PBS)을 추가합니다.
   6. 1 시간 동안 TBS-T에서 5 % 우유 (또는 1 % BSA)로 차단하십시오.
   7. 하룻밤 4 °C에서 1 차 항체와 인큐베이션 (안티 팍실린 : 토끼, 1:250, 안티 플라코글로빈 : 토끼, 1:400)
   8. 30 분 동안 이차 항체가있는 인큐베이션 (알렉사 플루어 594 염소 안티 토끼, 1:500, 1:500)
   9. 300 nM DAPI를 1-5분 동안 켜진 스테인은 빛으로부터 보호합니다.
      참고: 선택적으로, 형광 성 남염 접합체 (conc. 1:400)를 가진 actin의 추가 염색이 수행 될 수있다; phalloidin는 이차 항체와 같은 단계에서 추가되어야 합니다.
3. 공초점 이미징
   1. 공초점 현미경(예: 자이스 LSM800)을 사용하여 단일 Z 슬라이스의 이미지를 가져 가라.
      참고: 선택적 액틴 염색은 적절한 초점 평면을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 피질 작용체 염색은 액틴 응력 섬유가 기질 부위, 기판 부근에 존재하는 동안, 도 1에도시된 바와 같이 정량부위에 존재한다.
   2. 초점 접착 이미징
      1. 기판에 가까운 기저 영역에서 초점 접착 분석을 위해 Z 슬라이스를 선택합니다.
      2. 사용 가능한 가장 높은 숫자 조리개와 목표를 사용합니다(63x N.A.: 1.4).
         참고: FA의 모양은 매우 구체적이며 쉽게 알아볼 수 있습니다. 따라서, 세포 아래 초점 평면에서 스캔을 시작 하 고 천천히 그들을 향해 스캔 하는 것이 좋습니다., 파 가 명확 하 게 볼 때까지. 이미지 분석은 더 균일한 경향이 비전의 작은 필드에서 더 정확할 것입니다, 그러나 이것은 더 적은 세포가 보기의 한 필드에 계산될 것이라는 것을 의미합니다.
   3. 세포 세포 접촉 화상 진찰
      1. 40배 또는 63배 의 목표를 사용합니다.
      2. 핵 염색 및 선호하는 접합 단백질 염색을 위한 채널을 선택합니다.
      3. 단층의 정량 영역에서 셀 형상 분석을 위해 Z 슬라이스를 선택합니다.
      4. 적어도 3개의 다른 시야(200-400 세포)에 대한 사진을 찍습니다.

2. 이미지 분석

참고: 제공된 매크로는 ImageJ 버전 1.50f 또는 최신 버전에서 최적으로 작동합니다. 신호 대 잡음 비율이 높고 저평가된 픽셀이 없는 이미지만 정량화하는 데 사용합니다. 설명된 방법에는 수동 매개변수 조정이 필요한 단계가 포함됩니다. 따라서 블라인드 분석/맹목적인 실험 설정이 권장됩니다. 이미지 파일 이름을 암호화하기 위해 "블라인드 분석 도구"(https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools 사용 가능)와 같은 ImageJ 플러그인을 사용할 수 있습니다.

1. 초점 접착 분석
   참고: 다음 방법에 대한 권장 입력 파일은 .tiff 형식으로 저장된 8비트 그레이스케일로 표시되는 FA 이미지입니다.
   1. ImageJ를 사용하여 이미지를 엽니다.
   2. 이미지의 배율을 픽셀로설정(분석 | 설정 배율;; 배율을 제거하고 전역 옵션을 확인합니다).
   3. 측정 옵션에 파일 이름과 ROI 영역포함(분석 | 측정 설정...); 영역 및 표시 레이블 옵션을 확인합니다.
   4. 배경 을 뺍니다(프로세스 | 배경을 뺍니다. 롤링 볼 반경 매개변수를 50픽셀로 설정합니다. 슬라이딩 포물선형 옵션을 확인하십시오). 의사 변색 RGB 이미지의 경우 : 분할 RGB 채널, F가 열리고, 닫기 남은 채널채널로 채널을 떠나(이미지 | 색상 | 분할 채널).
   5. 가장 작은 관심 영역(ROI)의 영역을 결정합니다. 프리핸드 또는 다각형 선택을 사용하여 가장 작은 단일 초점 접착을 설명하고 해당 영역을 측정합니다(분석| 측정). 임의로 선택한 몇 가지 이미지(총 20개의 ROI)에서 다른 ROI(FA)에 대해 이 단계를 반복합니다. 얻은 결과의 평균을 계산하고 저장합니다.
      참고: 이 단계는 주어진 이미지 집합을 처음으로 분석하는 경우에만 필요합니다(특정 세포주, 특정 세포외 매트릭스 구성 요소로 코팅 슬라이드, 다른 배양 조건).
   6. 다음 방법 중 하나를 사용하여 이미지를 바이너리로 변환합니다.
      1. 전역 임계값설정(이미지 | 조정 | 임계값; 기본값, B&W 및 다크 배경 옵션을 확인하거나 임계값을 수동으로 조정하거나 자동으로 설정합니다.)
      2. 로컬 임계값 설정(이미지 | 조정 | 자동 로컬 임계값...; 방법을 판살카르로 설정하고 검은색 배경 옵션에서 흰색 개체를 확인합니다. 다음으로, 이미지를 반전(편집 | 반전).
   7. ROI의 수와 영역을 측정합니다. 분석 선택 | 입자 분석; 픽셀 단위, 결과 표시, 결과 지우기 및 요약 옵션, 크기 매개 변수설정, 낮은 경계는 단계 2.1.5에서 가장 작은 RO의 평균을 사용합니다. 상부 경계는 일반적인 세포 영역의 25%로 설정할 수 있습니다.
   8. 데이터 전송(이미지 이름, FA 수, 총 및 평균 영역, 각각 슬라이스, 카운트, 총 면적, 평균 크기포함)을 요약 창에서 선택한 데이터 관리 프로그램에 연결합니다.
   9. DAPI 염색 핵을 계산하여 이미지당 세포 수를 결정합니다. 카운트는 수동으로 수행 할 수 있습니다(플러그인 | 분석 | 셀 카운터)또는 다음과 같은 사용 가능한 프로토콜에서와 같이: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.
   10. 또는, FA 계산을 용이하게하려면, 첨부 된 ImageJ 매크로 (FAs.ijm)를 사용합니다.
       1. ImageJ 소스 파일 폴더에 있는 플러그인 또는 매크로 폴더에 매크로와 함께 .ijm 파일을 이동합니다.
       2. 2.1.4 단계에서 설명된 바와 같이 가장 작은 ROI영역을 결정합니다.
       3. 매크로 파일 열기(플러그인 | 매크로 | 편집...
       4. 매크로를 실행하기 전에 세 변수의 값을 설정: 단계 2.1.4 동안 획득 한 숫자로 area_of_the_smallest_region_of_interest 채우기 값. threshold_type 값을 수동 또는 자동으로설정합니다.
       5. 변경 내용을 저장합니다(매크로를 사용할 준비가 되어 있어야 합니다).
       6. ImageJ 패널에서 매크로를 호출하거나 바로 가기를 만듭니다. 매크로는 표준 열린 대화 상자 창에서 시작합니다. 처리할 이미지를 선택합니다.
          참고: 수동 임계값 조정의 경우 임계값 값에 대한 수동 확인이 필요합니다(임계값 대화 상자 창에서 적용 단추를 사용하여 변경 내용을 수락하지 말고 대신 작업 필수 사용자 지정 대화 창을 사용하십시오). 매크로로 작업하여 얻은 결과는 2.1.8 단계(요약 대화 상자에 포함)에 설명된 결과와 동일합니다. 또한 수동 임계값 조정의 경우 낮은 임계값 수준이 Log 대화 상자 창에 표시되며, 이 값을 사용하면 필요한 경우 나중에 얻은 결과를 재현할 수 있습니다. 추가 피규어 S1및 S2는 FAs.ijm 매크로에 대한 교육 데이터 집합으로 포함되었습니다.
2. 셀 형상 분석
   1. 수동
      1. ImageJ 또는 유사한 함수 집합이 있는 다른 이미지 처리 소프트웨어에서 이미지를 엽니다(ImageJ에 관련된 추가 지침). 메뉴 분석에서 선택하여 측정할 매개변수를 선택 | 나타나는 상자에 측정값 과 똑딱 모양 설명자 를 설정합니다.
      2. Freehand 선택 아이콘을 사용하여 접합 단백질(들)으로 표시된 셀 테두리를 수동으로 설명합니다. 선택한 매개 변수는 각 셀에 대해 자동으로 계산됩니다. 편집을 클릭하여 각 셀을 요약한 후 결과를 저장 | 선택 | 관리자에 추가합니다. 중단 없는 테두리가 있는 완전하고 완전히 보이는 셀만 계산해야 합니다.
      3. 시야의 모든 셀이 윤곽을 작성하면 ROI 관리자의 왼쪽 상자에 나타나는 모든 숫자(셀에 해당)를 표시하고 측정값을 클릭하여 결과 상자에 결과가 나타나고 선택한 스프레드시트로 전송할 수 있습니다.
   2. 자동
      참고: 셀 형상 설명자(CSI, 종횡비, 원도, 견고성)의 정량화를 용이하게 하기 위해 ImageJ 매크로가 이 문서(CSI.ijm)에 준비되고 부착되었습니다. 매크로는 주로 MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ) 5라는 ImageJ 플러그인을^{기반으로합니다.} 매크로는 다음 단계를 실행합니다: 1) 이미지의 각 테두리의 확장은 10개의 검정 픽셀[MorpholibJ]에 의해 확장됩니다. 2) 팽창과 침식의 라운드 - 형태 필터 [MorpholibJ]; 3) 형태학적 세분화에 의한 세포 경계의 이진 이미지 생성[MorpholibJ]; 4) 세포 경계의 팽창; 5) 픽셀 값의 반전; 6) 이미지에 있는 세포의 영역 및 둘레의 선택 및 측정의 생성; 및 7) 설명된 셀및 ImageJ ROI 선택 항목으로 이미지를 새 파일에 저장합니다.
      1. 매크로가 있는 .ijm 파일을 ImageJ 소스 파일 폴더에 있는 플러그인 또는 매크로 폴더로 이동합니다. ImageJ 패널에서 매크로를 호출하거나 바로 가기를 만듭니다.
      2. 새 데이터 집합을 정량화하기 전에 가장 작고 가장 큰 관심 영역의 값을 결정합니다. 이미지에서 가장 작고 가장 큰 셀의 몇 가지 (3-10) 예의 윤곽선 (freehand 또는 다각형 선택) 다음 해당 영역을 측정(| 분석 측정).
      3. 또는 기본 설정(크기 제한이 0으로 설정되고 상한이 무한대로 설정됨)으로 매크로를 실행하면 매크로가 완료될 때까지 기다렸다가 셀 크기 경계 설정 옵션을 선택합니다. 레이블을 클릭하여 가장 작고 가장 큰 셀의 영역을 측정한 다음 ImageJ ROI 관리자에서 측정을 누릅니다. the_smallest_cell 변수와 the_biggest_cell 변수의 값을 설정합니다. 변경 내용을 저장하고 모든 매크로 대화 창을 닫고 매크로를 다시 실행합니다.
         참고: 매크로는 ROI 크기 경계를 설정하지 않고 사용할 수 있지만 부적절한 셀 조각이나 셀 클러스터를 측정할 가능성이 크게 증가하기 때문에 권장되지 않습니다.
      4. 표준 열린 대화 상자 창으로 매크로를 시작합니다. 처리할 이미지(회색축)를 선택합니다.
      5. 결과를 분석합니다. 매크로에서 제공하는 출력은 결과 테이블(셀 라벨, 이미지 레이블, 셀 영역 [픽셀^2],셀 둘레 [픽셀^2],원형 [CSI], 종횡비, 둥글림, 견고성), 설명된 셀및 ROI 선택 목록(결과 하위 폴더에 새 파일에 저장됨)으로 구성됩니다. 결과 테이블은 사용자의 클립보드에 자동으로 복사됩니다.
         참고: 추가 수치 S3 및 S4는 CSI.ijm 매크로에 대한 교육 데이터 집합으로 포함되었습니다.

3. 정량화

1. FA의 정량화
   1. 세포/핵당 평균 FA 수와 평균 FA 크기를 계산합니다.
      참고: 일부 세포주에 대 한 별개의 세포에서 별도로 FA를 계산하는 것이 가능 하다. 강력한 세포 세포 접점을 갖는 세포주 접촉체의 경우 MCF7과 같은 단층층으로 성장하며, 세포당 단일층으로 성장하며, 세포당 FA의 수 와 크기는 전체 이미지에서 핵의 수에 의해 계수하는 FA로부터 얻은 값을 분할하여 계산될 수 있다.
   2. 인구(실험 그룹)간의 잠재적 차이의 통계적 유의성을 평가합니다. 데이터의 분포 와 분산에 따라 두 개의 서로 다른 그룹을 비교하기 위해 학생 t 테스트(일반 분포) 또는 비파라메트릭 U-테스트(Mann-Whitney)를 사용합니다. 여러 그룹을 비교하기 위해 적절한 포스트 혹 테스트와 함께 편도 ANOVA 또는 Kruskal-Wallis를 사용합니다.
2. 셀 형상 분석
   1. 셰이프 설명자 계산
      1. 수동 분석: 수식을 사용하여 적절한 영역 및 둘레에서 측정된 각 셀에 대한 스프레드시트에서 셀 셰이프 인덱스(CSI, 원형 또는 셀 형상이라고도 함)를 계산합니다.
         
         참고: CSI는 값을 1(원형)에서 0(길쭉한 값)으로 가정합니다. 다양한 셀 셰이프(동일한 영역)와 해당 각 CSI의 예는 도 2에나와 있습니다. 자동화된 분석에서 셰이프 설명자 값(아래 등록 및 정의)은 자동으로 계산되고 결과 상자에 나타납니다.
         (1) CSI = 4π*영역/(둘레)²
         (2) AR = 주요 축/미축
         (3) 둥글림 = 4*영역/π*(주요 축)²
         (4) 견고성 = 영역/볼록 영역
   2. 세포 모양 분포의 히스토그램
      1. 세포 형상 분포를 순환(CSI)의 히스토그램으로 플롯합니다. 그들의 CSI 값에 따라 셀을 분류 (최소 200-400 셀에 대 한 계산), 10 균일 한 간격 중 하나에 (범위: 0-1, 빈 너비: 0.1). 히스토그램은 모든 범주의 셀 수를 표시합니다.
         참고: 일반적인 MCF7 세포 층의 형상 분포를 보여주는 히스토그램은 약 0.7-0.8 CSI의 피크를 나타낸다. 세포의 모양이 일부 요인에 의해 왜곡되는 경우 (예를 들어 G2 / M 위상 체포를 일으키는 원인이 되는 paclitaxel 치료와 그 결과 더 많은 세포가 둥글다) 그것은 히스토그램에 반영되어야한다.
   3. 누적 배포 플롯
      1. 셀 모양 변경(또는 분포의 다른 변화)에서 통계적으로 중요한 차이를 평가하는 가장 좋은 방법이기 때문에 각 셀라인에 대한 누적 CSI 분포를 비교합니다. 예를 들어, 그것은 FA의 변화 분포를 추적하기 위해 적용 할 수있다.
      2. 누적 분포 함수(CDF)를 계산하여 분포를 비교합니다. CDF는 지정된 CSI 값(X 축에 플롯) 모든 값이 이 CSI 값(Y 축에 플롯된)과 덜 또는 동일한 백분율(또는 상대 수)을 할당합니다. 따라서 CSI 값이 높아지면 이 값과 덜 또는 동일한 값 집합의 백분율도 높아집니다. CDF는 선택한 통계 소프트웨어또는 수동으로 계산할 수 있습니다.
      3. 통계 분석을 위해 콜고모로프-스미르노프 비파라메트릭 테스트를 사용하십시오.

결과

초점 접착 분석
HAX1 유전자의 녹다운은 이전에 초점^접착6에영향을 미치는 것으로 나타났다. 세포는 콜라겐 I 코팅 표면에 대해 48시간 동안 MCF7 대조구및 MCF7 세포의 HAX1 녹다운(HAX1 KD)을 이용한 3개의 독립적인 실험으로부터 초점 접착 단백질 팍실린으로 염색된 공초점 현미경(기저 부위의 단일 평면 초점/Z 슬라이스의 이미지)을 사용하여 수배하였다.<...

토론

세포 세포 및 세포 기질 접착은 상피 세포의 고유 특성을 구성하고 조직 형태 발생 및 심방 발생에 중요한 역할을한다. 성인 조직에서 세포 층의 기계적 특성의 적절한 조절은 항상성을 유지하고 종양 진행 및 전이와 같은 병리학적 반응을 예방하는 데 중요합니다. 초점 접착의 크기와 수는 세포 기질 접착강도에 따라 달라지며, 세포 모양은 수축력에 따라 다르며 세포-세포 접촉의 상태와 관련이 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	goat anti-rabbit, 1:500
Ammonium chloride	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
Collagen from calf skin	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
Junction plakoglobin	Cell Signaling	2309S	rabbit, 1:400
Laminar-flow cabinet class 2	Alpina		standard equipment
MCF7-basedHAX1KD cell line	Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019		MCF7 cell line withHAX1knockdown
MCF7 cell line (CONTROL)	ATCC	ATCC HTB-22	epithelial, adherent breast cancer cell line
Olympus CK2 light microscope	Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	rabbit, 1:250, Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
Phalloidin-TRITC conjugate	Sigma	P1951	1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST – NaCl	Sigma	S9888
TBST – Trizma base	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
Zeiss LSM800 Confocal microscope	Zeiss