붉은털원숭이 지방유래 줄기세포의 분리, 증식 및 분화

요약

이 기사에서는 효소 조직 소화 프로토콜을 사용하여 붉은털 원숭이 유래 지방 유래 줄기 세포(ADSC)의 분리에 대해 설명합니다. 다음으로, 세포 분리, 계수 및 도금을 포함하는 ADSC 증식에 대해 설명합니다. 마지막으로, ADSC 분화는 특정 지방 생성 유도제를 사용하여 설명됩니다. 또한 차별화를 확인하기 위한 염색 기술을 설명합니다.

초록

지방 조직은 자가 재생이 가능한 풍부하고 접근 가능한 다능성 줄기 세포 공급원을 제공합니다. 이러한 지방 유래 줄기 세포 (ADSC)는 생체 내 지방 세포와 기능적으로 유사한 일관된 생체 외 세포 시스템을 제공합니다. 생물 의학 연구에서 ADSC를 사용하면 지방 조직 대사 조절 및 기능에 대한 세포 조사가 가능합니다. ADSC 분화는 적절한 지방세포 확장을 위해 필요하며, 차선의 분화는 지방 기능 장애의 주요 메커니즘입니다. ADSC 분화의 변화를 이해하는 것은 대사 기능 장애 및 질병의 발병을 이해하는 데 중요합니다. 이 원고에 설명 된 프로토콜을 따를 때 포도당 섭취, 지방 분해, 지방 생성 및 분비를 측정하는 분석을 포함하되 이에 국한되지 않는 ADSC 대사 기능을 평가하기위한 여러 시험관 내 기능 테스트에 사용할 수있는 성숙한 지방 세포를 산출 할 것입니다. 붉은털 원숭이( Macaca mulatta) 는 생리학적, 해부학적, 진화적으로 인간과 유사하므로 그들의 조직과 세포는 생물 의학 연구 및 치료법 개발에 광범위하게 사용되었습니다. 여기에서는 4-9 세의 붉은 털 원숭이에서 얻은 신선한 피하 및 안타 지방 조직을 사용하여 ADSC 분리를 설명합니다. 지방 조직 샘플은 콜라게나제에서 효소적으로 분해된 후 여과 및 원심분리하여 기질 혈관 분획에서 ADSC를 분리합니다. 분리된 ADSC는 기질 배지에서 증식한 후 기질 배지에서 0.5μg/mL 덱사메타손, 0.5mM 이소부틸 메틸크산틴 및 50μM 인도메타신의 칵테일을 사용하여 약 14-21일 동안 분화합니다. 성숙한 지방 세포는 분화 약 14 일에 관찰됩니다. 이 원고에서는 ADSC 분리, 증식 및 시험관 내 분화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 붉은털 원숭이 지방 조직의 ADSC에 초점을 맞추었지만 이러한 프로토콜은 최소한의 조정으로 다른 동물로부터 얻은 지방 조직에 활용할 수 있습니다.

서문

지방 조직은 세포, 주로 성숙한 지방 세포 및 섬유 아세포, 면역 세포 및 지방 유래 줄기 세포 (ADSC)를 포함한 기질 혈관 분획의 이질적인 혼합물로 구성됩니다 ^1,2,3. 1 차 ADSC는 백색 지방 조직에서 직접 분리되고 지방 세포, 연골 또는 뼈 세포로 분화하도록 자극 될 수 있습니다⁴. ADSC는 시험관 내 다능성 유지 및자가 재생과 같은 고전적인 줄기 세포 특성을 나타냅니다. 그리고 문화에서 플라스틱을 고수합니다 ^5,6. ADSC는 다분화능과 비침습^{적 기술을 사용하여} 대량으로 쉽게 수확할 수 있는 능력으로 인해 재생 의학에 사용되는 데 중요한 관심사입니다7. ADSC의 지방생성 분화는 지질 축적, 인슐린 자극 포도당 흡수, 지방 분해 및 아디포카인 분비8를 포함하는 성숙한 지방세포를 기능적으로 모방하는 세포를^{생성합니다.} 성숙한 지방 세포와의 유사성은 지방 세포의 세포 특성 및 대사 기능의 생리 학적 조사를 위해 ADSC의 광범위한 사용으로 이어졌습니다. 대사 기능 장애 및 장애의 발달이 세포 또는 조직 수준 9,10,11,12에서 시작된다는 생각을 뒷받침하는 증거가 증가하고 있습니다. 최적의 ADSC 분화는 충분한 지방 조직 확장, 적절한 지방 세포 기능 및 효과적인 대사 조절을 위해 필요합니다¹³.

이 원고에 설명 된 프로토콜은 표준 실험실 장비와 기본 시약을 사용하는 간단한 기술입니다. 원고는 먼저 기계적 및 효소 적 소화를 사용하여 신선한 지방 조직에서 1 차 ADSC를 분리하기위한 프로토콜을 설명합니다. 다음으로, 기질 매질에서 ADSC의 증식 및 계대에 대한 프로토콜이 설명된다. 마지막으로, ADSC의 지방 생성 분화를위한 프로토콜이 설명된다. 분화 후, 이러한 세포는 지방 세포 대사 및 기능 장애 메커니즘을 더 잘 이해하기위한 연구에 사용될 수 있습니다. 오일 레드 O 및 붕소-디피로메텐(BODIPY) 염색을 사용한 지방생성 분화 및 지질 액적 검출의 확인을 위한 프로토콜이 또한 기재되어 있다. 이 프로토콜의 세부 사항은 붉은 털 원숭이의 신선한 omental 지방 조직에서 분리 된 1 차 ADSC에 중점을 두었습니다. 우리와 다른 사람들은 이 프로토콜을 사용하여 붉은털 원숭이 피하 및 안달 지방 조직 저장소^14,15에서 ADSC를 성공적으로 분리했습니다. 사용 된 동일한 양의 조직에 대해, 우리는 피하 지방 조직이 omental 지방 조직에 비해 더 조밀하고 단단하며 소화에서 더 적은 세포를 생성한다는 것을 관찰했습니다. 이 프로토콜은 또한 인간 지방 샘플(¹⁶)로부터 ADSC를 단리하는데 사용되었다.

프로토콜

획득 된 모든 조직 및 절차는 루이지애나 주립 대학 건강 과학 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 국립 보건원 (NIH 간행물 번호 85-12, 1996 년 개정)의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 완충액 및 용액의 제조

1. 5x PBS에 5% 페니실린/스트렙토마이신(pen/strep) 및 0.25μg/mL의 진균 억제제를 추가하여 멸균 5-인산염 완충 식염수 세척 완충액(1-PBS) 용액을 준비합니다. 1x PBS에 2% 펜/스트렙 및 0.25μg/mL의 진균 억제제를 추가하여 멸균 2-PBS 세척 완충액(2-PBS) 용액을 준비합니다. 세척 완충액은 향후 사용을 위해 4°C에서 보관할 수 있으며 4주 이내에 사용해야 합니다.
   참고: 5-PBS 버퍼는 부검 시 얻은 조직 샘플이 비멸균 환경에서 수집되므로 가능한 오염을 최소화하기 위해 지방 조직 수집 및 초기 세척에 사용됩니다.
2. 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)에 0.075 % 콜라게나제 유형 I (125 단위 / mg 활성), 2 % 펜 / 연쇄상 구균 및 0.25 μg / mL의 곰팡이 억제제를 1 % 소 혈청 알부민과 결합하여 멸균 콜라게나제 완충액 (CB)을 준비합니다. CB는 1 시간 이내에 사용해야합니다.
3. α-MEM 완충액을 사용하여 멸균 ADSC 성장 배지를 준비합니다. 소 태아 혈청(FBS) 100mL, 200mM L-글루타민 용액 5mL, 진균 억제제 0.25μg/mL 500μL 및 펜/연쇄상 구균 용액 10mL를 α-MEM 완충액 394mL에 결합합니다. ADSC 성장 배지는 4 ° C에서 보관할 수 있으며 4 주 이내에 사용해야합니다.
   참고: FBS의 열 비활성화는 필요하지 않습니다.
4. 0.5μg/mL 덱사메타손, 0.5mM 이소부틸메틸크산틴 및 50μM 인도메타신의 최종 농도를 달성하기 위해 위에서 준비한 ADSC 성장 배지와 유도제를 결합하여 멸균 ADSC 분화 배지를 준비합니다.

2. ADSC 절연

1. 조직 준비 및 소화
   1. ~10mL의 5-PBS 버퍼를 4개의 100mm 세포 배양 접시에 피펫팅합니다.
   2. ~50g의 지방 샘플을 5-PBS가 포함된 100mm 접시 중 하나에 옮깁니다. 수집된 지방 조직 샘플을 5-PBS가 포함된 4개의 배양 접시에 순차적으로 옮겨 4회 세척한다.
   3. 지방 샘플을 깨끗한 100mm 배양 접시에 옮기고 가위 또는 두 개의 멸균 메스를 사용하여 지방 조직을 철저히 다집니다. Mincing은 효율적이고 완전한 효소 소화를 위해 표면적을 증가시킵니다.
   4. 다진 지방 조직을 13mL의 CB(CB 15mL당 조직의 1-3cm 섹션)가 들어 있는 50mL 플라스틱 원추형 튜브로 옮깁니다.
   5. 배양 접시를 2mL의 CB로 헹구고 배지를 50mL 플라스틱 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
      알림: 이 시점에서 15mL 플라스틱 원추형 튜브에 조직이 있는 총 50mL의 CB가 있어야 합니다.
   6. 기계적 조직 소화를 촉진하기 위해 25mL 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 여러 번 피펫을 위아래로 피펫합니다.
   7. CB의 조직이 들어있는 50mL 플라스틱 원추형 튜브를 로커의 로커에서 37-30-60 분 동안 중간 속도로 배양합니다.
2. 배양용 ADSC 도금
   1. 효소 활성을 중화하기 위해 조직이 들어 있는 50mL 튜브에 ADSC 성장 배지 10mL를 추가합니다. 지방 조직 응집체를 분리하기 위해 25mL 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 여러 번 피펫팅합니다.
   2. 액체 부분을 고체를 남기고 새로운 멸균 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 원래 50mL 튜브를 ~7mL의 2-PBS 버퍼로 3번 세척하고 액체 부분을 50mL 튜브로 옮깁니다.
   3. 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 얻었다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 혈청 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 상청액을 조심스럽게 제거하십시오. 디캔트하지 마십시오.
   4. 1x 적혈구(RBC) 용해 완충액 1mL에 세포 펠릿을 재현탁하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 5mL의 ADSC 성장 배지를 튜브에 넣고 500 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상청액을 조심스럽게 제거하고 버립니다.
   5. 5mL의 ADSC 성장 배지를 추가하고 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 세척합니다. 상청액을 폐기하십시오.
   6. 펠릿을 ADSC 성장 배지 2mL에 재현탁하고 70μm 세포 여과기를 통해 새로운 멸균 50mL 플라스틱 원뿔형 튜브에 여과합니다.
   7. 추가 2mL의 ADSC 성장 배지로 세포 여과기를 헹굽니다. ADSC가 함유된 현탁액 4mL를 50mL 원뿔형 튜브에서 멸균된 100mm 배양 접시로 옮깁니다.
   8. 50mL 원뿔형 튜브를 3mL의 ADSC 성장 배지로 2회 세척하고 배양 접시에 총 10mL의 배지에 대해 ADSC가 포함된 100mm 배양 접시에 액체를 옮깁니다.
   9. 도립 현미경으로 세포를 10배 배율로 보고 그림 1A와 같이 배지에 부유 세포가 있는지 확인합니다. 세포는 5% CO2 및 100% 상대 습도에서 37°C의_CO2 배양기에서 유지되어야 한다.
   10. 24시간 후 도립 현미경으로 세포를 관찰하여 세포 부착을 확인합니다. 플레이트에서 ADSC 성장 배지를 흡인하고 10mL의 신선하고 따뜻한(37°C) 배지로 교체합니다. 세포가 80%–90% 합류할 때까지 48시간마다 미디어를 제거하고 교체합니다(그림 1B).
       참고: 최소 10-20%의 세포가 24시간까지 부착됩니다. 세포 배양에서 세포 입도, 배지의 탁도 또는 포자의 성장과 같은 오염 징후가 있는지 확인하십시오. 세포가 80% 합류하면 증식 및 동결보존을 위해 수확하거나 분화를 유도할 수 있습니다. ADSC는 효율적으로 증식하거나 분화하는 능력을 잃기 전에 4-6 개의 계대로 확장 될 수 있습니다.

3. ADSC 확산

1. 세포 분리
   1. 흡인기/피펫을 사용하여 ADSC 성장 배지를 제거합니다. 2mL의 멸균된 실온 PBS로 합류 ADSC를 2번 헹굽니다.
   2. PBS를 흡인하고 100mm 배양 접시당 0.25% 트립신-EDTA 2mL를 추가합니다. 전체 표면적이 트립신으로 덮여 있는지 확인하십시오.
   3. ADSC가 분리될 때까지 플레이트를 37%_CO2 에서 37°C에서 ~7분 동안 인큐베이션합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 플레이트의 트립신 용액을 강제로 피펫팅하여 기계적으로 세포를 제거합니다.
   4. 제거된 세포에 ADSC 성장 배지 2mL를 추가하고 부드럽게 피펫하여 혼합합니다. 세포를 멸균 된 50mL 플라스틱 원추형 튜브로 옮깁니다. 최대 세포 회복을 보장하려면 배양 접시를 다른 2mL의 ADSC 성장 배지로 헹구고 분리된 세포가 들어 있는 원추형 튜브로 배지를 옮깁니다.
   5. 50mL 원뿔형 튜브를 500 x g 에서 실온에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 얻습니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 디캔팅합니다.
   6. 1 x 10⁶ 세포당 5–6mL의 ADSC 성장 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
2. 세포 수 및 도금
   1. 1.5mL 미세 원심분리 튜브에서 위의 세포 용액 10μL와 0.04% 트리판 블루 용액 10μL(PBS에서 1:10으로 희석된 0.4% 트리판 블루)를 희석하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
   2. 성장 배지에서 원하는 수의 ADSC를 다시 일시 중단합니다. 100mm 배양 접시의 경우 10mL ADSC 성장 배지에 ~3.0 x 10⁵ 개의 세포를 플레이트하여 72시간 내에 80% 합류 또는 96시간 내에 100% 컨플루언스를 허용합니다.
   3. 부유 세포의 존재를 확인하기 위해 배양하기 전에 10x 배율로 도립 현미경으로 접시를 봅니다. 세포를 5%_CO2 및 100% 상대 습도에서 37°C로 유지한다.
   4. 48시간마다 성장 배지를 흡인하고 그림 1B와 같이 세포가 80%에서 90% 합류할 때까지 따뜻한(37°C) 배지로 교체합니다.
   5. 원하는 셀 번호를 얻기 위해 적절한 수의 계대 수에 대해 섹션 3.1 및 3.2의 단계를 반복합니다.
      참고: 계대 5에서 6 후, 일차 세포는 노화를 겪는 것으로 보입니다. 따라서 4 번 통로까지 원하는 세포 번호를 얻는 것을 목표로하십시오.

4. ADSC 지방 분화

1. 80 %에서 90 % 합류에 도달 한 부착 된 ADSC에서 ADSC 성장 배지를 흡인합니다.
2. ADSC 세포층을 멸균된 실온 PBS로 빠르게 헹굽니다.
3. ADSC 분화 배지를 추가합니다. 100mm 배양 접시의 경우 ADSC 분화 배지 10mL를 추가합니다.
4. 약 14-21일 동안 3일마다 배지를 교체하십시오. 성숙한 지방 세포는 일반적으로 분화 14 일 후에 관찰됩니다.
5. 도립 광학 현미경으로 세포를 40x 배율로 검사하여 그림 2A와 같이 지질 액적의 존재를 확인합니다.

5. 지방 세포 검출

참고: 이 섹션에서는 분화된 지방세포에서 지질 액적 검출에 사용되는 염색 프로토콜에 대해 설명하지만 중간엽 줄기세포 마커인 CD105에 대한 면역형광 염색도 ADSC 확인에 사용할 수 있습니다.

1. 오일 레드 O 염색
   1. 이소프로판올에 0.5 % 오일 레드 O 원액을 준비하십시오. 오일 레드 O 원액 20mL의 경우 오일 레드 O 100mg을 이소프로판올 20mL에 녹입니다. 0.2 μm 멤브레인이있는 멸균 주사기 필터를 통해 용액을 여과합니다.
   2. 분화 배지를 조심스럽게 흡인하고 세포 단층을 방해하지 않도록 웰의 측면을 따라 PBS를 첨가하여 세포를 2회 세척합니다.
   3. 세포에서 PBS를 조심스럽게 흡인하고 세포층을 덮기에 충분한 중성 완충 포르말린 (NBF, 10 %)을 첨가하십시오. 실온에서 30-60 분 동안 배양하십시오.
   4. 포르말린 고정 단계 동안, 오일 레드 O 원액 3 부를 증류수 2 부로 희석하여 오일 레드 O 작업 용액을 준비한다. 용액을 혼합하고 0.2 μm 멤브레인이있는 멸균 주사기 필터를 통해 여과합니다. 작업 용액은 최대 2 시간 동안 안정적입니다.
   5. 조심스럽게 NBF를 흡인하고 증류수로 세포층을 빠르게 세척 (~ 15 초)합니다. 물을 흡인 한 후 세포층을 덮을 수있는 충분한 60 % 이소프로판올을 추가하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
   6. 5 분 배양 후 이소프로판올을 조심스럽게 흡입하고 세포층을 덮을 수있는 충분한 Oil Red O 작업 용액을 추가하고 실온에서 10-15 분 동안 배양합니다.
   7. Oil Red O 작업 용액을 조심스럽게 흡인하고 물이 깨끗해질 때까지 증류수로 세포층을 여러 번 씻으십시오.
   8. 세포 배양 접시에 PBS를 넣고 도립 현미경으로 세포를 검사하여 분화 및 지질 방울의 존재를 나타냅니다(그림 2B).
2. 보디피 염색
   1. 1.3g의 보디피를 1mL의 DMSO에 용해시켜 5mM 보디피 원액을 제조한다. 원액을 PBS에서 1:25,000배 희석하여 2μg/mL BODIPY 작업 용액을 준비합니다.
   2. 분화 배지를 조심스럽게 흡인하고 세포 단층을 방해하지 않도록 웰의 측면을 따라 PBS를 첨가하여 세포를 2회 세척합니다.
   3. PBS를 조심스럽게 흡인하고 세포층을 덮을 만큼 충분한 BODIPY 작업 용액을 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
      알림: 이 시점부터 호일로 판을 덮어 빛으로부터 세포를 보호하십시오.
   4. BODIPY 작업 용액을 조심스럽게 흡인하고 PBS로 세포층을 3 번 세척하십시오.
   5. 4% 파라포름알데히드를 첨가하고 실온에서 15분 동안 배양하여 세포를 고정합니다.
   6. 고정 완충액을 조심스럽게 흡인하고 세포 단층을 방해하지 않도록 웰의 측면을 따라 PBS를 추가하여 세포를 2회 세척합니다.
   7. 세포 배양 접시에 PBS를 넣고 도립 형광 현미경으로 세포를 검사하여 분화 증거와 지질 방울의 존재를 확인합니다(그림 2C). FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO 크로마 필터 세트를 사용한 이미지 셀. 여기 파장은 40nm의 밴드 폭으로 480nm이고 방출 파장은 50nm의 대역폭으로 535nm입니다. 유사하거나 적절한 필터 세트 및 현미경이 사용될 수 있다.

결과

붉은털 원숭이 지방 조직 샘플에서 분리된 ADSC를 배양 플레이트에 시딩하고 그림 1에 나타내었다. 플레이팅 당일에, 세포는 비부착성이고 도 1A에 도시된 바와 같이 배양 접시에 부유한다. 72시간 이내에 ADSC는 80% 합류하여 지방세포 분화 준비가 됩니다(그림 1B). ADSC는 화학적 유도 후 강한 지방 생성 특성을 나타냅니다. 분화 14일 ?...

토론

ADSC 분리, 증식 및 분화 프로토콜은 간단하고 재현 가능하지만 적절한 분리, 건강한 확장 및 효율적인 차별화를 보장하기 위해 신중한 기술이 필요합니다. 멸균 작업 환경은 모든 세포 배양 실험에 매우 중요합니다. 박테리아 또는 곰팡이는 오염된 도구, 배지 또는 작업 환경을 통해 세포 배양에 도입될 수 있습니다. 곰팡이 오염은 배양 물에서 포자 성장으로 표시되는 반면 박테리아 오염은 배지?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 % trypan blue	Thermo-Fisher	15250061
1.5-ml microcentrifuge tube	Dot Scientific	707-FTG
100 % isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1838-P
100-mm cell culture dish	Corning	430167
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018
50-mL plastic conical tube	Fisher Scientific	50-465-232
70-µm cell strainer	Corning	CLS431751
a-MEM	Thermo-Fisher	12561056
Aluminum foil	Reynolds Wrap
BODIPY	Thermo-Fisher	D3922
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	05470
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Collagenase, Type I	Thermo-Fisher	17100017
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma-Aldrich	D2915
Dimethyl sulfoxide, DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Distilled water	Thermo-Fisher	15230162
Fetal Bovine Serum, USDA-approved	Sigma-Aldrich	F0926
Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL)	Thermo-Fisher	15290018
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo-Fisher	14175095
Hemacytometer with cover slip	Sigma-Aldrich	Z359629
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378
Inverted light microscope	Nikon	DIAPHOT-TMD
L-glutamine (200 mM)	Thermo-Fisher	25030081
Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz	Reliable Scientific	Model 55 Rocking
Neutral buffered formalin (10 %)	Pharmco	8BUFF-FORM
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625
Paraformeldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo-Fisher	15140122
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo-Fisher	10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer	Qiagen	158904
Serological pipettes, 2 to 25 mL	Costar Stripettes
Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2	Sanyo	MCO-17AIC
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo-Fisher	25200056