Isolamento, proliferazione e differenziamento di cellule staminali derivate dall'adiposio del macaco rhesus

Riepilogo

In questo articolo, descriviamo l'isolamento delle cellule staminali derivate dal macaco rhesus (ADSC) utilizzando un protocollo di digestione enzimatica dei tessuti. Successivamente, descriviamo la proliferazione ADSC che include il distacco cellulare, il conteggio e la placcatura. Infine, la differenziazione dell'ADSC è descritta utilizzando specifici agenti induttori adipogeni. Inoltre, descriviamo le tecniche di colorazione per confermare la differenziazione.

Abstract

Il tessuto adiposo fornisce una fonte ricca e accessibile di cellule staminali multipotenti, che sono in grado di auto-rinnovarsi. Queste cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC) forniscono un sistema cellulare ex vivo coerente che è funzionalmente simile a quello degli adipociti in vivo. L'uso di ADSC nella ricerca biomedica consente l'indagine cellulare della regolazione e della funzione metabolica del tessuto adiposo. La differenziazione ADSC è necessaria per un'adeguata espansione degli adipociti e la differenziazione subottimale è un meccanismo importante della disfunzione adiposa. Comprendere i cambiamenti nella differenziazione ADSC è fondamentale per comprendere lo sviluppo della disfunzione metabolica e della malattia. I protocolli descritti in questo manoscritto, quando seguiti, produrranno adipociti maturi che possono essere utilizzati per diversi test funzionali in vitro per valutare la funzione metabolica ADSC, inclusi ma non limitati a saggi che misurano l'assorbimento del glucosio, la lipolisi, la lipogenesi e la secrezione. I macachi Rhesus (Macaca mulatta) sono fisiologicamente, anatomicamente ed evolutivamente simili agli esseri umani e come tali, i loro tessuti e cellule sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca biomedica e per lo sviluppo di trattamenti. Qui, descriviamo l'isolamento ADSC utilizzando tessuto adiposo fresco sottocutaneo e omentale ottenuto da macachi rhesus di 4-9 anni. I campioni di tessuto adiposo vengono digeriti enzimaticamente nella collagenasi seguita da filtrazione e centrifugazione per isolare le ADSC dalla frazione vascolare stromale. Le ADSC isolate sono proliferate nei mezzi stromali seguiti da circa 14-21 giorni di differenziazione utilizzando un cocktail di 0,5 μg/mL di desametasone, 0,5 mM di isobutilmetilxantina e 50 μM di indometacina nei mezzi stromali. Gli adipociti maturi sono osservati a circa 14 giorni di differenziazione. In questo manoscritto, descriviamo i protocolli per l'isolamento, la proliferazione e la differenziazione ADSC in vitro. Sebbene ci siamo concentrati sulle ADSC del tessuto adiposo del macaco rhesus, questi protocolli possono essere utilizzati per il tessuto adiposo ottenuto da altri animali con aggiustamenti minimi.

Introduzione

Il tessuto adiposo è costituito da una miscela eterogenea di cellule, prevalentemente adipociti maturi e una frazione vascolare stromale comprendente fibroblasti, cellule immunitarie e cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC)^1,2,3. Le ADSC primarie possono essere isolate direttamente dal tessuto adiposo bianco e stimolate a differenziarsi in adipociti, cartilagini o cellule ossee⁴. Le ADSC presentano caratteristiche classiche delle cellule staminali, come il mantenimento della multipotenza in vitro e l'auto-rinnovamento; e sono aderenti alla plastica in coltura ^5,6. Le ADSC sono di importante interesse per l'uso nella medicina rigenerativa grazie alla loro multipotenza e alla capacità di essere facilmente raccolte in grandi quantità utilizzando tecniche non invasive⁷. La differenziazione adipogena delle ADSC produce cellule che imitano funzionalmente gli adipociti maturi, tra cui l'accumulo lipidico, l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina, la lipolisi e la secrezione di adipochine⁸. La loro somiglianza con gli adipociti maturi ha portato all'uso diffuso di ADSC per lo studio fisiologico delle caratteristiche cellulari e della funzione metabolica degli adipociti. Vi è una crescente evidenza a sostegno dell'idea che lo sviluppo di disfunzioni metaboliche e disturbi abbia origine a livello cellulare o tissutale 9,10,11,12. È necessaria una differenziazione ottimale dell'ADSC per una sufficiente espansione del tessuto adiposo, una corretta funzione degli adipociti e un'efficace regolazione metabolica¹³.

I protocolli descritti in questo manoscritto sono tecniche semplici che utilizzano attrezzature di laboratorio standard e reagenti di base. Il manoscritto descrive innanzitutto il protocollo per l'isolamento delle ADSC primarie dal tessuto adiposo fresco mediante digestione meccanica ed enzimatica. Successivamente, viene descritto il protocollo per la proliferazione e il passaggio delle ADSC nel mezzo stromale. Infine, viene descritto il protocollo per il differenziamento adipogeno delle ADSC. Dopo la differenziazione, queste cellule possono essere utilizzate per studi per comprendere meglio il metabolismo degli adipociti e i meccanismi di disfunzione. Vengono inoltre descritti i protocolli per la conferma della differenziazione adipogenica e del rilevamento delle goccioline lipidiche mediante colorazione Oil Red O e boro-dipirrometene (BODIPY). I dettagli di questi protocolli si sono concentrati sulle ADSC primarie isolate dal tessuto adiposo omentale fresco dei macachi rhesus. Noi e altri abbiamo utilizzato questo protocollo per isolare con successo le ADSC dai depositi di tessuto adiposo sottocutaneo e omentale del macaco rhesus^14,15. A parità di tessuto utilizzato, abbiamo osservato che il tessuto adiposo sottocutaneo è più denso, più duro e produce meno cellule dalla digestione rispetto al tessuto adiposo omentale. Questo protocollo è stato utilizzato anche per isolare gli ADSC da campioni adiposi umani¹⁶.

Protocollo

Tutti i tessuti e le procedure ottenuti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso il Louisiana State University Health Sciences Center e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del National Institute of Health (pubblicazione NIH n. 85-12, rivista 1996).

1. Preparazione di tamponi e soluzioni

1. Preparare una soluzione tampone di lavaggio salino sterile tampone con tampone con 5-fosfato (5-PBS) aggiungendo il 5% di penicillina / streptomicina (penna / streptococco) e 0,25 μg / ml di inibitore fungino a 1x PBS. Preparare la soluzione sterile di tampone di lavaggio 2-PBS (2-PBS) aggiungendo penna/streptococco al 2% e 0,25 μg/ml di inibitore fungino in 1x PBS. I tamponi di lavaggio possono essere conservati a 4 °C per un uso futuro e devono essere utilizzati entro 4 settimane.
   NOTA: il tampone 5-PBS viene utilizzato per la raccolta del tessuto adiposo e il lavaggio iniziale per ridurre al minimo la possibile contaminazione poiché i campioni di tessuto ottenuti all'autopsia vengono raccolti in un ambiente non sterile.
2. Preparare tampone sterile di collagenasi (CB) combinando lo 0,075% di collagenasi di tipo I (125 unità/mg di attività), il 2% di penna/streptococco e 0,25 μg/ml di inibitore fungino nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con l'1% di albumina sierica bovina. CB deve essere utilizzato entro 1 ora.
3. Preparare il terreno di coltura ADSC sterile utilizzando tampone α-MEM. Combinare 100 mL di siero fetale bovino (FBS), 5 mL di 200 mM di soluzione di L-glutammina, 500 μL di 0,25 μg/mL di inibitore fungino e 10 mL di soluzione di penna/streptococco in 394 mL di tampone α-MEM. Il terreno di coltura ADSC può essere conservato a 4 °C e deve essere utilizzato entro 4 settimane.
   NOTA: l'inattivazione termica di FBS non è necessaria.
4. Preparare il terreno di differenziazione ADSC sterile combinando il terreno di crescita ADSC come preparato sopra e gli agenti di induzione per raggiungere una concentrazione finale di 0,5 μg/mL di desametasone, 0,5 mM di isobutilmetilxantina e 50 μM di indometacina.

2. Isolamento ADSC

1. Preparazione e digestione dei tessuti
   1. Pipettare ~10 mL di tampone 5-PBS in quattro piatti di coltura cellulare da 100 mm.
   2. Trasferire ~50 g di campione adiposo in uno dei piatti da 100 mm contenenti 5-PBS. Lavare il campione di tessuto adiposo raccolto quattro volte trasferendolo sequenzialmente attraverso i quattro piatti di coltura contenenti 5-PBS.
   3. Trasferire il campione adiposo in una capsula di coltura pulita da 100 mm e tritare accuratamente il tessuto adiposo usando le forbici o due bisturi sterili. La tritatura consente di aumentare la superficie per una digestione enzimatica efficiente e completa.
   4. Trasferire il tessuto adiposo tritato in un tubo conico di plastica da 50 ml contenente 13 ml di CB (sezione di 1-3 cm di tessuto per 15 ml di CB).
   5. Risciacquare il piatto di coltura con 2 ml di CB e trasferire il terreno nel tubo conico di plastica da 50 ml.
      NOTA: A questo punto, ci dovrebbe essere un totale di 15 ml di CB con tessuto in un tubo conico di plastica da 50 ml.
   6. Pipettare su e giù più volte utilizzando una pipetta sierologica da 25 ml per facilitare la digestione meccanica dei tessuti.
   7. Incubare il tubo conico di plastica da 50 mL contenente tessuto in CB su un bilanciere a velocità media a 37 °C per 30-60 minuti.
2. Placcatura ADSC per la cultura
   1. Aggiungere 10 ml di terreno di crescita ADSC al tubo contenente tessuto da 50 mL per neutralizzare l'attività enzimatica. Pipettare su e giù più volte utilizzando una pipetta sierologica da 25 ml per separare eventuali aggregati di tessuto adiposo.
   2. Trasferire la parte liquida in un nuovo tubo conico sterile da 50 mL lasciando indietro i solidi. Lavare il tubo originale da 50 ml 3 volte con ~ 7 ml di tampone 2-PBS e trasferire la parte liquida nel tubo da 50 ml.
   3. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti fino ad ottenere un pellet cellulare. Rimuovere con attenzione quanto più surnatante possibile utilizzando una pipetta sierologica senza disturbare il pellet cellulare. Non travasare.
   4. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di lisi 1x globuli rossi (RBC) e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Aggiungere 5 mL di terreno di crescita ADSC al tubo e centrifugare a 500 x g per 5 minuti, quindi rimuovere con cura ed eliminare il surnatante.
   5. Aggiungere 5 ml di terreno di coltura ADSC e centrifugare a 500 x g per 5 minuti per lavare il pellet cellulare. Scartare il surnatante.
   6. Risospendere il pellet in 2 ml di terreno di crescita ADSC e filtrare attraverso un filtro cellulare da 70 μm in un nuovo tubo conico di plastica sterile da 50 ml.
   7. Risciacquare il filtro cellulare con altri 2 ml di terreno di coltura ADSC. Trasferire 4 mL della sospensione contenente ADSC dal tubo conico da 50 mL a un piatto di coltura sterile da 100 mm.
   8. Lavare il tubo conico da 50 mL 2 volte con 3 mL di terreno di coltura ADSC e trasferire il liquido nel piatto di coltura da 100 mm contenente ADSC per un totale di 10 mL di terreno in piatto di coltura.
   9. Visualizzare le celle al microscopio invertito con un ingrandimento 10x per verificare la presenza di celle mobili nel supporto, come mostrato nella Figura 1A. Le celle devono essere mantenute in un incubatore di CO 2 a 37 °C al 5% di CO₂ e al 100% di umidità relativa.
   10. Dopo 24 ore, visualizzare le cellule al microscopio invertito per verificare l'aderenza cellulare. Aspirare il terreno di coltura ADSC dalla piastra e sostituirlo con 10 ml di terreno fresco e caldo (37 °C). Rimuovere e sostituire il supporto ogni 48 ore fino a quando le celle non sono confluenti all'80%-90% (Figura 1B).
       NOTA: Almeno il 10-20% delle cellule sarà aderente entro 24 ore. Controllare la coltura cellulare per segni di contaminazione come granularità cellulare, torbidità dei mezzi o crescita di spore. Una volta che le cellule sono confluenti all'80%, possono essere raccolte per la proliferazione e la crioconservazione o indotte a differenziarsi. Gli ADSC possono essere espansi a 4-6 passaggi prima di perdere la loro capacità di proliferare o differenziarsi in modo efficiente.

3. Proliferazione ADSC

1. Distacco di cellule
   1. Rimuovere il terreno di coltura ADSC utilizzando un aspiratore/pipetta. Risciacquare gli ADSC confluenti 2 volte con 2 ml di PBS sterile a temperatura ambiente.
   2. Aspirare il PBS e aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA allo 0,25 % per piastra di coltura da 100 mm. Assicurarsi che l'intera superficie sia coperta di tripsina.
   3. Incubare la piastra per ~7 minuti a 37 °C in 5% di CO₂ fino al distacco degli ADSC. Rimuovere la piastra dall'incubatore e rimuovere meccanicamente le cellule pipettando con forza la soluzione di tripsina nella piastra.
   4. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura ADSC alle cellule spostate e pipettare delicatamente per miscelare. Trasferire le celle in un tubo conico di plastica sterile da 50 ml. Per garantire il massimo recupero cellulare, sciacquare il piatto di coltura con altri 2 ml di terreno di crescita ADSC e trasferire il mezzo al tubo conico contenente le cellule distaccate.
   5. Centrifugare il tubo conico da 50 mL a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per ottenere un pellet cellulare. Decantare con cura il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
   6. Risospendere il pellet cellulare in 5-6 ml di terreno di crescita ADSC per 1 x 10⁶ cellule.
2. Conteggio delle cellule e placcatura
   1. In una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, diluire 10 μL di soluzione cellulare dall'alto e 10 μL di soluzione di tripano blu allo 0,04% (0,4% di tripano blu diluito 1:10 in PBS) e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
   2. Risospendere il numero desiderato di ADSC nel mezzo di crescita. Per un piatto di coltura da 100 mm, piastra ~3,0 x 10⁵ celle in 10 mL di terreno di coltura ADSC per consentire una confluenza dell'80% in 72 ore o una confluenza del 100% in 96 ore.
   3. Visualizza il piatto al microscopio invertito con un ingrandimento di 10x prima dell'incubazione per garantire la presenza di cellule sospese. Mantenere le celle a 37 °C al 5% di CO₂ e al 100% di umidità relativa.
   4. Ogni 48 ore aspirare il terreno di crescita e sostituirlo con terreno caldo (37 °C) fino a quando le cellule sono confluenti all'80-90%, come mostrato nella figura 1B.
   5. Ripetere i passaggi delle sezioni 3.1 e 3.2 per il numero appropriato di passaggi per ottenere il numero di cella desiderato.
      NOTA: Dopo i passaggi da 5 a 6, le cellule primarie sembrano andare incontro a senescenza; Pertanto, mirare a ottenere i numeri di cella desiderati dal passaggio 4.

4. Differenziazione adipogenica ADSC

1. Aspirare il terreno di coltura ADSC da ADSC aderenti che hanno raggiunto l'80% al 90% di confluenza.
2. Risciacquare rapidamente lo strato cellulare ADSC con PBS sterile a temperatura ambiente.
3. Aggiungere il mezzo di differenziazione ADSC. Per un piatto di coltura da 100 mm, aggiungere 10 ml di terreno di differenziazione ADSC.
4. Sostituire il mezzo ogni 3 giorni per circa 14-21 giorni. Gli adipociti maturi sono generalmente osservati dopo 14 giorni di differenziazione.
5. Esaminare le cellule al microscopio a luce invertita con un ingrandimento 40x per confermare la presenza di goccioline lipidiche come mostrato in Figura 2A.

5. Rilevamento degli adipociti

NOTA: Questa sezione descriverà i protocolli di colorazione utilizzati per il rilevamento delle goccioline lipidiche negli adipociti differenziati, tuttavia, la colorazione immunofluorescente per CD105, un marcatore di cellule staminali mesenchimali, può essere utilizzata anche per la conferma ADSC.

1. Colorazione O rosso olio
   1. Preparare la soluzione madre di olio rosso O allo 0,5% in isopropanolo. Per 20 mL di soluzione madre di olio rosso O, sciogliere 100 mg di olio rosso O in 20 ml di isopropanolo. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa sterile con membrana da 0,2 μm.
   2. Aspirare con cura il mezzo di differenziazione e lavare le celle 2 volte aggiungendo PBS lungo i lati del pozzetto per non disturbare il monostrato cellulare.
   3. Aspirare accuratamente il PBS dalle cellule e aggiungere abbastanza formalina tamponata neutra (NBF, 10%) per coprire lo strato cellulare. Incubare a temperatura ambiente per 30-60 min.
   4. Durante la fase di fissazione della formalina, preparare la soluzione di lavoro Oil Red O diluendo 3 parti di soluzione madre Oil Red O con 2 parti di acqua distillata. Mescolare la soluzione e filtrare attraverso un filtro a siringa sterile con membrana da 0,2 μm. La soluzione di lavoro è stabile fino a 2 ore.
   5. Aspirare accuratamente NBF e lavare rapidamente (~ 15 s) lo strato cellulare con acqua distillata. Aggiungere abbastanza isopropanolo al 60% per coprire lo strato cellulare dopo aver aspirato l'acqua e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
   6. Aspirare con cura l'isopropanolo dopo 5 minuti di incubazione e aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di lavoro Oil Red O per coprire lo strato cellulare e incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti.
   7. Aspirare con cura la soluzione di lavoro Oil Red O e lavare più volte lo strato cellulare con acqua distillata fino a quando l'acqua diventa limpida.
   8. Aggiungere PBS al piatto di coltura cellulare ed esaminare le cellule al microscopio invertito per l'indicazione della differenziazione e della presenza di goccioline lipidiche (Figura 2B).
2. Colorazione BODIPY
   1. Preparare 5 mM di soluzione madre di BODIPY sciogliendo 1,3 g di BODIPY in 1 mL di DMSO. Preparare 2 μg/mL di soluzione di lavoro BODIPY diluendo la soluzione madre 1:25.000 volte in PBS.
   2. Aspirare con cura il mezzo di differenziazione e lavare le celle 2 volte aggiungendo PBS lungo i lati del pozzetto per non disturbare il monostrato cellulare.
   3. Aspirare con cautela il PBS e aggiungere una soluzione di lavoro BODIPY sufficiente a coprire lo strato cellulare e incubare a 37 °C per 30 minuti.
      NOTA: Da questo punto, proteggere le cellule dalla luce coprendo la piastra con un foglio.
   4. Aspirare accuratamente la soluzione di lavoro BODIPY e lavare lo strato cellulare 3 volte con PBS.
   5. Fissare le cellule aggiungendo il 4% di paraformaldeide e incubando a temperatura ambiente per 15 minuti.
   6. Aspirare con attenzione il tampone di fissazione e lavare le celle 2 volte aggiungendo PBS lungo i lati del pozzetto per non disturbare il monostrato cellulare.
   7. Aggiungere PBS al piatto di coltura cellulare ed esaminare le cellule al microscopio fluorescente invertito per prove di differenziazione e presenza di goccioline lipidiche (Figura 2C). Celle immagine utilizzando un set di filtri FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO Chroma. La lunghezza d'onda di eccitazione è a 480 nm con una larghezza di banda di 40 nm e la lunghezza d'onda di emissione è a 535 nm con una larghezza di banda di 50 nm. È possibile utilizzare un set di filtri simile o appropriato e un microscopio.

Risultati

Gli ADSC isolati da campioni di tessuto adiposo del macaco rhesus sono stati seminati su piastre di coltura ed è mostrato nella Figura 1. Il giorno della placcatura, le cellule non sono aderenti e galleggiano nel piatto di coltura come mostrato nella Figura 1A. Entro 72 ore, le ADSC diventeranno confluenti all'80% e saranno pronte per la differenziazione degli adipociti (Figura 1B). Le ADSC presentano forti caratteristiche adipogen...

Discussione

I protocolli di isolamento, proliferazione e differenziazione ADSC sono semplici e riproducibili, ma richiedono un'attenta tecnica per garantire un isolamento adeguato, un'espansione sana e una differenziazione efficiente. Un ambiente di lavoro sterile è fondamentale per tutti gli esperimenti di coltura cellulare. Batteri o funghi possono essere introdotti in colture cellulari attraverso strumenti, mezzi o ambienti di lavoro contaminati. La contaminazione fungina è indicata dalla crescita delle spore nella coltura, men...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 % trypan blue	Thermo-Fisher	15250061
1.5-ml microcentrifuge tube	Dot Scientific	707-FTG
100 % isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1838-P
100-mm cell culture dish	Corning	430167
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018
50-mL plastic conical tube	Fisher Scientific	50-465-232
70-µm cell strainer	Corning	CLS431751
a-MEM	Thermo-Fisher	12561056
Aluminum foil	Reynolds Wrap
BODIPY	Thermo-Fisher	D3922
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	05470
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Collagenase, Type I	Thermo-Fisher	17100017
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma-Aldrich	D2915
Dimethyl sulfoxide, DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Distilled water	Thermo-Fisher	15230162
Fetal Bovine Serum, USDA-approved	Sigma-Aldrich	F0926
Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL)	Thermo-Fisher	15290018
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo-Fisher	14175095
Hemacytometer with cover slip	Sigma-Aldrich	Z359629
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378
Inverted light microscope	Nikon	DIAPHOT-TMD
L-glutamine (200 mM)	Thermo-Fisher	25030081
Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz	Reliable Scientific	Model 55 Rocking
Neutral buffered formalin (10 %)	Pharmco	8BUFF-FORM
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625
Paraformeldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo-Fisher	15140122
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo-Fisher	10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer	Qiagen	158904
Serological pipettes, 2 to 25 mL	Costar Stripettes
Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2	Sanyo	MCO-17AIC
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo-Fisher	25200056