In vitro Surveillance du pH extracellulaire en temps réel

Résumé

Cet article représente un test in vitro utile pour mesurer les changements de pH extracellulaire pendant la migration transépithéliale (TEM) des neutrophiles (PMN)

Résumé

L’accumulation précoce de neutrophiles (NMP) est une caractéristique de l’inflammation intestinale aiguë. Cette inflammation aiguë est soit résolue, soit évolue vers une inflammation chronique. En l’absence d’une élimination efficace de la NMP aux sites d’infiltration, la NMP peut s’accumuler et contribuer à des affections inflammatoires chroniques, notamment la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn. Le pH dans le côlon distal chez les personnes atteintes de colite ulcéreuse active peut varier entre 5 et 6, tandis que les individus en bonne santé maintiennent le pH colique dans la plage de 6,8 à 7,4. Il a été démontré que le pH extracellulaire influence à la fois les cellules épithéliales intestinales et les cellules immunitaires infiltrantes. Plus précisément, l’acidose extracellulaire a un impact significatif sur la NMP. À un pH inférieur à 6,5, il y a une augmentation de la production de H₂O₂, une inhibition de l’apoptose et une augmentation de la durée de vie fonctionnelle de la PMN. Compte tenu de la présence significative de PMN et de l’acidification extracellulaire aux sites d’inflammation, nous avons développé un nouveau modèle qui permet de surveiller le pH extracellulaire pendant la migration transépithéliale du PMN en temps réel. Ici, nous décrivons ce modèle et comment il peut être utilisé pour mesurer à la fois le pH apical et le pH basal pendant le trafic de PMN. Ce modèle peut être utilisé pour surveiller le pH extracellulaire dans un large éventail de conditions ; y compris l’hypoxie, la migration transépithéliale de la NMP, et pendant de longues périodes.

Introduction

Il a été démontré que le microenvironnement extracellulaire joue un rôle important dans la modulation de la réponse inflammatoire. Un aspect du microenvironnement qui est souvent sous-estimé est l’acidification extracellulaire. L’acidification extracellulaire est souvent observée sur les sites d’inflammation active, y compris les troubles des muqueuses tels que les maladies inflammatoires de l’intestin. Le pH luminal dans le côlon distal des patients atteints de colite ulcéreuse peut varier entre un pH de 5 et 6, tandis que les individus en bonne santé ont un pH colique compris entre 6,8 et 7,4, ^1,2. Cette diminution du pH colique est particulièrement intéressante car il a été démontré que le pH extracellulaire influence largement l’IEC et l’infiltration de la fonction des cellules immunitaires. Il a été démontré que les microenvironnements acides, par exemple, prolongent la durée de vie fonctionnelle des PMN infiltrants, stimulent la production de H₂O₂ et inhibent l’apoptose^des PMN ^3,4. Le mécanisme exact par lequel l’environnement extracellulaire devient acide reste incertain, ce qui souligne la nécessité de développer des techniques pour étudier l’acidification au fil du temps.

Dans une étude récente, il a été démontré que le PMN TEM entraîne une acidification significative du microenvironnement et que l’IEC répond rapidement à cette acidification par la régulation positive adaptative de SLC26A3, le principal transporteur chlorure-HCO₃ dans le tissu muqueux ^5,6, favorisant ainsi l’homéostasie du pH⁷. Le ou les mécanismes exacts par lesquels le TEM PMN induit l’acidification extracellulaire restent incertains. On pense actuellement que l’acidification des tissus est causée par une accumulation accrue d’acide lactique résultant d’une glycolyse accrue et il a été récemment observé que le PMN TEM stimule la libération de lactate à partir de l’IEC ^7,8. Cependant, les concentrations de lactate sécrété ne tiennent pas entièrement compte de l’acidification observée pendant la NMP TEM. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l’acidification extracellulaire permettra d’identifier potentiellement de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour mieux comprendre le mécanisme impliqué, il faut un système qui permette de surveiller le pH sur une longue période de temps, tout en permettant à la PMN de transmigrer dans la direction apicale à basale physiologiquement pertinente. L’utilisation d’une sonde de pH prend beaucoup de temps et nécessite des manipulations répétées du système de culture. Actuellement, il existe plusieurs techniques non invasives pour surveiller le pH au fil du temps. Un test couramment utilisé utilise la 2',7'-bis(2-carboxyéthyl)-5,6-carboxyfluorescéine (BCECF), un colorant qui est internalisé par la cellule, mais ce test est limité à l’étude du pH interne ⁹. Il existe plusieurs dosages de pH sur plaque, mais la plupart ne sont disponibles qu’en format 96 puits ou nécessitent l’ajout de colorants sensibles au pH. Le protocole décrit ci-dessous est basé sur une plaque de détection du pH disponible dans le commerce qui a été conçue pour la surveillance non invasive du pH sur une période prolongée¹⁰. Les cellules sont cultivées en monocouche dans une plaque de 24 puits qui contient une sonde de pH pré-calibrée. Ce capteur contient un colorant luminescent qui est excité par un lecteur de plaques spécialisé. La durée de vie de la luminescence, qui dépend du pH, est également mesurée par le lecteur de plaques. Cependant, ce modèle ne comporte pas de compartiment apical et basal, ce qui empêche l’étude de la transmigration ou des différences basalo-apicales d’acidification.

Il s’agit d’un protocole qui permet d’évaluer in vitro l’acidification extracellulaire au cours de la NMP TEM, à l’aide de cellules épithéliales intestinales humaines T84 cultivées sur des inserts transwell, de PMN humaines et d’une sonde de pH fluorescente non invasive. Voici un exemple réussi où le pH extracellulaire est examiné pendant 10 heures et démontre que le PMN TMN actif entraîne une acidification extracellulaire. Bien qu’un exemple spécifique soit présenté, ce protocole peut être utilisé pour évaluer l’effet d’un certain nombre de facteurs ; y compris les métabolites, les types de cellules et les thérapies potentielles, sur le pH extracellulaire.

Protocole

1. Préparation des cellules

Jour 1

1. Milieu de culture cellulaire chaud (DMEM/F12 avec 5 % de FBS, 2 mM de dipeptide de L-alanyl-L-glutamine et Pen Strep) dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 min.
2. Préparez la hotte de culture tissulaire en la vaporisant avec de l’éthanol à 70 % et en essuyant les surfaces avec des serviettes en papier.
3. Vaporisez et essuyez les flacons et les milieux de culture tissulaire, les bouteilles de PBS et de trypsine avec de l’éthanol à 70 % et apportez-les dans le capot de culture tissulaire.
4. Aspirer le milieu du ballon de culture cellulaire et laver les cellules avec 12 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
5. Aspirez le PBS et ajoutez 1 mL de trypsine dans les cellules. Incuber à RT pendant 10 à 20 min, jusqu’à ce que les cellules se détachent.
6. Ajouter 11 ml de milieu de culture cellulaire à la trypsine et mélanger en pipetant de haut en bas 3 à 5 fois.
7. Retournez une boîte de culture cellulaire à 24 puits contenant des inserts de pores de 5 μm et pipetez doucement 100 μL de la suspension cellulaire vers la face inférieure de l’insert (Figure 1).
8. Placez la plaque inversée dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   Jour 2
9. Réchauffer le milieu de culture cellulaire dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 min.
10. Préparez la hotte de culture tissulaire en la vaporisant avec de l’éthanol à 70 % et en essuyant les surfaces avec des serviettes en papier.
11. Vaporisez et essuyez les flacons et les milieux de culture tissulaire, les bouteilles de PBS et de trypsine avec de l’éthanol à 70 % et apportez-les dans le capot de culture tissulaire.
12. Redressez la plaque de culture tissulaire et ajoutez délicatement 1 ml de milieu dans le compartiment basal et 180 μL dans le compartiment apical.
13. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂.
    Jour 3-7 :
14. Surveillez quotidiennement la résistance transépithéliale (TER), à l’aide d’un voltmètre épithélial, jusqu’à ce que le TER se soit stabilisé et que les cellules aient formé une monocouche confluente.

2. Isolement du PMN

1. Solutions à gradient de température ambiante, 50 mM K₂EDTA et solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) sans calcium/magnésium (HBSS-) à température ambiante.
2. Préparez des gradients de densité double dans des tubes coniques de 50 ml.
3. Enduisez une seringue de 60 ml avec 6 ml de 50 mM K₂EDTA et prélevez 54 mL de sang du donneur.
4. Superposez 15 ml de sang aux gradients de densité doubles préparés ci-dessus.
5. Centrifugeuse à 700 x g pendant 30 min à température ambiante, frein desserré.
6. Aspirer le sérum, le monocyte du sang périphérique, les interphases et transférer la couche contenant le PMN dans un nouveau tube conique de 50 mL et remettre en suspension à 50 mL dans HBSS-.
7. Centrifugeuse à 700 x g pendant 10 min à température ambiante.
8. Aspirez le surnageant et mettez la pastille en suspension dans 40 mL de tampon de lyse des globules rouges froids.
9. Centrifuger à 700 x g pendant 10 minutes à 4 °C.
10. Aspirer le surnageant et mélanger les pastilles de tous les tubes dans 3 mL de HBSS-.
11. Déterminer la concentration de PMN et diluer à 5x10⁴ en utilisant l’approximation appropriée de HBSS-.

3. Essai de surveillance du pH in vitro

1. HBSS chaud avec calcium/magnésium (HBSS+) dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 min.
2. Préparez la hotte de culture tissulaire en la vaporisant avec de l’éthanol à 70 % et en essuyant les surfaces avec des serviettes en papier.
3. Vaporisez et essuyez HBSS+ avec de l’éthanol à 70 % et amenez-les dans la hotte de culture tissulaire.
4. h avant d’effectuer l’essai, équilibrer les plaques de détection du pH en ajoutant 1 mL de HBSS+ dans chaque puits et en les plaçant dans un incubateur à 37 °C.
5. min avant le test, retirez les plaques de détection du pH de l’incubateur et ajoutez 1 μM fMLP dans chaque puits.
6. Placez la plaque de détection du pH sur le lecteur de FDS à 37 °C et enregistrez le pH pour établir une référence pour l’expérience.
7. Une fois que le pH s’est stabilisé, retirez le milieu des inserts et ajoutez 180 μL HBSS+ dans le puits supérieur.
8. Ajouter 20 μL HBSS+ aux puits de contrôle ou 20 μL de PMN.
9. Retirez le HBSS+ et transférez les inserts sur la plaque de détection du pH.
10. Dans le puits inférieur, ajoutez 1 mL de HBSS+ avec et sans 1 μM fMLP.
11. Dans le puits supérieur, ajoutez 180 μL de HBSS+.
12. Dans le puits supérieur, ajoutez 20 μl de HBSS- contenant 0 ou 1 x 10⁶ PMN.
13. Placez la plaque de détection du pH sur le lecteur de cartes de données (SDS) à 37 °C (Figure 2).
14. Sur l’ordinateur connecté, ouvrez le logiciel de surveillance du pH et configurez-le pour enregistrer le pH à des intervalles de temps désignés (toutes les 1 à 10 minutes).

Résultats

Les résultats se présentent généralement sous forme de graphique linéaire pour montrer l’évolution du pH au fil du temps (exemple illustré à la figure 3A) ou sous forme de nuage de points montrant le pH extracellulaire à un seul moment dans le temps (exemple illustré à la figure 3B). Selon les besoins expérimentaux, des contrôles et des traitements supplémentaires peuvent être inclus. De plus, ce test peut être...

Discussion

Dans ce protocole, il y a plusieurs étapes clés. Les monocouches doivent être confluentes, mais pas trop confluentes. Pour T84 IEC, ils doivent être utilisés 7 à 10 jours après le placage. Les entéroïdes humains et murins se développent à des rythmes différents de ceux de T84 IEC et les chercheurs devraient déterminer combien de temps il faut à chaque ligne pour atteindre la confluence. Il est important que les chercheurs utilisent des milieux peu tamponnés pour s’assure...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipettes	Corning	4101
24-well plate	Corning	CLS3527-100EA
5 mm pore inserts	Corning	3421
50 ml sterile conical tube	Corning	0553855A
75 cm2 flask	Corning	430641U
DMEM/F12	Gibco	10565-018
FBS	Gibco	26140
GlutaMax	ThermoFisher	35050061
HBSS-	Sigma-Aldrich	H4891-10X1L
HBSS+	Sigma-Aldrich	H1387-10L
Histopaque T1077	Sigma-Aldrich	10771-6X100ML
Histopaque T1119	Sigma-Aldrich	11191-6X100ML
HydroDish HD24	PreSens	NA	https://www.presens.de/products/detail/hydrodish-hd24
PBS	Gibco	14190-144
Pen Strep	Gibco	15140-122
RBC lysis buffer	ThermoFisher	00-4333-57
SDR Reader	PreSens	NA	https://www.presens.de/products/detail/sdr-sensordish-reader-basic-set
Trypsin	Fisher Scientific	25200114