Isolement, prolifération et différenciation des cellules souches adipeuses dérivées du macaque rhésus

Résumé

Dans cet article, nous décrivons l’isolement de cellules souches adipeuses dérivées de macaques rhésus (ADSC) à l’aide d’un protocole de digestion des tissus enzymatiques. Ensuite, nous décrivons la prolifération ADSC qui comprend le détachement cellulaire, le comptage et le placage. Enfin, la différenciation ADSC est décrite à l’aide d’agents inducteurs adipogènes spécifiques. De plus, nous décrivons des techniques de coloration pour confirmer la différenciation.

Résumé

Le tissu adipeux fournit une source riche et accessible de cellules souches multipotentes, capables de s’auto-renouveler. Ces cellules souches dérivées du tissu adipeux (ADSC) fournissent un système cellulaire ex vivo cohérent qui est fonctionnellement similaire à celui des adipocytes in vivo. L’utilisation des ADSC dans la recherche biomédicale permet l’investigation cellulaire de la régulation métabolique et de la fonction du tissu adipeux. La différenciation ADSC est nécessaire pour une expansion adéquate des adipocytes, et la différenciation sous-optimale est un mécanisme majeur de dysfonctionnement adipeux. Comprendre les changements dans la différenciation ADSC est crucial pour comprendre le développement du dysfonctionnement métabolique et de la maladie. Les protocoles décrits dans ce manuscrit, lorsqu’ils sont suivis, produiront des adipocytes matures qui peuvent être utilisés pour plusieurs tests fonctionnels in vitro afin d’évaluer la fonction métabolique de l’ADSC, y compris, mais sans s’y limiter, des tests mesurant l’absorption du glucose, la lipolyse, la lipogenèse et la sécrétion. Les macaques rhésus (Macaca mulatta) sont physiologiquement, anatomiquement et évolutivement similaires aux humains et, en tant que tels, leurs tissus et cellules ont été largement utilisés dans la recherche biomédicale et pour le développement de traitements. Ici, nous décrivons l’isolement ADSC à l’aide de tissu adipeux sous-cutané et omental frais obtenu à partir de macaques rhésus âgés de 4 à 9 ans. Les échantillons de tissu adipeux sont digérés par voie enzymatique dans de la collagénase suivie d’une filtration et d’une centrifugation pour isoler les CSDI de la fraction vasculaire stromale. Les ADSC isolés prolifèrent dans les milieux stromaux, suivis d’environ 14 à 21 jours de différenciation à l’aide d’un cocktail de 0,5 μg/mL de dexaméthasone, d’isobutylméthylxanthine 0,5 mM et de 50 μM d’indométacine dans un milieu stromal. Les adipocytes matures sont observés à environ 14 jours de différenciation. Dans ce manuscrit, nous décrivons les protocoles d’isolation, de prolifération et de différenciation ADSC in vitro. Bien que nous nous soyons concentrés sur les ADSC provenant du tissu adipeux du macaque rhésus, ces protocoles peuvent être utilisés pour le tissu adipeux obtenu à partir d’autres animaux avec des ajustements minimes.

Introduction

Le tissu adipeux est composé d’un mélange hétérogène de cellules, principalement des adipocytes matures et d’une fraction vasculaire stromale comprenant des fibroblastes, des cellules immunitaires et des cellules souches dérivées du tissu adipeux (CSDA)^1,2,3. Les ADSC primaires peuvent être isolés directement à partir du tissu adipeux blanc et stimulés pour se différencier en adipocytes, cartilage ou cellules osseuses⁴. Les ADSC présentent des caractéristiques classiques des cellules souches telles que le maintien de la multipotence in vitro et l’auto-renouvellement; et adhèrent au plastique en culture ^5,6. Les ADSC présentent un intérêt important pour l’utilisation en médecine régénérative en raison de leur multipotence et de leur capacité à être facilement récoltés en grandes quantités à l’aide de techniques non invasives⁷. La différenciation adipogénique des ADSC produit des cellules qui imitent fonctionnellement les adipocytes matures, y compris l’accumulation de lipides, l’absorption de glucose stimulée par l’insuline, la lipolyse et la sécrétion d’adipokine⁸. Leur ressemblance avec les adipocytes matures a conduit à l’utilisation généralisée des ADSC pour l’étude physiologique des caractéristiques cellulaires et de la fonction métabolique des adipocytes. Il y a de plus en plus de preuves à l’appui de l’idée que le développement de dysfonctionnements et de troubles métaboliques provient du niveau cellulaire ou tissulaire 9,10,11,12. Une différenciation ADSC optimale est nécessaire pour une expansion suffisante du tissu adipeux, une fonction adipocytaire appropriée et une régulation métabolique efficace¹³.

Les protocoles décrits dans ce manuscrit sont des techniques simples utilisant un équipement de laboratoire standard et des réactifs de base. Le manuscrit décrit d’abord le protocole d’isolement des CSDA primaires à partir de tissu adipeux frais par digestion mécanique et enzymatique. Ensuite, le protocole de prolifération et de passage des ADSC en milieu stromal est décrit. Enfin, le protocole de différenciation adipogénique des ADSC est décrit. Après différenciation, ces cellules peuvent être utilisées pour des études visant à mieux comprendre le métabolisme des adipocytes et les mécanismes de dysfonctionnement. Les protocoles de confirmation de la différenciation adipogénique et de détection des gouttelettes lipidiques à l’aide de l’huile rouge O et de la coloration bore-dipyrrométène (BODIPY) sont également décrits. Les détails de ces protocoles se sont concentrés sur les ADSC primaires isolées du tissu adipeux oval frais de macaques rhésus. Nous et d’autres avons utilisé ce protocole pour isoler avec succès les ADSC des dépôts de tissus adipeux sous-cutanés et omentaux du macaque rhésus^14,15. Pour la même quantité de tissu utilisée, nous avons observé que le tissu adipeux sous-cutané est plus dense, plus résistant et produit moins de cellules de la digestion par rapport au tissu adipeux omental. Ce protocole a également été utilisé pour isoler les CSDA à partir d’échantillons adipeux humains¹⁶.

Protocole

Tous les tissus et procédures obtenus ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université d’État de Louisiane et ont été effectués conformément aux directives du National Institute of Health (publication des NIH n ° 85-12, révisée en 1996).

1. Préparation des tampons et des solutions

1. Préparer une solution tampon saline tamponnée au 5-phosphate stérile (5-PBS) en ajoutant 5 % de pénicilline/streptomycine (stylo/streptocoque) et 0,25 μg/mL d’inhibiteur fongique à 1x PBS. Préparer une solution tampon de lavage 2-PBS stérile (2-PBS) en ajoutant 2% stylo/streptocoque et 0,25 μg/mL d’inhibiteur fongique dans 1x PBS. Les tampons de lavage peuvent être conservés à 4 °C pour une utilisation ultérieure et doivent être utilisés dans les 4 semaines.
   REMARQUE : Le tampon 5-PBS est utilisé pour la collecte de tissu adipeux et le lavage initial afin de minimiser la contamination possible, car les échantillons de tissus obtenus à l’autopsie sont prélevés dans un environnement non stérile.
2. Préparer un tampon de collagénase (CB) stérile en combinant 0,075 % de collagénase de type I (125 unités/mg d’activité), 2 % de stylo/streptocoque et 0,25 μg/mL d’inhibiteur fongique dans la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avec 1 % d’albumine sérique bovine. CB doit être utilisé dans un délai de 1 h.
3. Préparer le milieu de croissance ADSC stérile à l’aide d’un tampon α-MEM. Combiner 100 mL de sérum fœtal bovin (FBS), 5 mL de solution de L-glutamine 200 mM, 500 μL de 0,25 μg/mL d’inhibiteur fongique et 10 mL de solution stylo/streptocoque dans 394 mL de tampon α-MEM. Le milieu de croissance ADSC peut être conservé à 4 °C et doit être utilisé dans les 4 semaines.
   REMARQUE: L’inactivation thermique du FBS n’est pas nécessaire.
4. Préparer le milieu de différenciation ADSC stérile en combinant le milieu de croissance ADSC préparé ci-dessus et des agents d’induction pour atteindre une concentration finale de 0,5 μg/mL de dexaméthasone, 0,5 mM d’isobutylméthylxanthine et 50 μM d’indométacine.

2. Isolement ADSC

1. Préparation et digestion des tissus
   1. Pipeter ~10 ml de tampon 5-PBS dans quatre boîtes de culture cellulaire de 100 mm.
   2. Transférer ~50 g d’échantillon adipeux dans l’une des boîtes de 100 mm contenant du 5-PBS. Lavez l’échantillon de tissu adipeux recueilli quatre fois en le transférant séquentiellement sur les quatre boîtes de culture contenant du 5-PBS.
   3. Transférer l’échantillon adipeux dans une capsule de culture propre de 100 mm et hacher soigneusement le tissu adipeux à l’aide de ciseaux ou de deux scalpels stériles. Le hachage permet d’augmenter la surface pour une digestion enzymatique efficace et complète.
   4. Transférer le tissu adipeux haché dans un tube conique en plastique de 50 mL contenant 13 mL de CB (section de tissu de 1 à 3 cm par 15 mL de CB).
   5. Rincer la capsule de culture avec 2 mL de CB et transférer le milieu dans le tube conique en plastique de 50 mL.
      REMARQUE : À ce stade, il devrait y avoir un total de 15 mL de CB avec du tissu dans un tube conique en plastique de 50 mL.
   6. Pipeter plusieurs fois de haut en bas à l’aide d’une pipette sérologique de 25 ml pour faciliter la digestion mécanique des tissus.
   7. Incuber le tube conique en plastique de 50 ml contenant du tissu dans CB sur une bascule à vitesse moyenne à 37 °C pendant 30 à 60 minutes.
2. Placage ADSC pour la culture
   1. Ajouter 10 mL de milieu de croissance ADSC au tube de 50 mL contenant du tissu pour neutraliser l’activité enzymatique. Pipeter plusieurs fois de haut en bas à l’aide d’une pipette sérologique de 25 ml pour séparer les agrégats de tissu adipeux.
   2. Transférer la portion liquide dans un nouveau tube conique stérile de 50 mL en laissant les solides derrière. Lavez le tube original de 50 mL 3 fois avec ~7 mL de tampon 2-PBS et transférez la partie liquide dans le tube de 50 mL.
   3. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min pour obtenir une pastille cellulaire. Retirer délicatement autant de surnageant que possible à l’aide d’une pipette sérologique sans déranger la pastille cellulaire. Ne pas décanter.
   4. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de 1x tampon de lyse des globules rouges (GR) et incuber à température ambiante pendant 10 min. Ajouter 5 mL de milieu de croissance ADSC dans le tube et centrifuger à 500 x g pendant 5 min, puis retirer délicatement et jeter le surnageant.
   5. Ajouter 5 mL de milieu de croissance ADSC et centrifuger à 500 x g pendant 5 min pour laver la pastille cellulaire. Jetez le surnageant.
   6. Resuspendre la pastille dans 2 mL de milieu de croissance ADSC et filtrer à travers une crépine cellulaire de 70 μm dans un nouveau tube conique en plastique stérile de 50 mL.
   7. Rincer la crépine cellulaire avec 2 ml supplémentaires de milieu de croissance ADSC. Transférer 4 mL de la suspension contenant des CSDA du tube conique de 50 ml dans une boîte de culture stérile de 100 mm.
   8. Laver le tube conique de 50 ml 2 fois avec 3 mL de milieu de croissance ADSC et transférer le liquide dans la boîte de culture de 100 mm contenant des CSDA pour un total de 10 mL de milieu dans une capsule de culture.
   9. Visualisez les cellules sous un microscope inversé à un grossissement de 10x pour vérifier la présence de cellules flottantes dans le milieu, comme illustré à la figure 1A. Les cellules doivent être maintenues dans un incubateur de CO 2 à 37 °C à 5 % de CO₂ et 100 % d’humidité relative.
   10. Après 24 h, observez les cellules au microscope inversé pour vérifier l’adhérence des cellules. Aspirer le milieu de croissance ADSC de la plaque et le remplacer par 10 ml de milieu frais et chaud (37 °C). Retirez et remplacez le support toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 80 % à 90 % (Figure 1B).
       REMARQUE: Au moins 10 à 20% des cellules seront adhérentes à 24 heures. Vérifiez la culture cellulaire pour détecter des signes de contamination tels que la granularité cellulaire, la turbidité du milieu ou la croissance des spores. Une fois que les cellules sont confluentes à 80%, elles peuvent être récoltées pour la prolifération et la cryoconservation ou induites pour se différencier. Les ADSC peuvent être étendus à 4 à 6 passages avant de perdre leur capacité à proliférer ou à se différencier efficacement.

3. Prolifération de l’ADSC

1. Détachement de cellules
   1. Retirer le milieu de croissance ADSC à l’aide d’un aspirateur/pipette. Rincer les ADSC confluents 2 fois avec 2 mL de PBS stérile à température ambiante.
   2. Aspirer le PBS et ajouter 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % par plaque de culture de 100 mm. Assurez-vous que toute la surface est recouverte de trypsine.
   3. Incuber la plaque pendant ~7 min à 37 °C dans 5% de CO₂ jusqu’à ce que les ADSC soient détachés. Retirer la plaque de l’incubateur et déloger mécaniquement les cellules en pipotant avec force la solution de trypsine dans la plaque.
   4. Ajouter 2 mL de milieu de croissance ADSC aux cellules délogées et pipeter doucement pour mélanger. Transférer les cellules dans un tube conique en plastique stérile de 50 mL. Pour assurer une récupération cellulaire maximale, rincer la capsule de culture avec un autre 2 ml de milieu de croissance ADSC et transférer le milieu dans le tube conique contenant les cellules détachées.
   5. Centrifuger le tube conique de 50 mL à 500 x g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir une pastille cellulaire. Décanter soigneusement le surnageant sans déranger la pastille de cellule.
   6. Resuspendre la pastille cellulaire dans 5–6 mL de milieu de croissance ADSC par 1 x 10⁶ cellules.
2. Numération cellulaire et placage
   1. Dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, diluer 10 μL de solution cellulaire par le haut et 10 μL de solution de bleu de trypan à 0,04 % (0,4 % de bleu de trypan dilué 1:10 dans du PBS) et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
   2. Resuspendre le nombre souhaité d’ADSC dans le milieu de croissance. Pour une boîte de culture de 100 mm, plaquer ~3,0 x 10⁵ cellules dans un milieu de croissance ADSC de 10 ml pour permettre une confluence de 80 % en 72 h ou une confluence de 100 % en 96 h.
   3. Visualisez la capsule sous un microscope inversé à un grossissement de 10x avant l’incubation pour vous assurer de la présence de cellules en suspension. Maintenir les cellules à 37 °C à 5 % de CO₂ et 100 % d’humidité relative.
   4. Toutes les 48 heures, aspirer le milieu de croissance et le remplacer par un milieu chaud (37 °C) jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 80 % à 90 %, comme le montre la figure 1B.
   5. Répétez les étapes des sections 3.1 et 3.2 pour obtenir le nombre approprié de passages afin d’obtenir le numéro de cellule souhaité.
      NOTE: Après les passages 5 à 6, les cellules primaires semblent subir une sénescence; Par conséquent, visez à obtenir les nombres de cellules souhaités par le passage 4.

4. Différenciation adipogénique ADSC

1. Aspirer le milieu de croissance des ADSC à partir d’ADSC adhérents qui ont atteint une confluence de 80% à 90%.
2. Rincez rapidement la couche cellulaire ADSC avec du PBS stérile à température ambiante.
3. Ajouter un support de différenciation ADSC. Pour une boîte de culture de 100 mm, ajouter 10 ml de milieu de différenciation ADSC.
4. Remplacer le milieu tous les 3 jours pendant environ 14 à 21 jours. Les adipocytes matures sont généralement observés après 14 jours de différenciation.
5. Examiner les cellules au microscope à lumière inversée à un grossissement de 40x pour confirmer la présence de gouttelettes lipidiques, comme le montre la figure 2A.

5. Détection des adipocytes

REMARQUE : Cette section décrit les protocoles de coloration utilisés pour la détection des gouttelettes lipidiques dans les adipocytes différenciés, mais la coloration immunofluorescente pour CD105, un marqueur de cellules souches mésenchymateuses, peut également être utilisée pour la confirmation ADSC.

1. Coloration Oil Red O
   1. Préparer la solution mère d’Oil Red O à 0,5% dans de l’isopropanol. Pour 20 ml de solution mère d’Oil Red O, dissoudre 100 mg d’Oil Red O dans 20 mL d’isopropanol. Filtrer la solution à travers un filtre à seringue stérile avec membrane de 0,2 μm.
   2. Aspirez soigneusement le milieu de différenciation et lavez les cellules 2 fois en ajoutant du PBS le long des côtés du puits pour ne pas perturber la monocouche cellulaire.
   3. Aspirer soigneusement le PBS des cellules et ajouter suffisamment de formol tamponné neutre (FBN, 10%) pour couvrir la couche cellulaire. Incuber à température ambiante pendant 30 à 60 min.
   4. Pendant l’étape de fixation du formol, préparer la solution de travail Oil Red O en diluant 3 parties de solution mère Oil Red O avec 2 parties d’eau distillée. Mélanger la solution et filtrer à travers un filtre à seringue stérile avec une membrane de 0,2 μm. La solution de travail est stable jusqu’à 2 h.
   5. Aspirer soigneusement NBF et laver rapidement (~ 15 s) la couche cellulaire avec de l’eau distillée. Ajouter suffisamment d’isopropanol à 60% pour couvrir la couche cellulaire après avoir aspiré de l’eau et incuber à température ambiante pendant 5 min.
   6. Aspirer soigneusement l’isopropanol après 5 minutes d’incubation et ajouter suffisamment de solution de travail Oil Red O pour couvrir la couche cellulaire et incuber à température ambiante pendant 10 à 15 minutes.
   7. Aspirez soigneusement la solution de travail Oil Red O et lavez la couche cellulaire plusieurs fois avec de l’eau distillée jusqu’à ce que l’eau devienne claire.
   8. Ajouter du PBS à la boîte de culture cellulaire et examiner les cellules au microscope inversé pour indiquer la différenciation et la présence de gouttelettes lipidiques (Figure 2B).
2. Coloration BODIPY
   1. Préparer la solution mère BODIPY 5 mM en dissolvant 1,3 g de BODIPY dans 1 mL de DMSO. Préparer la solution de travail BODIPY à 2 μg/mL en diluant la solution mère 1:25 000 fois dans du PBS.
   2. Aspirez soigneusement le milieu de différenciation et lavez les cellules 2 fois en ajoutant du PBS le long des côtés du puits pour ne pas perturber la monocouche cellulaire.
   3. Aspirer soigneusement le PBS et ajouter suffisamment de solution de travail BODIPY pour couvrir la couche cellulaire et incuber à 37 °C pendant 30 min.
      REMARQUE: À partir de ce point, protégez les cellules de la lumière en recouvrant la plaque de papier d’aluminium.
   4. Aspirez soigneusement la solution de travail BODIPY et lavez la couche cellulaire 3 fois avec du PBS.
   5. Fixer les cellules en ajoutant 4% de paraformaldéhyde et en les incubant à température ambiante pendant 15 min.
   6. Aspirez soigneusement le tampon de fixation et lavez les cellules 2 fois en ajoutant du PBS le long des côtés du puits pour ne pas déranger la monocouche cellulaire.
   7. Ajouter du PBS à la boîte de culture cellulaire et examiner les cellules au microscope fluorescent inversé pour détecter la différenciation et la présence de gouttelettes lipidiques (figure 2C). Cellules d’image à l’aide d’un jeu de filtres FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO Chroma. La longueur d’onde d’excitation est à 480 nm avec une largeur de bande de 40 nm et la longueur d’onde d’émission est à 535 nm avec une largeur de bande de 50 nm. Un ensemble de filtres similaire ou approprié et un microscope peuvent être utilisés.

Résultats

Les ADSC isolés à partir d’échantillons de tissus adipeux de macaque rhésus ont été ensemencés sur des plaques de culture et sont illustrés à la figure 1. Le jour du placage, les cellules ne sont pas adhérentes et flottent dans la boîte de culture, comme le montre la figure 1A. Dans les 72 heures, les ADSC deviendront confluents à 80 % et seront prêts pour la différenciation des adipocytes (Figure 1B). Les ADSC prés...

Discussion

Les protocoles d’isolation, de prolifération et de différenciation ADSC sont simples et reproductibles, mais ils nécessitent une technique minutieuse pour assurer une isolation adéquate, une expansion saine et une différenciation efficace. Un environnement de travail stérile est essentiel pour toutes les expériences de culture cellulaire. Des bactéries ou des champignons peuvent être introduits dans les cultures cellulaires par des outils, des milieux ou un environnement de travail contaminés. La contaminatio...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 % trypan blue	Thermo-Fisher	15250061
1.5-ml microcentrifuge tube	Dot Scientific	707-FTG
100 % isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1838-P
100-mm cell culture dish	Corning	430167
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018
50-mL plastic conical tube	Fisher Scientific	50-465-232
70-µm cell strainer	Corning	CLS431751
a-MEM	Thermo-Fisher	12561056
Aluminum foil	Reynolds Wrap
BODIPY	Thermo-Fisher	D3922
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	05470
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Collagenase, Type I	Thermo-Fisher	17100017
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma-Aldrich	D2915
Dimethyl sulfoxide, DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Distilled water	Thermo-Fisher	15230162
Fetal Bovine Serum, USDA-approved	Sigma-Aldrich	F0926
Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL)	Thermo-Fisher	15290018
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo-Fisher	14175095
Hemacytometer with cover slip	Sigma-Aldrich	Z359629
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378
Inverted light microscope	Nikon	DIAPHOT-TMD
L-glutamine (200 mM)	Thermo-Fisher	25030081
Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz	Reliable Scientific	Model 55 Rocking
Neutral buffered formalin (10 %)	Pharmco	8BUFF-FORM
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625
Paraformeldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo-Fisher	15140122
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo-Fisher	10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer	Qiagen	158904
Serological pipettes, 2 to 25 mL	Costar Stripettes
Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2	Sanyo	MCO-17AIC
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo-Fisher	25200056