Isolement de la microglie primaire à partir de cerveaux de souris postnatales

Résumé

La culture cellulaire primaire est l’une des approches les plus utilisées pour étudier la biologie microgliale in vitro. Ici, nous avons développé une méthode d’isolement simple et rapide de la microglie de la souris du jour postnatal 1 (P1) à P4.

Résumé

Les microglies sont les phagocytes mononucléaires du système nerveux central (SNC), qui jouent un rôle clé dans le maintien de l’homéostasie et la régulation du processus inflammatoire dans le SNC. Pour étudier la biologie microgliale in vitro, les microglies primaires présentent de grands avantages par rapport aux lignées cellulaires microgliales immortalisées. Cependant, l’isolement de la microglie du cerveau postnatal de la souris est relativement moins efficace et prend moins de temps. Dans ce protocole, nous fournissons une méthode rapide et facile à suivre pour isoler la microglie primaire du cerveau de souris néonatale. Les étapes générales de ce protocole comprennent la dissection cérébrale, la culture de cellules cérébrales primaires et l’isolement de la microglie. En utilisant cette approche, les chercheurs peuvent obtenir une microglie primaire d’une grande pureté. De plus, les microglies primaires récoltées ont été en mesure de répondre au défi des lipopolysaccharides, indiquant qu’elles ont conservé leur fonction immunitaire. Collectivement, nous avons développé une approche simplifiée pour isoler efficacement la microglie primaire avec une grande pureté, ce qui facilite un large éventail d’investigations en biologie microgliale in vitro.

Introduction

Les microglies, les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC), jouent un rôle central dans le maintien de l’homéostasie, qui répond aux défis neuropathologiques¹. Récemment, des recherches intensives ont été menées pour comprendre les fonctions physiologiques de la microglie, par exemple dans la maladie d’Alzheimer². Actuellement, le profil transcriptionnel de la microglie à la résolution unicellulaire obtenue au cours du développement du SNC, du vieillissement et de la maladie permet de mieux comprendre la fonction microgliale dans les cerveaux sains et malades³. Des études antérieures ont identifié un sous-type microglial associé à la maladie dans la MA et d’autres maladies neurodégénératives ^4,5,6. Cette sous-population est proximale aux dépôts de β amyloïde (Aβ). Les gènes associés à la phagocytose et au métabolisme des lipides (p. ex., Apoe, Tyrobp) se sont révélés être régulés à la hausse dans ces populations ^6,7. Cependant, les processus subcellulaires, les voies de signalisation extracellulaires et intracellulaires qui régulent les changements de profil moléculaire dynamique dans la microglie ne sont pas entièrement compris. En particulier, le mécanisme sous-jacent à l’activation microgliale chronique dans les maladies neurodégénératives reste insaisissable. Par conséquent, il est crucial de comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans la microglie, car les réponses microgliales contribuent clairement au développement du cerveau et à la progression de la neurodégénérescence.

Bien qu’il existe quelques outils in vivo et in vitro pour étudier la microglie, il existe encore certaines limites. Il est techniquement difficile d’obtenir un nombre suffisant de cellules microgliales d’une grande pureté pour mener régulièrement des expériences, telles que le western blot, afin d’élucider les voies de signalisation intracellulaires. La culture microgliale primaire offre un moyen alternatif d’étudier la biologie de la microglie. La microglie primaire cultivée peut être appliquée pour analyser la capacité phagocytaire microgliale après manipulation de gènes, et évaluer la production de cytokines pro- et anti-inflammatoires en réponse à des stimuli inflammatoires, et d’autres aspects biologiques pour comprendre leurs rôles dans le cerveau⁸. Ici, nous présentons un nouveau protocole et décrivons une instruction étape par étape pour l’isolement et la culture de la microglie primaire à partir du cerveau de souris néonatale, en mettant l’accent sur les étapes essentielles à l’obtention de cellules microgliales primaires saines et pures.

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Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le comité de recherche animale et le groupe d’administration institutionnelle des soins aux animaux de laboratoire de l’Université Jiao Tong de Shanghai. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance animale.

1. Préparation du tampon de culture, des flacons et des lamelles

1. Milieu de culture et milieu de culture microgliale : Compléter le DMEM avec 10 % de FBS pour obtenir le milieu de culture. Le milieu de culture microgliale est fabriqué en ajoutant 10 % de FBS et 20 % de milieu conditionné LADMAC au DMEM. Ajouter 1 % de pénicilline/streptomycine aux deux milieux.
   1. Pour préparer un milieu conditionné à 20 % de LADMAC, prélever le milieu de culture dans les cellules LADMAC, centrifuger à 200 x g pendant 10 min, filtrer à l’aide d’une crépine cellulaire de 0,22 μm, puis stocker les aliquotes à -80 °C.
2. Tampon de digestion : Préparez le tampon de digestion en ajoutant 8 U/mL de papaïne et 125 U/mL de DNase au DMEM.
   REMARQUE : Pour de meilleurs résultats, le tampon de digestion doit être préparé frais. Calculez la quantité souhaitée en fonction du nombre de petits (1 mL de solution pour 2 petits).
3. Fioles d’enrobage : Utilisez des fioles T25 ou T75 pour pré-plaquer les cellules cérébrales isolées. Avant le curage cérébral, enrober les flacons T25 d’une dose de 2 mL (ou 4 mL pour une fiole T75) de poly-D-lysine (PDL) de 0,1 mg/mL et incuber à 37 °C pendant au moins 1 h. Aspirez la solution PDL, lavez deux fois avec 1x PBS, puis laissez le flacon sécher à l’air libre dans le capot de culture cellulaire.
   REMARQUE : La taille et le nombre de flacons utilisés dans l’expérience dépendaient du nombre de petits postnatals. Pour permettre aux cellules d’atteindre la couche de cellules astrocytaires confluentes en peu de temps, préparez une fiole T25 pour 3 à 5 cerveaux, ou une fiole T75 pour 5 cerveaux. Les flacons enrobés non utilisés peuvent être conservés à 4 °C pendant un mois maximum. Pour gagner du temps, une solution mère 10x (1 mg/mL) de PDL peut être préparée avant le début de l’expérience et stockée à -20 °C sous forme d’aliquotes à usage unique. Diluez les aliquotes dans du PBS stérile 1x juste avant utilisation.
4. Préparez les lamelles : Lavez les lamelles en verre commercial avec 0,1 M HCl pendant 1 h, rincez-les deux fois à l’eau d’autoclave, puis stockez-les dans de l’éthanol à 100 %. Avant utilisation, flammez les lamelles à l’aide d’une pince fine avec une lampe à brûleur pour éliminer l’éthanol résiduel. Les lamelles en verre de 8 mm peuvent être placées dans une plaque de 48 puits, et les lamelles de verre de 12 mm peuvent être placées dans une plaque de 24 puits.
5. Préparez les outils de dissection : Faites tremper des ciseaux fins, des pinces et des micro-cuillères en acier inoxydable dans de l’éthanol à 75 % pendant au moins 20 min. Placez ensuite ces outils sous rayonnement ultraviolet dans le capot de culture tissulaire pendant 30 min.

2. Dissection du cerveau de la souris

REMARQUE : Pour évaluer l’efficacité du protocole, nous avons utilisé des souris^{knock-in GFP} CX3CR1 pour le traçage de la microglie⁹. Des souris CX3CR1^GFP/GFP et des femelles sauvages C57BL/6J de 2 à 8 mois ont été croisées pour générer des souris CX3CR1^+/GFP , toutes deux provenant de sources commerciales. Les souris ont été logées sous un cycle lumière-obscurité de 12 à 12 heures dans un environnement spécifique sans agent pathogène (SPF) à l’Université Jiao Tong de Shanghai. Les chiots du jour postnatal 1 au jour 4 peuvent être utilisés pour ce protocole.

1. Décapitez tous les chiots avec des ciseaux chirurgicaux. Pour minimiser la contamination, rincez toutes les têtes avec de l’éthanol à 75 % et mettez-y rapidement le 1x PBS glacé. Pendant ce temps, réchauffez le tampon de digestion et le milieu de co-culture dans un bain-marie à 37 °C.
   REMARQUE : Décapitez et isolez le tissu cérébral d’un chiot à la fois pour préserver l’intégrité structurelle. Pour éviter la contamination, tous les outils chirurgicaux doivent être placés dans de l’éthanol à 75 % entre les décapitations.
2. Utilisez des ciseaux de dissection fins pour couper le crâne avec le bulbe rachidien. Placez une micro-cuillère en acier inoxydable sous le tissu cérébral du site de coupe pour extraire le cerveau de la cavité crânienne. Transférez-le dans une nouvelle assiette réfrigérée à 6 puits contenant 2 ml de pré-froid 1x PBS par puits.
3. Coupez et jetez le cervelet et les bulbes olfactifs. Transférez doucement le tissu cérébral restant dans une assiette réfrigérée à 6 puits contenant 2 ml de PBS 1x pré-froid.
   REMARQUE : Placez 4-5 tissus cérébraux dans un puits.
4. Répétez la même procédure pour les têtes restantes jusqu’à ce que tous les tissus soient recueillis.

3. Ensemencez les cellules primaires mélangées

1. Aspirez 1,5 ml de 1x PBS dans la plaque à 6 puits et hachez complètement le tissu cérébral en petits morceaux (environ 1 mm²) à l’aide de ciseaux à ressort.
   REMARQUE : Pour réduire la quantité de débris fins, ne hachez pas trop le tissu.
2. Ajouter la quantité désirée de tampon de digestion dans le puits (0,5 mL de tampon de digestion par cerveau), puis placer la plaque dans l’incubateur humidifié à 5 % de CO₂, 37 °C pendant 20 min. Agitez l’assiette toutes les 10 min.
   REMARQUE : Pendant la période d’incubation, mouiller une passoire à cellules de 70 μm avec un milieu de culture (10 % FBS en DMEM), puis placer la passoire dans un tube de prélèvement frais de 50 mL.
3. Sortez la plaque de l’incubateur et terminez la digestion de la papaïne en ajoutant 3 ml de milieu de culture dans chaque puits. Pipeter doucement les cellules de haut en bas 10 fois à l’aide d’une pipette de 1 ml. Transférez le mélange dans un tube de 15 ml et laissez reposer 1 min. Une pastille de cellules troubles peut être vue au fond. Pour éliminer les gros amas et les débris cellulaires, passez soigneusement la suspension cellulaire dans une crépine cellulaire de 70 μm et recueillez l’écoulement dans le tube de collecte de 50 ml.
4. Ajouter 3 mL de milieu de culture chauffé (10 % FBS dans le DMEM) à la pastille de cellule non dissociée dans le tube de 15 mL. Triturez 10 fois comme aux étapes 3.3 pour continuer la dissociation. Laissez le tissu se déstabiliser pendant 1 min, puis passez la suspension cellulaire à travers la passoire jusqu’au tube de prélèvement de 50 ml. Répétez cette étape et jetez les débris cellulaires restants.
5. Transférez la suspension cellulaire du tube de collecte de 50 mL dans des tubes de 15 mL et centrifugez les cellules à 200 x g pendant 10 min à température ambiante.
6. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 5 mL de milieu de culture. Ensemencer les cellules primaires dans un ballon T25 ou T75 à une densité cellulaire d’environ 5 x 10⁶ et les cultiver dans l’incubateur humidifié (5 % de CO₂, 37 °C). C’est le jour 0 dans ce calendrier de culture.
   REMARQUE : Si les cellules sont ensemencées dans une fiole T25, un volume final de 5 mL de milieu par fiole est suffisant. Ajouter 5 mL de milieu de culture supplémentaire dans chaque fiole lorsqu’il est ensemencé dans une fiole T75.

4. Collecte de la microglie primaire

1. Évaluez la confluence des cellules mixtes le lendemain (jour 1). Étant donné que les cellules mixtes ont été ensemencées à une densité assez élevée, il faut 3 à 4 jours pour que les astrocytes atteignent la confluence, ce qui permet de collecter la microglie 1 à 2 jours plus tard.
   REMARQUE : Soyez prudent si les cellules ne sont pas fixées au fond du ballon le lendemain. Cela peut être dû à une contamination cellulaire ou à la mort cellulaire causée par une digestion excessive ou une manipulation brutale.
2. Le jour 2, laver les flacons avec 3 mL de 1x PBS chaud deux fois et changer le milieu en ajoutant 3 à 5 mL de milieu de culture frais dans chaque fiole T25 (7 à 10 mL pour une fiole T75). Le milieu de culture mis au rebut contient des débris cellulaires et divers types de cellules, notamment des neurones, des oligodendrocytes et des microglies.
3. Le jour 4, assurez-vous que les astrocytes attachés au fond du ballon sont à 100 % de confluence. Pendant ce temps, une sous-population de microglie est faiblement attachée à la couche superficielle cellulaire mixte qui peut facilement se détacher de la surface et flotter dans le milieu de culture en secouant la main. Transférez le milieu de culture dans une plaque fraîche à 6 puits, et les microglies primaires enrichies dans le milieu sont collectées au cours de ce processus. Ensuite, fournissez aux cellules de la plaque d’origine à 6 puits un milieu de culture frais pour une collecte ultérieure de cellules.
   REMARQUE : Il est approprié de tapoter les flacons sur la table ou de les agiter sur un agitateur de laboratoire à 180 tr/min pendant 30 minutes avant le transfert de milieu pour obtenir plus de cellules.
4. Placez soigneusement le 6 puits dans l’incubateur pour permettre la fixation des cellules. Environ 2 h après l’incubation, toutes les cellules seront fixées à la plaque. Lorsque les cellules sont fixées, lavez-les doucement avec du 1x PBS chaud deux fois pour éliminer les agrégats cellulaires et les débris cellulaires ; ensuite, fournissez aux cellules 3 mL de milieu de culture de microglie frais. Les cellules microgliales isolées peuvent être maintenues pendant plus d’un mois in vitro en rafraîchissant le milieu de culture microgliale tous les 2 jours.
   REMARQUE : Le facteur de stimulation des colonies 1 (CSF1) est un facteur de croissance important pour soutenir la survie de la microglie in vitro. Des études antérieures rapportent que le CSF1 peut être sécrété à partir de la lignée cellulaire LADMAC, qui est une lignée cellulaire transformée provenant de cellules de moelle osseuse de souris. Le milieu conditionné au LADMAC peut être collecté par centrifugation de la culture LADMAC à 200 x g pendant 10 min ; Ensuite, faites passer le surnageant dans une crépine cellulaire de 0,22 μm. Le milieu de culture de microglie a été préparé en ajoutant 20 % de milieu conditionné LADMAC au milieu de culture (10 % FBS, DMEM).
5. Tous les 2-3 jours, continuez à prélever la microglie dans le milieu de culture cellulaire mixte comme à l’étape 4.4. Cultivez les cellules mélangées restantes dans le ballon et utilisez-les pour récolter régulièrement des microglies tous les 2-3 jours pendant jusqu’à 1 mois.
   REMARQUE : La microglie peut être récoltée avec succès en recueillant le milieu sous forme de cellules de culture mixte pendant une période allant jusqu’à 50 jours. À chaque fois, le milieu de co-culture collecté produira environ ~1-3 x 10⁵ cellules microgliales par flacon T75. Combinez les cellules microgliales, si nécessaire.
6. Utilisez des cellules microgliales primaires pour le test fonctionnel souhaité.

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Résultats

La figure 1 a démontré que la microglie primaire prélevée dans CX3CR1^+/GFP au jour 7 et au jour 35 après l’ensemencement cellulaire a été mise en évidence. Comme le montre la coloration par immunofluorescence du marqueur de cellules microgliales/macrophages IBA1, toutes les cellules positives d’IBA1 sont positives pour les signaux GFP, et négatives pour S100β (marqueur astrocytaire) et CC1 (marqueur oligodendrocytaire), ce qui suggè...

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Discussion

Ce protocole est basé sur les méthodes décrites précédemment avec quelques modifications¹¹. Les conseils pour améliorer la viabilité et la pureté de la microglie isolée sont énumérés ci-dessous. Tout d’abord, veillez à éviter la contamination lors de la préparation des tampons utilisés pour l’isolement des tissus et la culture cellulaire. Assurez-vous que les outils chirurgicaux, les contenants et le matériel en plastique sont stériles. Habit...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell strainers, 40 µm	ThermoFisher Scientific	22-363-547
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco by Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco by Life Technologies	10099141
Papain, Suspension	Sangon Biotech	Papain, Suspension
Penicillin-Streptomycin 100X solution	Hyclone	SV30010
Poly-D-Lysine	ThermoFisher Scientific	A3890401