In vitro Monitoramento do pH extracelular em tempo real

Resumo

Este artigo representa um ensaio in vitro útil para medir as alterações no pH extracelular durante a migração transepitelial (TEM) de neutrófilos (PMN)

Resumo

O acúmulo precoce de neutrófilos (PMN) é uma característica da inflamação intestinal aguda. Essa inflamação aguda é resolvida ou progride para inflamação crônica. Sem a depuração eficiente do PMN nos locais de infiltração, o PMN pode se acumular e contribuir para condições inflamatórias crônicas, incluindo as doenças intestinais, colite ulcerativa (UC) e doença de Crohn (DC). O pH no cólon distal em indivíduos com colite ulcerativa ativa pode variar entre um pH de 5 e 6, enquanto indivíduos saudáveis mantêm o pH do cólon na faixa de 6,8-7,4. O pH extracelular demonstrou influenciar tanto as células epiteliais intestinais quanto as células imunes infiltrantes. Mais especificamente, a acidose extracelular afeta significativamente o PMN. Em pH abaixo de 6,5, há aumentos na produção de H₂O₂, inibição da apoptose e aumento na vida útil funcional do PMN. Dada a presença significativa de PMN e acidificação extracelular em locais de inflamação, desenvolvemos um novo modelo que permite o monitoramento do pH extracelular durante a migração transepitelial do PMN em tempo real. Aqui, descrevemos este modelo e como ele pode ser utilizado para medir o pH apical e basal durante o tráfego de PMN. Este modelo pode ser utilizado para monitorar o pH extracelular sob uma ampla gama de condições; incluindo hipóxia, migração transepitelial de PMN e por longos períodos de tempo.

Introdução

O microambiente extracelular demonstrou desempenhar um papel significativo na modulação da resposta inflamatória. Um aspecto do microambiente que muitas vezes é subestimado é a acidificação extracelular. A acidificação extracelular é frequentemente observada em locais de inflamação ativa, incluindo distúrbios da mucosa, como doenças inflamatórias intestinais. O pH luminal no cólon distal de pacientes com colite ulcerativa pode variar entre 5 e 6, enquanto indivíduos saudáveis apresentam pH colônico na faixa de 6,8-7,4 ^1,2. Essa diminuição no pH do cólon é de particular interesse porque o pH extracelular demonstrou influenciar amplamente o IEC e a infiltração da função das células imunes. Microambientes ácidos, por exemplo, demonstraram prolongar a vida funcional de desovas de PMN infiltrante, estimular a produção de H₂O₂ e inibir a apoptose de PMN ^3,4. O mecanismo exato pelo qual o ambiente extracelular se torna ácido permanece obscuro, destacando a necessidade de desenvolver técnicas para estudar a acidificação ao longo do tempo.

Em um estudo recente, foi demonstrado que o PMN TEM resulta em uma acidificação significativa do microambiente e que o IEC responde rapidamente a essa acidificação por meio da regulação positiva adaptativa do SLC26A3, o principal transportador de cloreto-HCO₃ no tecido mucoso ^5,6, promovendo assim a homeostase do pH⁷. O(s) mecanismo(s) exato(s) pelo qual o PMN TEM induz a acidificação extracelular permanece obscuro. Atualmente, acredita-se que a acidificação tecidual seja causada pelo aumento do acúmulo de ácido lático resultante do aumento da glicólise e foi recentemente observado que o PMN TEM estimula a liberação de lactato da IEC ^7,8. No entanto, os níveis de lactato secretado não são totalmente responsáveis pela acidificação observada durante o PMN TEM. Uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na acidificação extracelular permitirá a identificação potencial de novos alvos terapêuticos. Para entender melhor o mecanismo envolvido, é necessário haver um sistema que permita o monitoramento do pH por um longo período de tempo, permitindo a transmigração do PMN na direção apical para basal fisiologicamente relevante. O uso de uma sonda de pH é demorado e requer manipulação repetida do sistema de cultura. Atualmente, existem várias técnicas não invasivas para monitorar o pH ao longo do tempo. Um ensaio comumente usado utiliza 2',7'-bis(2-carboxietil)-5,6-carboxifluoresceína (BCECF), um corante que é internalizado pela célula, no entanto, este ensaio é limitado ao estudo do pH ^{interno 9}. Existem vários ensaios de placa de pH, mas a maioria está disponível apenas em um formato de 96 poços ou requer a adição de corantes sensíveis ao pH. O protocolo descrito abaixo é baseado em uma placa de detecção de pH disponível comercialmente que foi projetada para monitoramento não invasivo do pH por um longo período de tempo¹⁰. As células são cultivadas como uma monocamada em uma placa de 24 poços que contém um sensor de pH pré-calibrado. Este sensor contém um corante luminescente que é excitado por um leitor de placas especializado. A vida útil da luminescência, que depende do pH, também é medida pelo leitor de placas. No entanto, este modelo carece de um compartimento apical e basal, impedindo o estudo da transmigração ou diferenças basais/apicais na acidificação.

Descrito é um protocolo que permite a avaliação in vitro da acidificação extracelular durante o PMN TEM, usando células epiteliais intestinais T84 humanas cultivadas em inserções transwell, PMN humano e um sensor de pH não invasivo baseado em fluorescência. É fornecido um exemplo bem-sucedido em que o pH extracelular é examinado ao longo de 10 horas e demonstra que o PMN TMN ativo resulta em acidificação extracelular. Embora um exemplo específico seja apresentado, este protocolo pode ser utilizado para avaliar o efeito de qualquer número de fatores; incluindo metabólitos, tipos de células e potenciais terapêuticas, no pH extracelular.

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Protocolo

1. Preparação da célula

Dia 1

1. Meios de cultura de células quentes (DMEM/F12 com 5% de FBS, 2 mM de dipeptídeo de L-alanil-L-glutamina e Pen Strep) em banho-maria a 37 °C por 20 min.
2. Prepare a capa de cultura de tecidos borrifando-a com etanol a 70% e limpando as superfícies com toalhas de papel.
3. Pulverize e limpe frascos e frascos de mídia de cultura de tecidos, PBS e frascos de tripsina com etanol a 70% e leve-os para a capa de cultura de tecidos.
4. Aspirar o meio do balão de cultura de células e lavar as células com 12 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
5. Aspire o PBS e adicione 1 mL de tripsina às células. Incube em RT por 10-20 min, até que as células se desprendam.
6. Adicione 11 mL de meio de cultura de células à tripsina e misture pipetando para cima e para baixo 3-5 vezes.
7. Inverta uma placa de cultura de células de 24 poços contendo inserções de poros de 5 μm e pipete suavemente 100 μL da suspensão celular para a parte inferior da inserção (Figura 1).
8. Colocar a placa invertida numa incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.
   Dia 2
9. Aquecer os meios de cultura celular em banho-maria a 37 °C durante 20 min.
10. Prepare a capa de cultura de tecidos borrifando-a com etanol a 70% e limpando as superfícies com toalhas de papel.
11. Pulverize e limpe frascos e frascos de mídia de cultura de tecidos, PBS e frascos de tripsina com etanol a 70% e leve-os para a capa de cultura de tecidos.
12. Endireite a placa de cultura de tecidos e adicione suavemente 1 mL de meio ao compartimento basal e 180 μL ao compartimento apical.
13. Colocar a placa numa incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.
    Dia 3-7:
14. Monitore a resistência transepitelial (TER) diariamente, usando um voltímetro epitelial/Ohm, até que o TER se estabilize e as células formem uma monocamada confluente.

2. Isolamento PMN

1. Soluções de gradiente de temperatura ambiente, 50 mM K₂EDTA e solução salina balanceada de Hanks (HBSS) sem cálcio/magnésio (HBSS-) à temperatura ambiente.
2. Preparar gradientes de dupla densidade em tubos cónicos de 50 ml.
3. Cubra uma seringa de 60 ml com 6 ml de 50 mM K₂EDTA e recolha 54 ml de sangue do dador.
4. Sobreponha 15 mL de sangue aos gradientes de dupla densidade preparados acima.
5. Centrifugue a 700 x g por 30 min em temperatura ambiente, com o freio desligado.
6. Aspirar o soro, o monócito do sangue periférico, as interfases e transferir a camada contendo PMN para um novo tubo cónico de 50 ml e ressuspender para 50 ml em HBSS-.
7. Centrifugue a 700 x g por 10 min em temperatura ambiente.
8. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 40 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos frios.
9. Centrifugar a 700 x g durante 10 minutos a 4 °C.
10. Aspire o sobrenadante e combine os pellets de todos os tubos em 3 mL de HBSS-.
11. Determinar a concentração de PMN e diluir a 5x10⁴ utilizando o nível de HBSS-.

3. Ensaio de monitoramento de pH in vitro

1. Aqueça HBSS com cálcio/magnésio (HBSS+) em banho-maria a 37 °C por 20 min.
2. Prepare a capa de cultura de tecidos borrifando-a com etanol a 70% e limpando as superfícies com toalhas de papel.
3. Pulverize e limpe HBSS+ com etanol 70% e leve-os para a capa de cultura de tecidos.
4. h antes da realização do ensaio, equilibre as placas de detecção de pH adicionando 1 mL de HBSS+ a cada poço e colocando-as em uma incubadora a 37 °C.
5. min antes do ensaio, remova as placas de detecção de pH da incubadora e adicione 1 μM de fMLP a cada poço.
6. Coloque a placa de detecção de pH no leitor SDS a 37 °C e registre o pH para estabelecer uma linha de base para o experimento.
7. Assim que a leitura do pH se estabilizar, remova a mídia das inserções e adicione 180 μL de HBSS+ ao poço superior.
8. Adicione 20 μL de HBSS+ para controlar os poços ou 20 μL de PMN.
9. Remova o HBSS+ e transfira as inserções para a placa de detecção de pH.
10. No poço inferior, adicione 1 mL de HBSS+ com e sem 1 μM de fMLP.
11. No poço superior, adicione 180 μL de HBSS+.
12. No poço superior, adicione 20 μl de HBSS - contendo 0 ou 1 x 10⁶ PMN.
13. Coloque a placa de detecção de pH no leitor SDS a 37 °C (Figura 2).
14. No computador conectado, abra o software de monitoramento de pH e configure-o para registrar o pH em intervalos de tempo designados (a cada 1-10 minutos).

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Resultados

Os resultados geralmente são via gráfico de linhas para mostrar a mudança no pH ao longo do tempo (exemplo mostrado na Figura 3A) ou como um gráfico de dispersão mostrando o pH extracelular em um único ponto no tempo (exemplo mostrado na Figura 3B). Dependendo da necessidade experimental, controles e tratamentos adicionais podem ser incluídos. Além disso, este ensaio pode ser modificado para monitorar extracelular sob um...

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Discussão

Neste protocolo, existem várias etapas importantes. As monocamadas devem ser confluentes, mas não superconfluentes. Para T84 IEC, eles devem ser usados de 7 a 10 dias após o revestimento. Os enteróides humanos e murinos crescem em taxas diferentes do T84 IEC e os pesquisadores devem determinar quanto tempo leva para cada linha atingir a confluência. É importante que os pesquisadores precisem usar meios minimamente tamponados para garantir que mudanças no pH extracelular sejam obse...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipettes	Corning	4101
24-well plate	Corning	CLS3527-100EA
5 mm pore inserts	Corning	3421
50 ml sterile conical tube	Corning	0553855A
75 cm2 flask	Corning	430641U
DMEM/F12	Gibco	10565-018
FBS	Gibco	26140
GlutaMax	ThermoFisher	35050061
HBSS-	Sigma-Aldrich	H4891-10X1L
HBSS+	Sigma-Aldrich	H1387-10L
Histopaque T1077	Sigma-Aldrich	10771-6X100ML
Histopaque T1119	Sigma-Aldrich	11191-6X100ML
HydroDish HD24	PreSens	NA	https://www.presens.de/products/detail/hydrodish-hd24
PBS	Gibco	14190-144
Pen Strep	Gibco	15140-122
RBC lysis buffer	ThermoFisher	00-4333-57
SDR Reader	PreSens	NA	https://www.presens.de/products/detail/sdr-sensordish-reader-basic-set
Trypsin	Fisher Scientific	25200114