Quantificação da área de adesão de substrato celular e distribuições de formas celulares em monocamadas de células MCF7

Resumo

O artigo descreve a quantificação de 1) o tamanho e o número de aderências focais e 2) índice de forma celular e sua distribuição a partir de imagens confocal das monocamadas confluentes das células MCF7.

Resumo

Os métodos aqui apresentados quantificam alguns parâmetros de monocamadas de células aderirentes confluentes de múltiplas imagens confocais adequadamente manchadas: adesão ao substrato em função do número e tamanho das aderências focais, e forma celular, caracterizada pelo índice de forma celular e outros descritores de forma. As aderências focais foram visualizadas pela coloração de paxillin e as bordas das células celulares foram marcadas pela plakoglobina de junção e actina. Os métodos de cultura celular e coloração eram padrão; as imagens representam planos focais únicos; a análise de imagens foi realizada utilizando-se software de processamento de imagens disponível publicamente. Os protocolos apresentados são usados para quantificar o número e o tamanho das aderências focais e as diferenças na distribuição de formas celulares nas monocamadas, mas podem ser reaproveitados para a quantificação do tamanho e forma de qualquer outra estrutura celular distinta que possa ser manchada (por exemplo, mitocôndrias ou núcleos). Avaliar esses parâmetros é importante na caracterização das forças dinâmicas na camada celular aderente, incluindo adesão celular e contratilidade de actomyosina que afeta a forma celular.

Introdução

As monocamadas de células epiteliais atuam como um coletivo no qual a adesão célula-célula e substrato de células, bem como forças e tensões contratuais representam parâmetros importantes e seu equilíbrio adequado contribui para a integridade geral da unidade^1,,2,,3. Assim, avaliar esses parâmetros representa uma forma de estabelecer o estado atual da camada celular.

Os dois métodos descritos aqui representam uma análise bidimensional das monocamadas confluentes de células epiteliais aderentes (neste caso, linha de células cancerígenas de mama MCF7). A análise é realizada utilizando-se imagens confocal (fatias Z únicas) de diferentes regiões do eixo Z; região basal perto de um substrato para medições de adesão focal (FA) e região apical para medições de forma celular. Os métodos apresentados são relativamente simples e requerem técnicas de laboratório padrão e software de código aberto. A microscopia confocal é suficiente para este protocolo, por isso pode ser realizada sem empregar microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total (Fluorescência Interna Total). Assim, o protocolo poderia ser implementado em um ambiente de laboratório relativamente padrão. Embora a precisão dos métodos seja limitada, eles podem distinguir diferenças básicas na adesão focal e na forma celular.

Ambos os métodos descritos aqui consistem nos procedimentos experimentais padrão, como cultivo de células, imunostaining, imagem confocal e análise de imagem realizadas por meio do ImageJ. No entanto, qualquer software de processamento de imagem com as funções apropriadas pode ser usado. Os métodos apresentados podem rastrear e comparar alterações infligidas pelo tratamento farmacológico ou modificação genética mínima. A obtenção de valores definidos não é recomendada, devido à precisão limitada desses métodos. Duas macros automatizadas foram incluídas, para facilitar as medições de muitas imagens.

Protocolo

1. Etapas preparatórias

1. Semeadura celular para obter monocamadas confluentes
   1. Antes de semear, cubra os poços de um escorregador de câmara de 4 poços com colágeno I (ou outro componente ECM de escolha). Para revestimento de colágeno I, siga um protocolo comercial: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html a uma concentração de 8 μg/cm².
   2. Semente 400.000 células para um poço de um deslizamento de câmara de 4 poços.
   3. Cultue as células por 24h (ou mais, dependendo dos pontos finais experimentais) antes de coloração, em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂. Esta etapa permite o amadurecimento dos contatos celulares e a formação de monocamadas.
   4. Use um microscópio óptico e invertido para verificar a confluência (cerca de 90% é necessário) e uma condição geral de monocamadas. Não prossiga se as células estiverem flutuando ou parecerem estressadas.
2. Manchas imunofluorescentes
   NOTA: As células podem ser manchadas com um protocolo de escolha. Aqui, a imunofluorescência foi realizada como descrito anteriormente⁴.
   1. Para análise de adesão focal, colori as células com uma proteína de adesão focal de escolha (neste protocolo paxillin). Para a análise da forma celular mancha com proteína de junção celular de escolha (neste protocolo plakoglobina de proteína desmosômica).
   2. Para o procedimento, use 0,5 mL de soluções especificadas, a menos que especificado o contrário.
   3. Fixar células em 4% de formaldeído em PBS por 30 minutos no gelo.
   4. Incubar com cloreto de amônio de 0,1 M (em PBS) por 10 min para saciar a auto-fluorescência.
   5. Adicione 0,5% Triton X-100 (em PBS) por 30 min (permeabilização).
   6. Bloqueie com 5% de leite (ou 1% BSA) em TBS-T por 1 h.
   7. Incubar com anticorpo primário a 4 °C durante a noite (anti-paxillin: coelho, 1:250, anti-plakoglobina: coelho, 1:400)
   8. Incubar com anticorpo secundário por 30 min (Alexa Fluor 594 anti-coelho de cabra, 1:500, 1:500)
   9. Mancha com DAPI de 300 nM por 1-5 min, protegida da luz.
      NOTA: Opcionalmente, pode ser realizada uma coloração adicional de actina com conjugados fluorescentes de faloides (conc. 1:400); a faloideina deve ser adicionada no mesmo passo que o anticorpo secundário.
3. Imagem confocal
   1. Tire imagens de fatias Z únicas usando um microscópio confocal (por exemplo, Zeiss LSM800).
      NOTA: A coloração opcional da actina pode ajudar a avaliar o plano focal adequado. A coloração de actina cortical está presente na região apical enquanto as fibras de estresse actin estão presentes na região basal, próxima ao substrato, conforme ilustrado na Figura 1.
   2. Imagem de adesão focal
      1. Escolha fatias Z para análise de adesão focal da região basal, perto do substrato.
      2. Use um objetivo com a maior abertura numérica disponível (preferível 63x N.A.: 1,4).
         NOTA: A forma de FA é muito específica e facilmente reconhecível. Assim, recomenda-se iniciar a varredura a partir de um plano focal abaixo das células e, em seguida, escanear lentamente em direção a elas, até que as FAs estejam claramente visíveis. A análise da imagem será mais precisa a partir de campos de visão menores, que tendem a ser mais uniformes, mas isso implica que menos células serão calculadas em um único campo de visão.
   3. Imagens de contatos celulares
      1. Use um objetivo de 40x ou 63x.
      2. Selecione canais para coloração nuclear e a coloração preferencial da proteína de junção.
      3. Escolha fatias Z para análise de forma celular da região apical das monocamadas.
      4. Tire fotos para pelo menos 3 diferentes campos de visão (200-400 células).

2. Análise de imagem

NOTA: Desde que as macros funcionem de forma ideal na versão ImageJ 1.50f ou mais recente. Use para quantificação apenas de imagens com uma alta relação sinal-ruído e sem pixels sub ou supersaturados. Os métodos descritos incluem etapas que requerem ajuste manual do parâmetro. Assim, recomenda-se uma configuração de experiência cega/blindada. Para criptografar nomes de arquivos de imagem, plugins ImageJ como "Blind Analysis Tool" (disponível em: https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools) podem ser usados.

1. Análise de adesão focal
   NOTA: Os arquivos de entrada recomendados para os seguintes métodos são: imagens de FAs representadas em escala de cinza de 8 bits salvas no formato .tiff.
   1. Imagem aberta usando ImageJ.
   2. Definir a escala de uma imagem para pixels (Analisar | Escala definida; Remova a escala e verifique a opção Global).
   3. Inclua o nome do arquivo e a área do ROI nas opções de medição (Analisar | Medidas de conjunto...); verificar as opções de etiquetas de área e exibição.
   4. Subtrair fundo (Processo | Subtrair fundo; definir parâmetro de raio de bola rolando para 50 pixels; verificar opção paraboloide deslizante). No caso de imagens RGB pseudocoloridas: canais RGB divididos, deixar o canal com FAs abertos, fechar canais restantes (Imagem | Cor | Canais Divididos).
   5. Determinar a área da menor região de interesse (ROI). Utilizando seleções à mão livre ou polígonos, delineia a menor adesão focal única e mede sua área (Analisar | Medida). Repita esta etapa para diferentes ROIs (FAs) a partir de algumas imagens escolhidas aleatoriamente (para um total de 20 ROIs). Calcule e salve a média dos resultados obtidos.
      NOTA: Esta etapa só é necessária quando um determinado conjunto de imagens é analisado pela primeira vez (linha celular específica, slides de revestimento com componentes específicos da matriz extracelular, diferentes condições de cultura).
   6. Converta a imagem em binária usando um dos seguintes métodos:
      1. Definir o limiar global (Imagem | Ajuste | Limiar; verificar as opções Padrão, B&W e Fundo Escuro, ajustar o limiar manualmente ou configurá-lo automaticamente).
      2. Definir o limiar local (Imagem | Ajuste | Limite local automático...; definir Método para Phansalkar e verificar objetos brancos na opção de fundo preto. Em seguida, inverta a imagem (Editar | Inverter).
   7. Meça o número e a área de ROIs. Selecionar analisar | Analisar partículas; verificar unidades pixel, resultados de exibição, resultados claros e opções de resumo, definir parâmetro de tamanho, como um limite inferior usar a média dos menores ROIs da etapa 2.1.5. O limite superior pode ser definido para 25% de uma área celular típica.
   8. Transferir dados (que inclui nome de imagem, número de FAs, área total e média de FAs; respectivamente Slice, Count, Total Area, Average Size) da janela Resumo para o programa de gerenciamento de dados de escolha.
   9. Determine o número de células por imagem contando núcleos manchados de DAPI. A contagem pode ser feita manualmente(Plugins | Analisar | Contador de células) ou como em protocolos disponíveis como: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.
   10. Alternativamente, para facilitar a contagem de FAs, use a macro ImageJ anexada (FAs.ijm).
       1. Mova o arquivo .ijm com a macro para plugins ou pasta de macros localizada nas pastas de arquivos de origem ImageJ.
       2. Determine uma área do menor ROI conforme descrito na etapa 2.1.4.
       3. Arquivo macro aberto(Plugins | Macros | Editar...).
       4. Antes de executar a macro, defina o valor de três variáveis: valor de preenchimento de area_of_the_smallest_region_of_interest com um número adquirido durante a etapa 2.1.4. Defina threshold_type valor para manual ou automático.
       5. Salvar alterações (a macro deve estar pronta para uso).
       6. Ligue para a macro do painel ImageJ ou faça um atalho para ele. A macro começa com a janela de diálogo aberta padrão. Selecione a imagem a ser processada.
          NOTA: Em caso de ajuste manual do limiar, será necessária a confirmação manual do valor do limiar (evite aceitar alterações usando o botão Aplicar na janela de diálogo Limiar, use a janela de diálogo personalizada Action Required). Os resultados obtidos trabalhando com a macro são os mesmos descritos na etapa 2.1.8 (incluído na janela de diálogo Resumo). Além disso, no caso do ajuste manual do limiar, o Nível inferior do limite é exibido em uma janela de diálogo Log, pois esse valor permite reproduzir resultados obtidos no futuro, se necessário. As Figuras Suplementares S1 e S2 foram incluídas como um conjunto de dados de treinamento para o FAs.ijm macro.
2. Análise de forma celular
   1. Manual
      1. Abra uma imagem no ImageJ ou outro software de processamento de imagem com um conjunto semelhante de funções (instruções adicionais relativas ao ImageJ). Escolha os parâmetros a serem medidos selecionando no menu Análise | Defina medidas e descritores de forma de tique-taque na caixa de aparecimento.
      2. Delineie manualmente as bordas celulares, marcadas por proteínas de junção(s) de escolha, usando o ícone de seleções à mão livre. Os parâmetros escolhidos são calculados automaticamente para cada célula. Armazene os resultados depois de delinear cada célula clicando em Editar | Seleção | Adicione ao gerente. Apenas células completas e totalmente visíveis, com bordas ininterruptas devem ser contadas.
      3. Quando todas as células do campo de visão forem delineadas, faça a medição marcando todos os números que aparecem na caixa esquerda do ROI Manager (correspondente às células) e clicando em Medida Os resultados aparecem na caixa Resultados e podem ser transferidos para a planilha de escolha.
   2. Automatizado
      NOTA: Para facilitar a quantificação dos descritores de forma celular (CSI, proporção, arredondamento, solidez) uma macro ImageJ foi preparada e anexada a este artigo (CSI.ijm). A macro é baseada principalmente no plugin ImageJ chamado MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ)⁵. A macro executa as seguintes etapas: 1) Extensão de cada borda da imagem por 10 pixels pretos [MorpholibJ]; 2) Rodadas de dilatações e erosões - filtro morfológico [MorpholibJ]; 3) Geração de imagem binária das fronteiras das células por segmentação morfológica [MorpholibJ]; 4) Dilatação dos limites celulares; 5) Inversão do valor dos pixels; 6) Geração de seleções e medição de área e perímetro de células na imagem; e 7) Salvar imagem com células delineadas e seleções de ROI imageJ para um novo arquivo.
      1. Mova o arquivo .ijm com a macro para a pasta de plugins ou macros localizada nas pastas de arquivos de origem ImageJ. Ligue para a macro do painel ImageJ ou faça um atalho para ele.
      2. Antes da quantificação de um novo conjunto de dados, determine valores das menores e maiores regiões de interesse. Contorno (seleção à mão livre ou polígono) alguns (3-10) exemplos das menores e maiores células da imagem e, em seguida, medir sua área (Analisar | Medida).
      3. Alternativamente, execute a macro com configurações padrão (limite de tamanho inferior é definido para 0 e limite superior é definido para o infinito), aguarde que a macro termine e selecione Definir limites de tamanho da célula. Meça a área das células menores e maiores clicando em seu rótulo e, em seguida, pressione Measure no ImageJ ROI Manager. Definir o valor das variáveis the_smallest_cell e the_biggest_cell. Salve as alterações, feche todas as janelas de diálogo macro e execute a macro novamente.
         NOTA: A macro pode ser usada sem definir limites de tamanho do ROI, mas não é recomendada porque aumenta significativamente a chance de medir fragmentos celulares inadequados ou aglomerados celulares.
      4. Inicie a macro com a janela de diálogo Padrão Aberto. Selecione a imagem a ser processada (escala de cinza).
      5. Analise os resultados. A saída fornecida pela macro consiste em: tabela dos resultados (rótulo de célula, etiqueta de imagem, área celular [pixels^2],perímetro celular [pixels^2],circularidade [CSI], proporção, arredondamento, solidez), imagem com células delineadas e lista de seleções de ROI (que também serão salvos em novo arquivo na subpasa Resultados). A tabela de resultados será copiada automaticamente para a área de transferência do usuário.
         NOTA: As Figuras Suplementares S3 e S4 foram incluídas como conjunto de dados de treinamento para o CSI.ijm macro.

3. Quantificação

1. Quantificação das FAs
   1. Calcule o número médio de FAs e o tamanho médio da FA por célula/núcleos.
      NOTA: Para algumas linhas de celular é possível contar as FAs separadamente em células distintas. Para linhas celulares que têm contatos fortes células-células e crescem como monocamadas como MCF7, número e tamanho de FAs por célula podem ser calculados dividindo os valores obtidos das FAs contando pelo número de núcleos em toda a imagem.
   2. Avaliar a significância estatística das diferenças potenciais entre as populações (grupos experimentais). Dependendo da distribuição e variância dos dados, para a comparação dos dois grupos diferentes usam teste T (distribuição normal) ou U-test não paramétrico (Mann-Whitney). Para comparação de vários grupos, use ANOVA ou Kruskal-Wallis unidirecional em conjunto com os testes pós-hoc apropriados.
2. Análise de forma celular
   1. Cálculo dos descritores de forma
      1. Análise manual: Calcular índice de forma celular (CSI, também chamado de circularidade ou forma celular) na planilha de escolha para cada célula medida a partir da área e perímetro apropriados usando a fórmula:
         
         NOTA: CSI assume valores entre 1 (circular) e 0 (alongado). Os exemplos de várias formas celulares (com a mesma área) e seus respectivos CSIs são apresentados na Figura 2. Na análise automatizada, os valores dos descritores de forma (alistados e definidos abaixo) são calculados automaticamente e aparecem na caixa de resultado:
         (1) CSI = 4π*área/(perímetro)²
         (2) AR = eixo principal/eixo menor
         (3) Arredondamento = 4*área/π*(eixo principal)²
         (4) Solidez = área/área convexa
   2. Histogramas da distribuição da forma celular
      1. Distribuição da forma celular do enredo como um histograma de circularidade (CSI). Classificar as células de acordo com seu valor CSI (calculado para o mínimo de 200-400 células), para um dos dez intervalos uniformes (intervalo: 0-1, largura da lixeira: 0,1). O histograma exibe o número de células em todas as categorias.
         NOTA: O histograma que mostra a distribuição da forma da camada típica de célula MCF7 mostra um pico de cerca de 0,7-0,8 CSI. Se a forma das células é distorcida por algum fator (por exemplo, o tratamento paclitaxel, que causa a prisão da fase G2/M e, na consequência, mais células são redondas) deve ser refletida no histograma.
   3. Parcelas de distribuição cumulativas
      1. Compare as distribuições cumulativas de CSI para cada linha celular, pois é a melhor maneira de avaliar diferenças estatisticamente importantes nas mudanças de forma celular (ou quaisquer outras alterações na distribuição. Por exemplo, ele pode ser aplicado para acompanhar a mudança de distribuição das FAs.
      2. Calcule a Função de Distribuição Cumulativa (CDF) para comparar distribuições. CDF atribui para um determinado valor CSI (plotado no eixo X) a porcentagem (ou contagem relativa) para a qual todos os valores são menores ou iguais a este valor CSI (plotado no eixo Y). Assim, à medida que o valor CSI aumenta, o percentual do conjunto de valores que são menores ou iguais a esse valor também fica maior. O CDF pode ser calculado pelo software estatístico de escolha, ou manualmente.
      3. Para análise estatística, use o teste não paramétrico kolgomorov-smirnov.

Resultados

Análise de adesão focal
O knockdown do gene HAX1 foi anteriormente mostrado para afetar as aderências focais⁶. As células foram cultivadas na superfície revestida de colágeno por 48 h. Imagens das células de controle MCF7 e células MCF7 com um knockdown HAX1 (HAX1 KD) de três experimentos independentes manchados com proteína de adesão focal paxillin foram obtidos usando um microscópio confocal (imagem de plano focal único/fatia Z da regi?...

Discussão

A adesão célula-célula e substrato celular constituem atributos inerentes às células epiteliais e desempenham o papel crítico na morfogênese tecidual e embriogênese. Nos tecidos adultos, a regulação adequada das propriedades mecânicas da camada celular é crucial na manutenção da homeostase e na prevenção de respostas patológicas como progressão do tumor e metástase. O tamanho e o número de aderências focais dependem da força da adesão do substrato celular, enquanto a forma celular depende das forç...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	goat anti-rabbit, 1:500
Ammonium chloride	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
Collagen from calf skin	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
Junction plakoglobin	Cell Signaling	2309S	rabbit, 1:400
Laminar-flow cabinet class 2	Alpina		standard equipment
MCF7-basedHAX1KD cell line	Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019		MCF7 cell line withHAX1knockdown
MCF7 cell line (CONTROL)	ATCC	ATCC HTB-22	epithelial, adherent breast cancer cell line
Olympus CK2 light microscope	Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	rabbit, 1:250, Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
Phalloidin-TRITC conjugate	Sigma	P1951	1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST – NaCl	Sigma	S9888
TBST – Trizma base	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
Zeiss LSM800 Confocal microscope	Zeiss