Isolamento primario della microglia da cervelli di topo postnatale

Riepilogo

La coltura cellulare primaria è uno degli approcci principalmente utilizzati per lo studio della biologia microgliale in vitro. Qui, abbiamo sviluppato un metodo per l'isolamento semplice e rapido della microglia dal giorno 1 postnatale del topo (P1) a P4.

Abstract

Le microglia sono i fagociti mononucleati del sistema nervoso centrale (SNC), che svolgono un ruolo chiave nel mantenimento dell'omeostasi e nella regolazione del processo infiammatorio nel SNC. Per studiare la biologia microgliale in vitro, le microglia primarie mostrano grandi vantaggi rispetto alle linee cellulari microgliali immortalizzate. Tuttavia, l'isolamento della microglia dal cervello del topo postnatale è relativamente meno efficiente e richiede molto tempo. In questo protocollo, forniamo un metodo rapido e facile da seguire per isolare la microglia primaria dal cervello di topo neonatale. Le fasi generali di questo protocollo includono la dissezione cerebrale, la coltura di cellule cerebrali primarie e l'isolamento della microglia. Utilizzando questo approccio, i ricercatori possono ottenere microglia primarie con elevata purezza. Inoltre, le microglia primarie raccolte sono state in grado di rispondere alla sfida dei lipopolisaccaridi, indicando che hanno mantenuto la loro funzione immunitaria. Collettivamente, abbiamo sviluppato un approccio semplificato per isolare in modo efficiente le microglia primarie con elevata purezza, che facilita un'ampia gamma di indagini di biologia microgliale in vitro.

Introduzione

Le microglia, le cellule immunitarie residenti nel sistema nervoso centrale (SNC), svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi, che risponde alle sfide neuropatologiche¹. Recentemente, sono state condotte indagini intensive per capire le funzioni fisiologiche della microglia, ad esempio nella malattia di Alzheimer². Attualmente, il profilo trascrizionale della microglia alla risoluzione di una singola cellula ottenuta durante lo sviluppo, l'invecchiamento e la malattia del SNC fornisce una migliore comprensione della funzione microgliale in cervelli sani e malati³. Studi precedenti hanno identificato un sottotipo microgliale associato alla malattia nell'AD e in altre malattie neurodegenerative ^4,5,6. Questa sottopopolazione è prossimale alla deposizione di amiloide β (Aβ). I geni associati alla fagocitosi e al metabolismo lipidico (ad esempio, Apoe, Tyrobp) sono risultati up-regolati in queste popolazioni ^6,7. Tuttavia, i processi subcellulari, le vie di segnalazione extracellulari e intracellulari che regolano i cambiamenti dinamici del profilo molecolare nelle microglia non sono completamente compresi. In particolare, il meccanismo alla base dell'attivazione microgliale cronica nelle malattie neurodegenerative rimane sfuggente. Pertanto, è fondamentale comprendere i meccanismi cellulari coinvolti nelle microglia poiché le risposte delle microglia contribuiscono chiaramente allo sviluppo del cervello e alla progressione della neurodegenerazione.

Sebbene esistano un paio di strumenti in vivo e in vitro per studiare le microglia, ci sono ancora alcune limitazioni. È tecnicamente difficile ottenere un numero sufficiente di cellule microgliali con elevata purezza per eseguire regolarmente esperimenti, come il western blot, per chiarire le vie di segnalazione intracellulare. La coltura primaria della microglia fornisce un mezzo alternativo per studiare la biologia della microglia. La microglia primaria in coltura può essere applicata per analizzare la capacità fagocitaria microgliale dopo la manipolazione genica e valutare la produzione di citochine pro- e anti-infiammatorie in risposta a stimoli infiammatori e altri aspetti biologici per comprendere i loro ruoli nel cervello⁸. Qui, presentiamo un nuovo protocollo e descriviamo un'istruzione passo-passo per l'isolamento e la coltura di microglia primaria da cervello di topo neonatale, con enfasi sui passaggi critici per ottenere cellule microgliali primarie sane e pure.

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Protocollo

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal comitato per la ricerca sugli animali e dal comitato di amministrazione istituzionale per la cura degli animali da laboratorio presso l'Università Jiao Tong di Shanghai. È stato fatto ogni sforzo per ridurre al minimo la sofferenza degli animali.

1. Preparazione del tampone di coltura, dei matracci e dei vetrini coprioggetti

1. Terreno di coltura e terreno di coltura per microglia: Integrare DMEM con il 10% di FBS per produrre il terreno di coltura. Il terreno di coltura della microglia viene prodotto aggiungendo al DMEM il 10% di FBS e il 20% di terreno condizionato LADMAC. Aggiungere l'1% di penicillina/streptomicina a entrambi i terreni.
   1. Per preparare il terreno condizionato LADMAC al 20%, raccogliere il terreno di coltura dalle cellule LADMAC, centrifugare a 200 x g per 10 minuti, filtrare con un colino cellulare da 0,22 μm e quindi conservare le aliquote a -80 °C.
2. Tampone per la digestione: Preparare il tampone per la digestione aggiungendo 8 U/mL di papaina e 125 U/mL di DNasi al DMEM.
   NOTA: Per ottenere i migliori risultati, il tampone per la digestione deve essere preparato fresco. Calcolare la quantità desiderata in base al numero di cuccioli (1 ml di soluzione ogni 2 cuccioli).
3. Palloni di rivestimento: utilizzare fiasche T25 o T75 per la pre-placcatura delle cellule cerebrali isolate. Prima della dissezione cerebrale, rivestire i flaconi T25 con 2 mL (o 4 mL per un pallone T75) di 0,1 mg/mL di poli-D-lisina (PDL) e incubare a 37 °C per almeno 1 ora. Aspirare la soluzione PDL, lavare due volte con 1x PBS, quindi lasciare asciugare il pallone all'aria nella cappa di coltura cellulare.
   NOTA: Le dimensioni e il numero di fiasche utilizzate nell'esperimento dipendevano dal numero di cuccioli postnatali. Per far sì che le cellule raggiungano lo strato di cellule astrocitarie confluenti in breve tempo, preparare una fiaschetta T25 per 3-5 cervelli, o una fiaschetta T75 per 5 cervelli. I palloni rivestiti non utilizzati possono essere conservati a 4 °C per un massimo di un mese. Per risparmiare tempo, è possibile preparare 10 volte (1 mg/mL) di PDL prima dell'inizio dell'esperimento e conservarla a -20 °C come aliquote monouso. Diluire le aliquote in 1x PBS sterile subito prima dell'uso.
4. Preparare i vetrini: lavare i vetrini in vetro commerciale con 0,1 M HCl per 1 ora, sciacquare due volte con acqua in autoclave, quindi conservare in etanolo al 100%. Prima dell'uso, fiammare i vetrini coprioggetti utilizzando una pinza fine con una lampada a bruciatore per rimuovere l'etanolo residuo. I vetrini coprioggetti in vetro da 8 mm possono essere inseriti in una piastra a 48 pozzetti e i vetrini coprioggetti in vetro da 12 mm possono essere inseriti in una piastra a 24 pozzetti.
5. Preparare gli strumenti di dissezione: immergere le forbici fini, le pinze e i microcucchiai di acciaio inossidabile in etanolo al 75% per almeno 20 minuti. Quindi posizionare questi strumenti sotto la radiazione ultravioletta nella cappa di coltura tissutale per 30 minuti.

2. Dissezione del cervello del topo

NOTA: Per valutare l'efficacia del protocollo, qui abbiamo utilizzato topi knock-in CX3CR1^GFP per tracciare la microglia⁹. I topi CX3CR1^GFP/GFP e le femmine wild type C57BL/6J da 2 a 8 mesi sono stati incrociati per generare topi CX3CR1^+/GFP , entrambi originariamente ottenuti da fonti commerciali. I topi sono stati alloggiati in un ciclo luce-buio di 12-12 ore in un ambiente privo di agenti patogeni specifici (SPF) presso l'Università Jiao Tong di Shanghai. I cuccioli dal giorno 1 al giorno 4 postnatale possono essere utilizzati per questo protocollo.

1. Decapita tutti i cuccioli con le forbici chirurgiche. Per ridurre al minimo la contaminazione, sciacquare tutte le testine con etanolo al 75% e inserire rapidamente il 1x PBS ghiacciato. Nel frattempo, scaldare il tampone di digestione e il terreno di co-coltura a bagnomaria a 37 °C.
   NOTA: Decapitare e isolare il tessuto cerebrale da un cucciolo alla volta per preservare l'integrità strutturale. Per prevenire la contaminazione, tutti gli strumenti chirurgici devono essere posti in etanolo al 75% tra una decapitazione e l'altra.
2. Usa le forbici da dissezione fine per tagliare il cranio insieme al midollo allungato. Metti un microcucchiaio di acciaio inossidabile sotto il tessuto cerebrale dal sito di taglio per spremere il cervello dalla cavità della testa. Trasferirlo in una nuova piastra refrigerata a 6 pozzetti contenente 2 mL di PBS pre-freddo 1x per pozzetto.
3. Tagliare e scartare il cervelletto e i bulbi olfattivi. Trasferire delicatamente il tessuto cerebrale rimanente in una piastra fredda a 6 pozzetti contenente 2 ml di PBS pre-freddo.
   NOTA: Metti 4-5 tessuti cerebrali in un pozzetto.
4. Ripetere la stessa procedura per le testine rimanenti fino a quando tutto il tessuto non è stato raccolto.

3. Semina le cellule primarie miste

1. Aspirare 1,5 mL di 1x PBS nella piastra a 6 pozzetti e tritare completamente il tessuto cerebrale in piccoli pezzi (circa 1 mm²) con l'aiuto di forbici a molla.
   NOTA: Per ridurre la quantità di detriti fini, non tritare eccessivamente il fazzoletto.
2. Aggiungere la quantità desiderata di tampone di digestione al pozzetto (0,5 mL di tampone di digestione per cervello), quindi posizionare la piastra nell'incubatore umidificato al 5% di CO₂, 37 °C per 20 minuti. Agitare il piatto ogni 10 minuti.
   NOTA: Durante il tempo di incubazione, bagnare un colino cellulare da 70 μm con terreno di coltura (10% FBS in DMEM), quindi posizionare il filtro cellulare su una provetta di raccolta fresca da 50 ml.
3. Estrarre la piastra dall'incubatore e terminare la digestione della papaina aggiungendo 3 ml di terreno di coltura a ciascun pozzetto. Pipettare delicatamente le cellule su e giù 10 volte utilizzando una pipetta da 1 mL. Trasferire il composto in una provetta da 15 ml e lasciarlo riposare per 1 minuto. Nella parte inferiore si può vedere un pellet di cella torbida. Per rimuovere grossi grumi e detriti cellulari, far passare con cautela la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm e raccogliere il flusso nella provetta di raccolta da 50 mL.
4. Aggiungere 3 mL di terreno di coltura riscaldato (10% FBS in DMEM) al pellet di cellule non dissociate nella provetta da 15 mL. Triturare 10 volte come nei passaggi 3.3 per continuare la dissociazione. Lasciare riposare il tessuto per 1 minuto, quindi passare la sospensione cellulare attraverso il colino fino alla provetta di raccolta da 50 ml. Ripeti questo passaggio e getta i detriti cellulari rimanenti.
5. Trasferire la sospensione cellulare dalla provetta di raccolta da 50 mL a provette da 15 mL e centrifugare le cellule a 200 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
6. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 5 mL di terreno di coltura. Seminare le cellule primarie in un matraccio T25 o T75 a una densità cellulare di circa 5 x 10⁶ e coltivare nell'incubatore umidificato (5% CO₂, 37 °C). Questo è il giorno 0 di questo programma culturale.
   NOTA: Se le cellule vengono seminate in un matraccio T25, è sufficiente un volume finale di 5 mL di terreno per pallone. Aggiungere altri 5 ml di terreno di coltura a ciascun pallone quando viene seminato in un pallone T75.

4. Raccolta di microglia primarie

1. Valutare la confluenza delle cellule miste il giorno successivo (Giorno 1). Poiché le cellule miste sono state seminate a una densità piuttosto elevata, ci vogliono 3-4 giorni perché gli astrociti raggiungano la confluenza, consentendo di raccogliere la microglia 1-2 giorni dopo.
   NOTA: Prestare attenzione se le celle non sono attaccate al fondo del pallone il giorno successivo; Potrebbe essere dovuto alla contaminazione cellulare o alla morte cellulare causata da una digestione eccessiva o da una manipolazione brusca.
2. Il giorno 2, lavare i matracci con 3 ml di 1x PBS caldo due volte e cambiare il terreno aggiungendo 3-5 ml di terreno di coltura fresco a ciascun pallone T25 (7-10 ml per un pallone T75). Il terreno di coltura scartato contiene detriti cellulari e vari tipi di cellule, tra cui neuroni, oligodendrociti e microglia.
3. Il giorno 4, assicurati che gli astrociti attaccati al fondo del pallone siano al 100% di confluenza. Nel frattempo, una sottopopolazione di microglia è attaccata in modo lasco allo strato superficiale di cellule miste che può facilmente staccarsi dalla superficie e galleggiare nel terreno di coltura stringendosi la mano. Trasferire il terreno di coltura in una piastra fresca a 6 pozzetti e durante questo processo vengono raccolte le microglia primarie arricchite nel terreno. Quindi, fornire alle cellule sulla piastra originale a 6 pozzetti un terreno di coltura fresco per un'ulteriore raccolta delle cellule.
   NOTA: Battere i palloni sul tavolo o agitare i palloni su un agitatore da laboratorio a 180 giri/min per 30 minuti prima del trasferimento del terreno è appropriato per produrre più cellule.
4. Posizionare con cura il pozzetto a 6 pozzetti sull'incubatrice per consentire l'attacco delle celle. Circa 2 ore dopo l'incubazione, tutte le cellule saranno attaccate alla piastra. Quando le cellule sono attaccate, lavarle delicatamente con 1x PBS caldo due volte per rimuovere gli aggregati cellulari e i detriti cellulari; quindi, fornire alle cellule 3 ml di terreno di coltura per microglia fresco. Le cellule della microglia isolate possono essere mantenute per più di un mese in vitro rinfrescando il terreno di coltura della microglia ogni 2 giorni.
   NOTA: Il fattore 1 stimolante le colonie (CSF1) è un importante fattore di crescita per sostenere la sopravvivenza della microglia in vitro. Studi precedenti riportano che il CSF1 può essere secreto dalla linea cellulare LADMAC, che è una linea cellulare trasformata originata da cellule di midollo osseo di topo. Il terreno condizionato LADMAC può essere raccolto centrifugando la coltura LADMAC a 200 x g per 10 minuti; Quindi, passare il surnatante attraverso un colino cellulare da 0,22 μm. Il terreno di coltura per microglia è stato preparato aggiungendo al terreno di coltura il 20% di terreno condizionato con LADMAC (10% FBS, DMEM).
5. Ogni 2-3 giorni, continuare a raccogliere la microglia dal terreno di coltura cellulare misto come al punto 4.4. Coltiva le restanti cellule miste nel pallone e usale per raccogliere costantemente le microglia ogni 2-3 giorni per un massimo di 1 mese.
   NOTA: Le microglia possono essere raccolte con successo raccogliendo il terreno di coltura mista per un massimo di 50 giorni. Ogni volta, il terreno di co-coltura raccolto produrrà circa ~1-3 x 10⁵ cellule microgliali per matraccio T75. Combinare le cellule microgliali, se necessario.
6. Utilizzare le cellule microgliali primarie per il test funzionale desiderato.

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Risultati

Nella Figura 1 sono state dimostrate le microglia primarie raccolte da CX3CR1^+/GFP al giorno 7 e al giorno 35 dopo la semina cellulare. Come mostrato nella colorazione in immunofluorescenza del marcatore di cellule microglia/macrofagi IBA1, tutte le cellule IBA1 positive sono positive per i segnali GFP e negative per S100β (marcatore degli astrociti) e CC1 (marcatore degli oligodendrociti), suggerendo che le cellule GFP positive purificate sono e...

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Discussione

Questo protocollo si basa sui metodi descritti in precedenza con alcune modifiche¹¹. Di seguito sono elencati i suggerimenti per migliorare la vitalità e la purezza della microglia isolata. Innanzitutto, fare attenzione a evitare la contaminazione quando si preparano i tamponi utilizzati per l'isolamento dei tessuti e la coltura cellulare. Assicurati che gli strumenti chirurgici, i contenitori e le attrezzature in plastica siano sterili. Di solito, eseguiamo la d...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell strainers, 40 µm	ThermoFisher Scientific	22-363-547
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco by Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco by Life Technologies	10099141
Papain, Suspension	Sangon Biotech	Papain, Suspension
Penicillin-Streptomycin 100X solution	Hyclone	SV30010
Poly-D-Lysine	ThermoFisher Scientific	A3890401