시험관 내 세포 외 pH를 실시간으로 모니터링

요약

이 논문은 호중구(PMN) 경상피 이동(TEM) 중 세포 외 pH의 변화를 측정하는 데 유용한 체외 분석을 나타냅니다.

초록

호중구(PMN)의 조기 축적은 급성 장 염증의 특징입니다. 이 급성 염증은 해결되거나 만성 염증으로 진행됩니다. 침투 부위에서 PMN을 효율적으로 제거하지 않으면 PMN이 축적되어 장 질환인 궤양성 대장염(UC) 및 크론병(CD)을 포함한 만성 염증성 질환에 기여할 수 있습니다. 활동성 UC가 있는 개인의 원위 결장의 pH는 pH 5에서 6 사이인 반면, 건강한 사람은 결장 pH를 6.8-7.4 범위로 유지합니다. 세포 외 pH는 장 상피 세포와 침투하는 면역 세포 모두에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 보다 구체적으로 말하면, 세포외 산증은 PMN에 큰 영향을 미칩니다. pH가 6.5 미만이면_H2O2생성이 증가하고 세포사멸이 억제되며 PMN의 기능적 수명이 증가합니다. 염증 부위에서 PMN과 세포 외 산성화가 현저히 존재한다는 점을 감안하여, 우리는 PMN 경상피 이동 중 세포 외 pH를 실시간으로 모니터링할 수 있는 새로운 모델을 개발했습니다. 여기에서는 이 모델과 PMN 트래피킹 중 정점 및 기저 pH를 모두 측정하는 데 이 모델을 활용하는 방법에 대해 설명합니다. 이 모델은 다양한 조건에서 세포 외 pH를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 저산소증, PMN 경상피 이동 및 장기간 포함.

서문

세포 외 미세환경은 염증 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 종종 과소평가되는 미세환경의 한 측면은 세포 외 산성화입니다. 세포 외 산성화는 염증성 장 질환과 같은 점막 장애를 포함한 활성 염증 부위에서 종종 관찰됩니다. UC 환자의 원위 결장내 내강 pH는 pH 5에서 6 사이인 반면, 건강한 사람의 대장 pH는 6.8-7.4 ^1,2 범위입니다. 이러한 결장 pH의 감소는 세포 외 pH가 IEC 및 면역 세포 기능에 광범위하게 영향을 미치는 것으로 나타났기 때문에 특히 중요합니다. 예를 들어, 산성 미세환경은 침투하는 PMN의 기능적 생명 생성을 연장하고, H₂O₂ 생산을 자극하며, PMN 세포사멸을 억제하는 것으로 나타났습니다 ^3,4. 세포 외 환경이 산성화되는 정확한 메커니즘은 불분명하여 시간이 지남에 따라 산성화를 연구하기 위한 기술을 개발할 필요성을 강조합니다.

최근 연구에서 PMN TEM은 미세환경의 상당한 산성화를 초래하고 IEC는 점막 조직의 주요 염화물-HCO₃ 수송체인 SLC26A3의 적응적 상향 조절을 통해 이러한 산성화에 신속하게 반응하여 ^5,6 pH 항상성을 촉진한다는 것이 입증되었습니다⁷. PMN TEM이 세포 외 산성화를 유도하는 정확한 메커니즘은 불분명합니다. 현재 조직 산성화는 향상된 해당작용으로 인한 젖산 축적 증가로 인해 발생하는 것으로 여겨지며 최근에는 PMN TEM이 IEC ^7,8에서 젖산 방출을 자극하는 것으로 관찰되었습니다. 그러나 분비된 젖산의 수치는 PMN TEM 동안 관찰된 산성화를 완전히 설명하지 못합니다. 세포 외 산성화와 관련된 메커니즘에 대한 더 나은 이해는 새로운 치료 표적의 잠재적인 식별을 가능하게 할 것입니다. 관련된 메커니즘을 더 잘 이해하려면 장기간에 걸쳐 pH를 모니터링할 수 있는 시스템이 필요하며, PMN이 생리학적으로 관련된 정점에서 기저 방향으로 전이할 수 있도록 합니다. pH 프로브를 사용하려면 시간이 많이 소요되며 배양 시스템을 반복적으로 조작해야 합니다. 현재 시간 경과에 따른 pH를 모니터링할 수 있는 몇 가지 비침습적 기술이 있습니다. 일반적으로 사용되는 분석 중 하나는 세포에 의해 내재화되는 염료인 2',7'-bis(2-carboxyethyl)-5,6-carboxyfluorescein(BCECF)을 사용하지만 이 분석은 내부 pH ⁹ 연구로 제한됩니다. 여러 pH 플레이트 분석이 있지만 대부분은 96웰 형식으로만 제공되거나 pH에 민감한 염료를 추가해야 합니다. 아래에 설명된 프로토콜은 장기간에 걸쳐 pH의 비침습적 모니터링을 위해 설계된 시판되는 pH 감지 플레이트를 기반으로 합니다¹⁰. 세포는 사전 보정된 pH 센서가 포함된 24웰 플레이트에서 단층으로 성장합니다. 이 센서에는 특수 플레이트 리더에 의해 여기되는 발광 염료가 포함되어 있습니다. pH에 의존하는 발광 수명도 플레이트 리더에 의해 측정됩니다. 그러나 이 모델에는 정점 및 기저 구획이 없어 산성화의 전이 또는 기저/정점 차이에 대한 연구를 방해합니다.

트랜스웰 삽입물에서 성장한 human T84 장 상피 세포, human PMN 및 비침습적 형광 기반 pH 센서를 사용하여 PMN TEM 중 세포 외 산성화의 체외 평가를 가능하게 하는 프로토콜이 설명되어 있습니다. 10시간 동안 세포 외 pH를 검사하고 활성 PMN TMN이 세포 외 산성화를 초래하는 것을 입증하는 성공적인 예가 제공됩니다. 구체적인 예가 제시되어 있지만 이 프로토콜은 여러 요인의 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 세포 외 pH에 대한 대사 산물, 세포 유형 및 잠재적 치료법을 포함합니다.

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프로토콜

1. 세포 준비

1일차

1. 세포 배양 배지(5% FBS, 2mM L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 및 펜 스트렙이 포함된 DMEM/F12)를 37°C 수조에서 20분 동안 가열합니다.
2. 조직 배양 후드에 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 표면을 닦아 준비합니다.
3. 조직 배양 플라스크 및 배지, PBS 및 트립신 병에 70% 에탄올을 분사하고 닦은 다음 조직 배양 후드로 가져옵니다.
4. 세포 배양 플라스크에서 배지를 흡입하고 12mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척합니다.
5. PBS를 흡인하고 세포에 트립신 1mL를 추가합니다. 세포가 분리될 때까지 10-20분 동안 RT에서 배양합니다.
6. 11mL의 세포 배양 배지를 트립신에 추가하고 3-5회 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
7. 5μm 공극 삽입물이 포함된 24웰 세포 배양 접시를 뒤집고 세포 현탁액 100μL를 삽입물 아래쪽에 부드럽게 피펫팅합니다(그림 1).
8. 반전 플레이트를 37% CO₅의 2 °C 인큐베이터에 놓습니다.
   2일차
9. 세포 배양 배지를 37°C 수조에서 20분 동안 데웁니다.
10. 조직 배양 후드에 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 표면을 닦아 준비합니다.
11. 조직 배양 플라스크 및 배지, PBS 및 트립신 병에 70% 에탄올을 분사하고 닦은 다음 조직 배양 후드로 가져옵니다.
12. 조직 배양 플레이트를 오른쪽으로 놓고 기저 구획에 1mL의 배지를 부드럽게 추가하고 정점 구획에 180μL를 추가합니다.
13. 플레이트를 37% CO₅가 있는 2°C 인큐베이터에 넣습니다.
    3-7일차:
14. TER이 안정화되고 세포가 합류 단층을 형성할 때까지 상피 전압/옴 미터를 사용하여 매일 경상피 저항(TER)을 모니터링합니다.

2. PMN 절연

1. 실온 구배 용액, 50mM K₂EDTA 및 칼슘/마그네슘(HBSS-)이 없는 Hanks의 균형 염 용액(HBSS)을 실온으로 제공합니다.
2. 50mL 코니컬 튜브에서 이중 밀도 그래디언트를 준비합니다.
3. 60mL 주사기에 6mL의 50mM K₂EDTA를 코팅하고 기증자로부터 54mL의 혈액을 채취합니다.
4. 15mL의 혈액을 위에서 준비한 이중 밀도 구배에 오버레이합니다.
5. 브레이크를 끈 상태에서 실온에서 30분 동안 700 x g 의 원심분리기.
6. 혈청, 말초 혈액 단핵구, 계면을 흡인하고 PMN을 포함하는 층을 새로운 50mL 원추형 튜브로 옮기고 HBSS-에서 50mL로 재현탁합니다.
7. 실온에서 700 x g 에서 10분 동안 원심분리기.
8. 상층액을 흡인하고 펠릿을 40mL의 차가운 적혈구 용해 완충액에 재현탁합니다.
9. 700 x g 에서 4°C에서 10분간 원심분리기.
10. 상등액을 흡인하고 모든 튜브의 펠릿을 3mL의 HBSS-로 결합합니다.
11. PMN의 농도를 결정하고 HBSS-의 적절한 정도를 사용하여 5x10⁴ 로 희석합니다.

3. 체외 pH 모니터링 분석

1. 칼슘/마그네슘(HBSS+)이 함유된 HBSS를 37°C 수조에서 20분 동안 데웁니다.
2. 조직 배양 후드에 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 표면을 닦아 준비합니다.
3. HBSS+에 70% 에탄올을 뿌리고 닦은 다음 조직 배양 후드로 가져옵니다.
4. h 분석을 수행하기 전에 각 웰에 1mL의 HBSS+를 추가하고 37°C 인큐베이터에 넣어 pH 감지 플레이트를 평형화합니다.
5. 분석 최소 전에 인큐베이터에서 pH 감지 플레이트를 제거하고 각 웰에 1μM fMLP를 추가합니다.
6. pH 감지 플레이트를 SDS 리더에 37°C로 놓고 pH를 기록하여 실험의 기준선을 설정합니다.
7. pH 판독값이 안정화되면 인서트에서 매체를 제거하고 상단 웰에 180μL HBSS+를 추가합니다.
8. 웰을 제어하기 위해 20μL HBSS+를 추가하거나 20μL PMN을 추가합니다.
9. HBSS+를 제거하고 인서트를 pH 감지 플레이트로 옮깁니다.
10. 하단 웰에 1μM fMLP가 있거나 없는 HBSS+ 1mL를 추가합니다.
11. 상단 웰에 180μL의 HBSS+를 추가합니다.
12. 상단 웰에 0 또는 1 x 10⁶ PMN을 포함하는 20μl의 HBSS-를 추가합니다.
13. SDS 리더의 pH 감지 플레이트를 37°C에 놓습니다(그림 2).
14. 연결된 컴퓨터에서 pH 모니터링 소프트웨어를 열고 지정된 시간 간격(1-10분마다)으로 pH를 기록하도록 소프트웨어를 설정합니다.

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결과

결과는 일반적으로 시간 경과에 따른 pH 변화를 보여주는 선 그래프( 그림 3A에 표시된 예) 또는 단일 시점에서 세포 외 pH를 보여주는 산점도( 그림 3B에 표시된 예)를 통해 표시됩니다. 실험적 필요에 따라 추가 대조군 및 치료법이 포함될 수 있습니다. 또한 이 분석은 광범위한 조건에서 세포 외를 모니터링하도록 수정할 수 있?...

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토론

이 프로토콜에는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 단층은 합류해야 하지만 과도하게 융합되어서는 안 됩니다. T84 IEC의 경우 도금 후 7-10일 후에 사용해야 합니다. 인간 장과 쥐 장은 T84 IEC와 다른 속도로 성장하며, 연구자들은 각 라인이 합류점에 도달하는 데 걸리는 시간을 결정해야 합니다. 연구진이 세포 외 pH의 변화를 관찰하기 위해 최소한으로 완충된 배지를 사용해야...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipettes	Corning	4101
24-well plate	Corning	CLS3527-100EA
5 mm pore inserts	Corning	3421
50 ml sterile conical tube	Corning	0553855A
75 cm2 flask	Corning	430641U
DMEM/F12	Gibco	10565-018
FBS	Gibco	26140
GlutaMax	ThermoFisher	35050061
HBSS-	Sigma-Aldrich	H4891-10X1L
HBSS+	Sigma-Aldrich	H1387-10L
Histopaque T1077	Sigma-Aldrich	10771-6X100ML
Histopaque T1119	Sigma-Aldrich	11191-6X100ML
HydroDish HD24	PreSens	NA	https://www.presens.de/products/detail/hydrodish-hd24
PBS	Gibco	14190-144
Pen Strep	Gibco	15140-122
RBC lysis buffer	ThermoFisher	00-4333-57
SDR Reader	PreSens	NA	https://www.presens.de/products/detail/sdr-sensordish-reader-basic-set
Trypsin	Fisher Scientific	25200114