Выделение первичной микроглии из постнатального мозга мышей

Резюме

Первичная клеточная культура является одним из наиболее часто используемых подходов к изучению биологии микроглии in vitro. Здесь мы разработали метод простой и быстрой изоляции микроглии от мышей с 1-го дня (P1) до P4 после рождения.

Аннотация

Микроглия – это мононуклеарные фагоциты в центральной нервной системе (ЦНС), которые играют ключевую роль в поддержании гомеостаза и регуляции воспалительного процесса в ЦНС. Для изучения биологии микроглии in vitro первичная микроглия демонстрирует большие преимущества по сравнению с иммортализированными клеточными линиями микроглии. Тем не менее, выделение микроглии из постнатального мозга мыши относительно менее эффективно и занимает много времени. В этом протоколе мы предоставляем быстрый и простой в использовании метод выделения первичной микроглии из мозга неонатальной мыши. Общие этапы этого протокола включают вскрытие мозга, первичную культуру клеток мозга и изоляцию микроглии. Используя этот подход, исследователи могут получить первичную микроглию с высокой чистотой. Кроме того, собранная первичная микроглия была способна реагировать на вызов липополисахаридами, что указывает на то, что они сохранили свою иммунную функцию. Вместе мы разработали упрощенный подход к эффективному выделению первичной микроглии с высокой чистотой, что облегчает широкий спектр исследований микроглии in vitro.

Введение

Микроглия, резидентные иммунные клетки в центральной нервной системе (ЦНС), играют ключевую роль в поддержании гомеостаза, который реагирует на невропатологические вызовы¹. В последнее время проводятся интенсивные исследования с целью выяснить физиологические функции микроглии, например,^{при болезни} Альцгеймера. В настоящее время транскрипционный профиль микроглии с одноклеточным разрешением, полученным во время развития, старения и заболевания ЦНС, обеспечивает лучшее понимание функции микроглии в^{здоровом и} больном мозге. В предыдущих исследованиях был выявлен ассоциированный с заболеванием подтип микроглии при болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваниях ^4,5,6. Эта субпопуляция находится проксимальнее отложения амилоидных β (Aβ). Было обнаружено, что гены, связанные с фагоцитозом и метаболизмом липидов (например, Apoe, Tyrobp), активируются в этих популяциях ^6,7. Тем не менее, субклеточные процессы, внеклеточные и внутриклеточные сигнальные пути, которые регулируют динамические изменения молекулярного профиля микроглии, до конца не изучены. В частности, механизм, лежащий в основе хронической активации микроглии при нейродегенеративных заболеваниях, остается неясным. Таким образом, крайне важно понимать клеточные механизмы, связанные с микроглией, поскольку реакции микроглии явно способствуют развитию мозга и прогрессированию нейродегенерации.

Хотя существует несколько инструментов in vivo и in vitro для изучения микроглии, все же есть некоторые ограничения. Технически сложно получить достаточно большое количество микроглиальных клеток с высокой чистотой для рутинного проведения экспериментов, таких как вестерн-блоттинг, для выяснения внутриклеточных сигнальных путей. Первичная культура микроглии предоставляет альтернативные средства для изучения биологии микроглии. Культивируемая первичная микроглия может быть применена для анализа фагоцитарной способности микроглии после манипуляций с генами, а также для оценки продукции про- и антивоспалительных цитокинов в ответ на воспалительные стимулы, а также других биологических аспектов для понимания их роли^{в мозге}. В этой статье мы представляем новый протокол и описываем пошаговую инструкцию по выделению и культивированию первичной микроглии из мозга новорожденной мыши, уделяя особое внимание этапам, которые имеют решающее значение для получения здоровых и чистых первичных клеток микроглии.

протокол

Все процедуры на животных были одобрены комитетом по исследованиям на животных и институциональной административной комиссией по уходу за лабораторными животными в Шанхайском университете Цзяотун. Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных.

1. Подготовка буфера для культуры, колб и покровных стекол

1. Питательная среда и питательная среда для микроглии: Дополните DMEM 10% FBS для получения питательной среды. Питательная среда для микроглии изготавливается путем добавления в DMEM 10% FBS и 20% кондиционированной среды LADMAC. Добавьте 1% пенициллин/стрептомицин в обе среды.
   1. Чтобы получить 20% кондиционированную среду LADMAC, соберите питательную среду из клеток LADMAC, центрифугируйте при 200 x g в течение 10 минут, отфильтруйте с помощью клеточного фильтра 0,22 мкм, а затем храните аликвоты при -80 °C.
2. Буфер для разложения: Приготовьте буфер для разложения, добавив 8 Ед/мл папаина и 125 Ед/мл ДНКазы в DMEM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов буфер для разложения должен быть приготовлен свежим. Рассчитайте желаемое количество, исходя из количества щенков (1 мл раствора на каждые 2 щенка).
3. Покрытие колб: Используйте колбы T25 или T75 для предварительного покрытия изолированных клеток мозга. Перед вскрытием мозга в колбах Т25 наносят 2 мл (или 4 мл для колбы Т75) 0,1 мг/мл поли-D-лизина (PDL) и инкубируют при 37 °C в течение не менее 1 ч. Отсадите раствор PDL, дважды промойте 1x PBS, а затем дайте колбе высохнуть на воздухе в колбе для клеточных культур.
   Примечание: Размер и количество колб, использованных в эксперименте, зависели от количества постнатальных щенков. Чтобы клетки за короткое время достигли сливающегося клеточного слоя астроцитов, приготовьте одну колбу Т25 для 3-5 мозгов или одну колбу Т75 для 5 мозгов. Неиспользованные колбы с покрытием могут храниться при температуре 4 °C до месяца. Для экономии времени до начала эксперимента можно приготовить 10-кратный (1 мг/мл) стоковый раствор PDL и хранить его при температуре -20 °C в виде одноразовых аликвот. Развести аликвоты в стерильном 1x PBS непосредственно перед использованием.
4. Подготовьте покровные стекла: Промойте коммерческие стеклянные покровные стекла 0,1 M HCl в течение 1 часа, дважды промойте автоклавной водой, затем храните в 100% этаноле. Перед использованием прокалите покровные стекла с помощью тонких щипцов с лампой горелки, чтобы удалить остатки этанола. Стеклянные покровные стекла 8 мм могут быть помещены в 48-луночный планшет, а стеклянные покровные стекла 12 мм могут быть помещены в 24-луночный планшет.
5. Подготовьте инструменты для препарирования: замочите тонкие ножницы, щипцы и микроложки из нержавеющей стали в 75% этаноле не менее чем на 20 минут. Затем поместите эти инструменты под ультрафиолетовое излучение в вытяжку для культуры тканей на 30 минут.

2. Вскрытие мозга мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы оценить эффективность протокола, мы использовали мышей CX3CR1^GFP для отслеживания микроглии⁹. Мыши CX3CR1^GFP/GFP и самки дикого типа C57BL/6J в возрасте от 2 до 8 месяцев были скрещены для получения мышей CX3CR1^+/GFP , оба первоначально были получены из коммерческих источников. Мыши содержались в течение 12-12 часов по циклу «свет-темнота» в специфической среде, свободной от патогенов (SPF) в Шанхайском университете Цзяотун. Для этого протокола можно использовать щенков с 1-го по 4-й день после рождения.

1. Обезглавьте всех щенков хирургическими ножницами. Чтобы свести к минимуму загрязнение, промойте все головки 75% этанолом и быстро поместите в ледяную 1x PBS. Тем временем нагрейте буфер для сбраживания и сокультуральную среду на водяной бане при температуре 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обезглавливайте и изолируйте мозговую ткань от одного щенка за раз, чтобы сохранить структурную целостность. Чтобы предотвратить загрязнение, все хирургические инструменты должны быть помещены в 75% этанол между обезглавливаниями.
2. Используйте тонкие ножницы для препарирования, чтобы разрезать череп вместе с продолговатым мозгом. Поместите микроложку из нержавеющей стали под ткань мозга от места разреза, чтобы выдавить мозг из полости головы. Переложите его в новую охлажденную 6-луночную тарелку, содержащую 2 мл предварительно охлажденного 1x PBS на лунку.
3. Срежьте и выбросьте мозжечок и обонятельные луковицы. Аккуратно перенесите оставшуюся мозговую ткань в охлажденный 6-луночный планшет, содержащий 2 мл предварительно холодного 1x PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите 4-5 тканей мозга в одну лунку.
4. Повторяйте ту же процедуру для остальных головок, пока не соберется вся ткань.

3. Засейте смешанные первичные клетки

1. Асасируйте 1,5 мл 1x PBS в 6-луночный планшет и полностью измельчите мозговую ткань на мелкие кусочки (примерно 1 мм² ) с помощью пружинных ножниц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить количество мелкого мусора, не переусердствуйте с измельчением ткани.
2. Добавьте в лунку желаемое количество буфера для разложения (0,5 мл буфера для разложения на мозг), затем поместите планшет в инкубатор с 5%_CO2, 37 °C на 20 минут. Поворачивайте тарелку каждые 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инкубации смочите клеточный фильтр 70 мкм питательной средой (10% FBS в DMEM), а затем поместите клеточный фильтр на свежую пробирку для сбора 50 мл.
3. Выньте планшет из инкубатора и завершите переваривание папаина, добавив по 3 мл питательной среды в каждую лунку. Мягко пипетируйте клетки вверх и вниз 10 раз с помощью пипетки объемом 1 мл. Переложите смесь в пробирку объемом 15 мл и дайте ей отстояться в течение 1 минуты. На дне можно увидеть мутную клеточную гранулу. Чтобы удалить большие комки и клеточный мусор, осторожно пропустите клеточную суспензию через клеточное сетчатое фильтр 70 мкм и соберите проточную жидкость в пробирку для сбора объемом 50 мл.
4. Добавьте 3 мл подогретой питательной среды (10% FBS в DMEM) к недиссоциированной клеточной грануле в пробирке объемом 15 мл. Растирайте 10 раз, как в шаге 3.3, чтобы продолжить диссоциацию. Дайте ткани отстояться в течение 1 минуты, а затем пропустите клеточную суспензию через ситечко в пробирку для сбора объемом 50 мл. Повторите этот шаг и выбросьте оставшиеся остатки клеток.
5. Перенесите клеточную суспензию из пробирки для сбора объемом 50 мл в пробирки объемом 15 мл и центрифугируйте клетки при температуре 200 x g в течение 10 минут при комнатной температуре.
6. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 5 мл питательной среды. Высевайте первичные клетки в колбу Т25 или Т75 при плотности клеток примерно 5 х 10⁶ и культивируйте в увлажненном инкубаторе (5%_СО2, 37 °С). Это День 0 в этом расписании культур.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки высеваются в колбу T25, конечного объема среды в 5 мл на колбу достаточно. Добавьте еще 5 мл питательной среды в каждую колбу при посеве в колбу T75.

4. Сбор первичной микроглии

1. Оцените слияние смешанных клеток на следующий день (день 1). Поскольку смешанные клетки были засеяны с довольно высокой плотностью, астроцитам требуется 3-4 дня, чтобы достичь слияния, что позволяет собрать микроглию через 1-2 дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, если на следующий день ячейки не прикреплены к дну колбы; Это может быть связано с загрязнением клеток или гибелью клеток, вызванной перевариванием или жестким обращением.
2. На 2-й день промойте колбы 3 мл теплой среды 1x PBS дважды и смените среду, добавив 3-5 мл свежей питательной среды в каждую колбу T25 (7-10 мл для колбы T75). Отброшенная питательная среда содержит клеточный мусор и различные типы клеток, включая нейроны, олигодендроциты и микроглию.
3. На 4-й день убедитесь, что астроциты, прикрепленные к дну колбы, находятся на 100% конфлюенции. Между тем, субпопуляция микроглии слабо прикреплена к поверхностному слою смешанной клетки, которая может легко отделяться от поверхности и плавать в питательной среде при рукопожатии. Переложите питательную среду в свежий 6-луночный планшет, и в ходе этого процесса будет собрана первичная микроглия, обогащенная средой. Затем снабдите клетки на исходном 6-луночном планшете свежей питательной средой для дальнейшего сбора клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Постукивание колбами по столу или встряхивание колб на лабораторном шейкере при 180 об/мин в течение 30 минут перед переносом среды целесообразно для получения большего количества клеток.
4. Осторожно поместите 6-луночный аппарат в инкубатор, чтобы обеспечить прикрепление клеток. Примерно через 2 ч после инкубации все клетки будут прикреплены к планшету. Когда клетки присоединены, аккуратно промойте их теплым 1x PBS дважды, чтобы удалить клеточные агрегаты и клеточный мусор; Затем снабдите клетки 3 мл свежей питательной среды для микроглии. Выделенные клетки микроглии можно поддерживать более месяца in vitro путем обновления питательной среды микроглии каждые 2 дня.
   Колониестимулирующий фактор 1 (CSF1) является важным фактором роста для поддержания выживания микроглии in vitro. Предыдущие исследования показали, что CSF1 может секретироваться из клеточной линии LADMAC, которая представляет собой трансформированную клеточную линию, происходящую из клеток костного мозга мыши. Кондиционированная среда LADMAC может быть собрана путем центрифугирования культуры LADMAC при температуре 200 x g в течение 10 минут; Затем пропустите надосадочную жидкость через клеточное сетчатое фильтр с плотностью 0,22 мкм. Питательную среду для микроглии получали путем добавления в питательную среду 20% кондиционированной среды LADMAC (10% FBS, DMEM).
5. Каждые 2-3 дня продолжайте собирать микроглию из среды для смешанных клеточных культур, как показано на шаге 4.4. Культивируйте оставшиеся смешанные клетки в колбе и используйте их для последовательного забора микроглии каждые 2-3 дня в течение 1 месяца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Микроглия может быть успешно собрана путем сбора клеток смешанной культуры средней формы в течение 50 дней. Каждый раз из собранной среды для совместной культивирования будет получено около ~1-3 x 10⁵ клеток микроглии на колбу T75. При необходимости объедините клетки микроглии.
6. Используйте первичные микроглиальные клетки для желаемого функционального анализа.

Результаты

Первичная микроглия, собранная из CX3CR1^+/GFP на 7-й и 35-й день после посева клеток, была продемонстрирована на рисунке 1. Как показано при иммунофлуоресцентном окрашивании маркера микроглии/макрофагальных клеток IBA1, все IBA1-положительные клетки являют...

Обсуждение

Этот протокол основан на описанных ранее методах с некоторыми модификациями¹¹. Советы по улучшению жизнеспособности и чистоты изолированной микроглии перечислены ниже. Во-первых, позаботьтесь о том, чтобы избежать загрязнения при приготовлении буферов, ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell strainers, 40 µm	ThermoFisher Scientific	22-363-547
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco by Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco by Life Technologies	10099141
Papain, Suspension	Sangon Biotech	Papain, Suspension
Penicillin-Streptomycin 100X solution	Hyclone	SV30010
Poly-D-Lysine	ThermoFisher Scientific	A3890401