Isolamento, Proliferação e Diferenciação de Células-Tronco Derivadas de Adiposos de Macacos Rhesus

Resumo

Neste artigo, descrevemos o isolamento de células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs) derivadas de macacos rhesus usando um protocolo de digestão de tecido enzimático. Em seguida, descrevemos a proliferação de ADSC, que inclui descolamento, contagem e chapeamento celular. Por fim, a diferenciação do ADSC é descrita usando agentes indutores adipogênicos específicos. Além disso, descrevemos técnicas de coloração para confirmar a diferenciação.

Resumo

O tecido adiposo fornece uma fonte rica e acessível de células-tronco multipotentes, que são capazes de se auto-renovar. Essas células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs) fornecem um sistema celular ex vivo consistente que é funcionalmente semelhante ao dos adipócitos in vivo. O uso de ADSCs em pesquisas biomédicas permite a investigação celular da regulação e função metabólica do tecido adiposo. A diferenciação ADSC é necessária para a expansão adequada dos adipócitos, e a diferenciação subótima é um dos principais mecanismos da disfunção adiposa. Compreender as mudanças na diferenciação da ADSC é crucial para entender o desenvolvimento de disfunção metabólica e doença. Os protocolos descritos neste manuscrito, quando seguidos, produzirão adipócitos maduros que podem ser usados para vários testes funcionais in vitro para avaliar a função metabólica da ADSC, incluindo, entre outros, ensaios que medem a captação de glicose, lipólise, lipogênese e secreção. Os macacos Rhesus (Macaca mulatta) são fisiologicamente, anatomicamente e evolutivamente semelhantes aos seres humanos e, como tal, seus tecidos e células têm sido amplamente utilizados em pesquisas biomédicas e para o desenvolvimento de tratamentos. Aqui, descrevemos o isolamento do ADSC usando tecido adiposo subcutâneo e omental fresco obtido de macacos rhesus de 4 a 9 anos de idade. Amostras de tecido adiposo são digeridas enzimaticamente em colagenase seguidas de filtração e centrifugação para isolar ADSCs da fração vascular estromal. ADSCs isolados são proliferados em meio estromal seguidos por aproximadamente 14-21 dias de diferenciação usando um coquetel de 0,5 μg/mL de dexametasona, 0,5 mM de isobutilmetilxantina e 50 μM de indometacina em meio estromal. Os adipócitos maduros são observados em aproximadamente 14 dias de diferenciação. Neste manuscrito, descrevemos protocolos para isolamento, proliferação e diferenciação de ADSC in vitro. Embora tenhamos nos concentrado em ADSCs do tecido adiposo de macacos rhesus, esses protocolos podem ser utilizados para tecido adiposo obtido de outros animais com ajustes mínimos.

Introdução

O tecido adiposo é composto por uma mistura heterogênea de células, adipócitos predominantemente maduros e uma fração vascular estromal, incluindo fibroblastos, células imunes e células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs)^1,2,3. As ADSCs primárias podem ser isoladas diretamente do tecido adiposo branco e estimuladas a se diferenciar em adipócitos, cartilagens ou células ósseas⁴. Os ADSCs exibem características clássicas de células-tronco, como manutenção da multipotência in vitro e auto-renovação; e são aderentes ao plástico na cultura ^5,6. Os ADSCs são de importante interesse para o uso em medicina regenerativa devido à sua multipotência e capacidade de serem facilmente colhidos em grandes quantidades utilizando técnicas não invasivas⁷. A diferenciação adipogênica de ADSCs produz células que imitam funcionalmente adipócitos maduros, incluindo acúmulo de lipídios, captação de glicose estimulada por insulina, lipólise e secreção de adipocinas⁸. Sua semelhança com adipócitos maduros levou ao uso generalizado de ADSCs para investigação fisiológica das características celulares e função metabólica dos adipócitos. Há evidências crescentes que apoiam a ideia de que o desenvolvimento de disfunção metabólica e distúrbios se origina no nível celular ou tecidual 9,10,11,12. A diferenciação ideal do ADSC é necessária para expansão suficiente do tecido adiposo, função adequada dos adipócitos e regulação metabólica efetiva¹³.

Os protocolos descritos neste manuscrito são técnicas simples que utilizam equipamentos de laboratório padrão e reagentes básicos. O manuscrito descreve primeiramente o protocolo para o isolamento de ADSCs primários do tecido adiposo fresco usando digestão mecânica e enzimática. A seguir, descreve-se o protocolo de proliferação e passagem de ADSCs em meio estromal. Por fim, descreve-se o protocolo de diferenciação adipogênica de ADSCs. Após a diferenciação, essas células podem ser usadas para estudos para entender melhor o metabolismo dos adipócitos e os mecanismos de disfunção. Os protocolos para confirmação da diferenciação adipogênica e detecção de gotículas lipídicas utilizando coloração Oil Red O e boro-dipirrometeno (BODIPY) também são descritos. Os detalhes desses protocolos se concentraram em ADSCs primários isolados do tecido adiposo omental fresco de macacos rhesus. Nós e outros temos utilizado esse protocolo para isolar com sucesso os ADSCs dos depósitos de tecido adiposo subcutâneo e omental de macacos rhesus^14,15. Para a mesma quantidade de tecido utilizado, observamos que o tecido adiposo subcutâneo é mais denso, mais resistente e produz menos células da digestão em comparação com o tecido adiposo omental. Esse protocolo também tem sido utilizado para isolar ADSCs de amostras adiposas humanas¹⁶.

Protocolo

Todos os tecidos e procedimentos obtidos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Centro de Ciências da Saúde da Louisiana State University e foram realizados de acordo com as diretrizes do Instituto Nacional de Saúde (publicação do NIH No. 85-12, revisada em 1996).

1. Preparação de tampões e soluções

1. Preparar solução estéril de lavagem salina tamponada com 5-fosfato (5-PBS) adicionando 5% de penicilina/estreptomicina (pen/estreptopsia) e 0,25 μg/mL de inibidor fúngico a 1x PBS. Preparar solução estéril de tampão de lavagem 2-PBS (2-PBS) adicionando 2% de caneta/estreptococo e 0,25 μg/mL de inibidor fúngico em 1x PBS. Os tampões de lavagem podem ser armazenados a 4 °C para utilização futura e devem ser utilizados no prazo de 4 semanas.
   NOTA: O tampão 5-PBS é usado para coleta de tecido adiposo e lavagem inicial para minimizar a possível contaminação, pois as amostras de tecido obtidas na necropsia são coletadas em um ambiente não estéril.
2. Prepare tampão de colagenase estéril (CB) combinando 0,075% de colagenase Tipo I (125 unidades/mg de atividade), 2% de pen/estreptococo e 0,25 μg/mL de inibidor fúngico na solução salina balanceada de Hank (HBSS) com albumina sérica bovina a 1%. CB deve ser usado dentro de 1 h.
3. Prepare o meio de crescimento ADSC estéril usando o tampão α-MEM. Combinar 100 mL de soro fetal bovino (FBS), 5 mL de solução de L-glutamina a 200 mM, 500 μL de 0,25 μg/mL de inibidor fúngico e 10 mL de solução de caneta/estreptococo em 394 mL de tampão α-MEM. O meio de crescimento ADSC pode ser armazenado a 4 °C e deve ser utilizado no prazo de 4 semanas.
   NOTA: A inativação por calor da FBS não é necessária.
4. Preparar o meio de diferenciação ADSC estéril combinando o meio de crescimento ADSC conforme preparado acima e agentes de indução para atingir a concentração final de 0,5 μg/mL de dexametasona, 0,5 mM de isobutilmetilxantina e 50 μM de indometacina.

2. Isolamento ADSC

1. Preparação e digestão de tecidos
   1. Pipeta ~10 mL de tampão 5-PBS em quatro placas de cultura celular de 100 mm.
   2. Transfira ~50 g de amostra adiposa para uma das placas de 100 mm contendo 5-PBS. Lave a amostra de tecido adiposo coletada quatro vezes, transferindo-a sequencialmente através das quatro placas de cultura contendo 5-PBS.
   3. Transfira a amostra adiposa para um prato de cultura limpo de 100 mm e pice completamente o tecido adiposo usando uma tesoura ou dois bisturis estéreis. A picagem permite aumentar a área de superfície para uma digestão enzimática eficiente e completa.
   4. Transfira o tecido adiposo picado para um tubo cônico plástico de 50 mL contendo 13 mL de CB (seção de 1–3 cm de tecido por 15 mL de CB).
   5. Enxaguar a placa de cultura com 2 mL de CB e transferir o meio para o tubo cônico plástico de 50 mL.
      NOTA: Neste ponto, deve haver um total de 15 mL de CB com tecido em um tubo cônico plástico de 50 mL.
   6. Pipeta para cima e para baixo várias vezes usando pipeta sorológica de 25 mL para facilitar a digestão mecânica do tecido.
   7. Incubar o tubo cônico plástico de 50 mL contendo tecido em CB em um balancim a uma velocidade média a 37 °C por 30–60 min.
2. Revestimento ADSC para cultura
   1. Adicione 10 mL de meio de crescimento ADSC ao tubo de 50 mL contendo tecido para neutralizar a atividade enzimática. Pipeta para cima e para baixo várias vezes usando pipeta sorológica de 25 mL para separar quaisquer agregados de tecido adiposo.
   2. Transfira a porção líquida para um novo tubo cônico estéril de 50 mL, deixando os sólidos para trás. Lave o tubo original de 50 mL 3 vezes com ~7 mL de tampão 2-PBS e transfira a porção líquida para o tubo de 50 mL.
   3. Centrifugar a 500 x g durante 5 min para obter um pellet celular. Remova cuidadosamente o máximo de sobrenadante possível usando uma pipeta sorológica sem perturbar a pastilha celular. Não decante.
   4. Ressuspeite o pellet celular em 1 mL de 1x tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) e incube à temperatura ambiente por 10 min. Adicionar 5 ml de meio de crescimento ADSC ao tubo e centrifugar a 500 x g durante 5 min, depois remover e eliminar cuidadosamente o sobrenadante.
   5. Adicionar 5 mL de meio de crescimento ADSC e centrifugar a 500 x g por 5 min para lavar o pellet celular. Descarte o sobrenadante.
   6. Ressuspeite o pellet em 2 mL de meio de crescimento ADSC e filtre através de um filtro celular de 70 μm em um novo tubo cônico plástico estéril de 50 mL.
   7. Lave o filtro celular com mais 2 ml de meio de crescimento ADSC. Transfira 4 mL da suspensão contendo ADSCs do tubo cônico de 50 mL para um prato de cultura estéril de 100 mm.
   8. Lavar o tubo cônico de 50 mL 2 vezes com 3 mL de meio de crescimento ADSC e transferir o líquido para a placa de cultura de 100 mm contendo ADSCs para um total de 10 mL de meio em placa de cultura.
   9. Visualize as células sob um microscópio invertido com ampliação de 10x para verificar se há células flutuantes na mídia, conforme mostrado na Figura 1A. As células devem ser mantidas em uma incubadora de CO 2 a 37 °C a 5% de CO₂ e 100% de umidade relativa.
   10. Após 24 h, visualize as células sob um microscópio invertido para verificar a aderência celular. Aspirar o meio de crescimento ADSC da placa e substituir por 10 ml de meio fresco e quente (37 °C). Remova e substitua a mídia a cada 48 horas até que as células estejam 80% a 90% confluentes (Figura 1B).
       NOTA: Pelo menos 10-20 % das células estarão aderentes até 24 horas. Verifique a cultura de células em busca de sinais de contaminação, como granularidade celular, turbidez do meio ou crescimento de esporos. Uma vez que as células são 80% confluentes, elas podem ser colhidas para proliferação e criopreservação ou induzidas a se diferenciar. Os ADSCs podem ser expandidos para 4-6 passagens antes de perder sua capacidade de proliferar ou diferenciar eficientemente.

3. Proliferação de ADSC

1. Descolamento celular
   1. Remova o meio de crescimento ADSC usando um aspirador/pipeta. Enxaguar os ADSCs confluentes 2 vezes com 2 mL de PBS estéril à temperatura ambiente.
   2. Aspirar PBS e adicionar 2 mL de tripsina-EDTA a 0,25% por placa de cultura de 100 mm. Certifique-se de que toda a área de superfície esteja coberta com tripsina.
   3. Incubar a placa durante ~7 min a 37 °C em 5% de CO₂ até que os ADSCs se desprendam. Remova a placa da incubadora e desaloje mecanicamente as células pipetando com força a solução de tripsina na placa.
   4. Adicionar 2 ml de meio de crescimento ADSC às células desalojadas e pipetar suavemente para misturar. Transfira as células para o tubo cônico plástico estéril de 50 mL. Para garantir a máxima recuperação celular, enxaguar a placa de cultura com mais 2 mL de meio de crescimento ADSC e transferir o meio para o tubo cônico contendo células destacadas.
   5. Centrifugar o tubo cônico de 50 mL a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente para obter um pellet celular. Decante cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar a pastilha celular.
   6. Ressuscite o pellet celular em 5-6 mL de meio de crescimento ADSC por 1 x 10⁶ células.
2. Contagem de células e chapeamento
   1. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, diluir 10 μL de solução celular de cima e 10 μL de solução azul de tripano a 0,04% (azul de tripano a 0,4% diluído 1:10 em PBS) e contar as células usando um hemocitômetro.
   2. Ressuscite o número desejado de ADSCs em meio de crescimento. Para a placa de cultura de 100 mm, placa ~3,0 x 10⁵ células em 10 mL de meio de crescimento ADSC para permitir 80% de confluência em 72 h ou 100% de confluência em 96 h.
   3. Visualize o prato sob um microscópio invertido com uma ampliação de 10x antes da incubação para garantir a presença de células suspensas. Manter as células a 37 °C a 5% de CO₂ e 100% de humidade relativa.
   4. A cada 48 h, aspirar o meio de crescimento e substituir por meio morno (37 °C) até que as células fiquem 80% a 90% confluentes, como mostra a Figura 1B.
   5. Repita os passos das secções 3.1 e 3.2 para obter o número adequado de passagens para obter o número de células desejado.
      NOTA: Após as passagens 5 a 6, as células primárias parecem sofrer senescência; portanto, procure obter o número de células desejado pela passagem 4.

4. Diferenciação adipogênica ADSC

1. Aspirar o meio de crescimento ADSC a partir de ADSCs aderidos que atingiram 80% a 90% de confluência.
2. Lave rapidamente a camada de células ADSC com PBS estéril à temperatura ambiente.
3. Adicione o meio de diferenciação ADSC. Para a placa de cultura de 100 mm, adicione 10 mL de meio de diferenciação ADSC.
4. Substitua o meio a cada 3 dias por aproximadamente 14 a 21 dias. Os adipócitos maduros são geralmente observados após 14 dias de diferenciação.
5. Examinar as células sob um microscópio de luz invertida com ampliação de 40x para confirmar a presença de gotículas lipídicas, conforme mostrado na Figura 2A.

5. Detecção de adipócitos

NOTA: Esta seção descreverá os protocolos de coloração usados para detecção de gotículas lipídicas em adipócitos diferenciados, no entanto, a coloração imunofluorescente para CD105, um marcador de células-tronco mesenquimais, também pode ser usada para confirmação de ADSC.

1. Coloração Óleo Vermelho O
   1. Preparar solução de reserva de 0,5% de óleo vermelho O em isopropanol. Para 20 ml de solução-mãe Oil Red O, dissolver 100 mg de Oil Red O em 20 ml de isopropanol. Filtrar a solução através de um filtro de seringa estéril com membrana de 0,2 μm.
   2. Aspirar cuidadosamente o meio de diferenciação e lavar as células 2 vezes, adicionando PBS ao longo dos lados do poço para não perturbar a monocamada celular.
   3. Aspirar cuidadosamente o PBS das células e adicionar formalina tamponada neutra (NBF, 10%) suficiente para cobrir a camada celular. Incubar à temperatura ambiente por 30-60 min.
   4. Durante a etapa de fixação da formina, prepare a solução de trabalho Oil Red O diluindo 3 partes da solução-mãe Oil Red O com 2 partes de água destilada. Misture a solução e filtre através de um filtro de seringa estéril com membrana de 0,2 μm. A solução de trabalho é estável por até 2 h.
   5. Aspirar cuidadosamente o NBF e lavar rapidamente (~ 15 s) a camada celular com água destilada. Adicione 60% de isopropanol suficiente para cobrir a camada celular após aspirar água e incubar à temperatura ambiente por 5 min.
   6. Aspirar cuidadosamente o isopropanol após 5 minutos de incubação e adicionar uma solução de trabalho suficiente de óleo vermelho O para cobrir a camada celular e incubar à temperatura ambiente durante 10-15 minutos.
   7. Aspirar cuidadosamente a solução de trabalho Oil Red O e lavar a camada celular várias vezes com água destilada até que a água fique límpida.
   8. Adicionar PBS à placa de cultura celular e examinar as células sob microscópio invertido para indicação de diferenciação e presença de gotículas lipídicas (Figura 2B).
2. Coloração BODIPY
   1. Preparar a solução-mãe de BODIPY 5 mM dissolvendo 1,3 g de BODIPY em 1 ml de DMSO. Preparar 2 μg/ml de solução de trabalho de BODIPY diluindo a solução-mãe 1:25.000 vezes em PBS.
   2. Aspirar cuidadosamente o meio de diferenciação e lavar as células 2 vezes, adicionando PBS ao longo dos lados do poço para não perturbar a monocamada celular.
   3. Aspirar cuidadosamente o PBS e adicionar uma solução de trabalho BODIPY suficiente para cobrir a camada celular e incubar a 37 °C durante 30 minutos.
      NOTA: A partir deste ponto, proteja as células da luz cobrindo a placa com papel alumínio.
   4. Aspirar cuidadosamente a solução de trabalho BODIPY e lavar a camada celular 3 vezes com PBS.
   5. Fixar as células adicionando 4% de paraformaldeído e incubando à temperatura ambiente durante 15 min.
   6. Aspirar cuidadosamente o tampão de fixação e lavar as células 2 vezes, adicionando PBS ao longo dos lados do poço para não perturbar a monocamada celular.
   7. Adicionar PBS à placa de cultura celular e examinar as células sob um microscópio fluorescente invertido para evidências de diferenciação e presença de gotículas lipídicas (Figura 2C). Células de imagem usando um conjunto de filtros FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO Chroma. O comprimento de onda de excitação está em 480 nm com uma largura de banda de 40 nm e o comprimento de onda de emissão está em 535 nm com uma largura de banda de 50 nm. Um conjunto de filtros e microscópios semelhantes ou apropriados podem ser usados.

Resultados

Os ADSCs isolados de amostras de tecido adiposo de macacos rhesus foram semeados em placas de cultura e são mostrados na Figura 1. No dia do plaqueamento, as células não aderem e flutuam no prato de cultura, como mostra a Figura 1A. Dentro de 72 h, os ADSCs se tornarão 80% confluentes e estarão prontos para a diferenciação de adipócitos (Figura 1B). Os ADSCs exibem fortes características adipogênicas após a indução quí...

Discussão

Os protocolos de isolamento, proliferação e diferenciação do ADSC são simples e reprodutíveis, mas exigem técnica cuidadosa para garantir isolamento adequado, expansão saudável e diferenciação eficiente. Um ambiente de trabalho estéril é fundamental para todos os experimentos de cultura de células. Bactérias ou fungos podem ser introduzidos em culturas de células através de ferramentas, meios ou ambientes de trabalho contaminados. A contaminação fúngica é indicada pelo crescimento de esporos na cultu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 % trypan blue	Thermo-Fisher	15250061
1.5-ml microcentrifuge tube	Dot Scientific	707-FTG
100 % isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1838-P
100-mm cell culture dish	Corning	430167
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018
50-mL plastic conical tube	Fisher Scientific	50-465-232
70-µm cell strainer	Corning	CLS431751
a-MEM	Thermo-Fisher	12561056
Aluminum foil	Reynolds Wrap
BODIPY	Thermo-Fisher	D3922
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	05470
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Collagenase, Type I	Thermo-Fisher	17100017
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma-Aldrich	D2915
Dimethyl sulfoxide, DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Distilled water	Thermo-Fisher	15230162
Fetal Bovine Serum, USDA-approved	Sigma-Aldrich	F0926
Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL)	Thermo-Fisher	15290018
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo-Fisher	14175095
Hemacytometer with cover slip	Sigma-Aldrich	Z359629
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378
Inverted light microscope	Nikon	DIAPHOT-TMD
L-glutamine (200 mM)	Thermo-Fisher	25030081
Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz	Reliable Scientific	Model 55 Rocking
Neutral buffered formalin (10 %)	Pharmco	8BUFF-FORM
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625
Paraformeldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo-Fisher	15140122
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo-Fisher	10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer	Qiagen	158904
Serological pipettes, 2 to 25 mL	Costar Stripettes
Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2	Sanyo	MCO-17AIC
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo-Fisher	25200056