산후 마우스 뇌에서 1차 미세아교세포 분리

요약

일차 세포 배양은 in vitro에서 미세아교세포생물학을 연구하는 데 주로 사용되는 접근법 중 하나입니다. 여기서, 우리는 생쥐의 출생 후 1일차(P1)에서 P4까지 간단하고 신속한 미세아교세포를 분리하는 방법을 개발했습니다.

초록

미세아교세포(Microglia)는 중추신경계(CNS)의 단핵 식세포(mononuclear phagocyte)로, 항상성을 유지하고 중추신경계의 염증 과정을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. in vitro에서 미세아교세포생물학을 연구하기 위해 1차 미세아교세포는 불멸화된 미세아교세포주에 비해 큰 이점을 보여줍니다. 그러나 출생 후 쥐의 뇌에서 미세아교세포를 분리하는 것은 상대적으로 효율성이 떨어지고 시간이 많이 걸립니다. 이 프로토콜에서는 신생아 마우스 뇌에서 원발성 미세아교세포를 분리하는 빠르고 쉽게 따라할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 프로토콜의 전체 단계에는 뇌 박리, 1차 뇌 세포 배양 및 미세아교세포 분리가 포함됩니다. 이 접근 방식을 사용하여 연구원은 고순도의 1차 미세아교세포를 얻을 수 있습니다. 또한, 수확된 1차 미세아교세포는 리포다당류 챌린지에 반응할 수 있었으며, 이는 면역 기능을 유지했음을 나타냅니다. 총체적으로, 우리는 고순도로 원발성 미세아교세포를 효율적으로 분리하기 위한 단순화된 접근 방식을 개발했으며, 이는 광범위한 체외 미세아교세포 생물학 조사를 용이하게 합니다.

서문

중추신경계(CNS)에 상주하는 면역세포인 미세아교세포(Microglia)는 신경병리학적 도전에 반응하는 항상성을 유지하는 데 중추적인 역할을 합니다¹. 최근에는 알츠하이머병과 같은 미세아교세포의 생리학적 기능을 파악하기 위한 집중적인 조사가 수행되었습니다². 현재 CNS 발달, 노화 및 질병 중에 얻은 단세포 해상도에서 미세아교세포의 전사 프로파일은 건강한 뇌와 병든 뇌의 미세아교세포 기능에 대한 더 나은 이해를 제공합니다³. 이전 연구에서는 알츠하이머병 및 기타 신경퇴행성 질환에서 질병 관련 미세아교세포 아형이 확인되었습니다 ^4,5,6. 이 하위 집단은 아밀로이드 β(Aβ) 침착에 근접합니다. 식세포작용(phagocytosis) 및 지질대사(lipid metabolism)와 관련된 유전자(예: Apoe, Tyrobp)는 이러한 집단에서 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다 ^6,7. 그러나 미세아교세포의 동적 분자 프로필 변화를 조절하는 세포 내 과정, 세포 외 및 세포 내 신호 경로는 완전히 이해되지 않았습니다. 특히, 신경퇴행성 질환에서 만성 미세아교세포 활성화의 기전은 여전히 파악하기 어렵습니다. 그러므로, 미세아교세포 반응이 뇌 발달과 신경 퇴행의 진행에 명백히 기여하기 때문에 미세아교세포와 관련된 세포 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다.

미세아교세포를 연구하기 위한 몇 가지 생체 내 및 체외 도구가 있지만 여전히 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 세포 내 신호 전달 경로를 규명하기 위해 웨스턴 블롯(western blot)과 같은 실험을 일상적으로 수행하기 위해 충분히 많은 수의 고순도 미세아교세포를 얻는 것은 기술적으로 어렵습니다. 1차 미세아교세포 배양은 미세아교세포의 생물학을 연구하기 위한 대안적인 수단을 제공합니다. 배양된 1차 미세아교세포는 유전자 조작 후 미세아교세포의 식세포 능력을 분석하고, 염증 자극에 대한 반응으로 전염증성 및 항염증성 사이토카인 생산을 평가하고, 기타 생물학적 측면을 평가하여 뇌에서 사이토카인의 역할을 이해하는 데 적용할 수 있다⁸. 여기에서는 새로운 프로토콜을 제시하고 건강하고 순수한 1차 미세아교세포를 얻는 데 중요한 단계를 강조하면서 신생아 마우스 뇌에서 원발성 미세아교세포의 분리 및 배양에 대한 단계별 지침을 설명합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

모든 동물 절차는 상하이 자오퉁 대학교(Shanghai Jiao Tong University)의 동물 연구 위원회(Committee on Animal Research)와 실험실 동물 관리 기관 관리 패널(Institutional Administration Administration Panel of Laboratory Animal Care)의 승인을 받았습니다. 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.

1. 배양 완충액, 플라스크 및 커버슬립의 제조

1. 배양 배지 및 미세아교세포 배양 배지: DMEM에 10% FBS를 보충하여 배양 배지를 만듭니다. 미세아교세포 배양 배지는 DMEM에 10% FBS 및 20% LADMAC 컨디셔닝 배지를 첨가하여 제조됩니다. 페니실린/스트렙토마이신 1%를 두 배지에 모두 첨가합니다.
   1. 20% LADMAC 컨디셔닝 배지를 준비하려면 LADMAC 세포에서 배양 배지를 채취하고 200 x g 에서 10분 동안 원심분리한 다음 0.22μm 세포 스트레이너를 사용하여 여과한 다음 -80°C에서 부분 표본을 보관합니다.
2. 분해 완충액: DMEM에 8 U/mL 파파인 및 125 U/mL DNase를 첨가하여 분해 완충액을 준비합니다.
   알림: 최상의 결과를 얻으려면 소화 버퍼를 새로 준비해야 합니다. 새끼 수에 따라 원하는 양을 계산합니다(새끼 2마리당 1mL 용액).
3. 코팅 플라스크: T25 또는 T75 플라스크를 사용하여 분리된 뇌 세포를 사전 도금합니다. 뇌 해부 전에 T25 플라스크에 0.1mg/mL Poly-D-lysine(PDL) 2mL(또는 T75 플라스크의 경우 4mL)를 코팅하고 37°C에서 최소 1시간 동안 배양합니다. PDL 용액을 흡입하고 1x PBS로 두 번 세척한 다음 플라스크가 세포 배양 후드에서 자연 건조되도록 합니다.
   참고: 실험에 사용된 플라스크의 크기와 수는 출생 후 새끼의 수에 따라 달랐습니다. 세포가 짧은 시간에 합류 성상세포 세포층에 도달하도록 하려면 3-5개의 뇌를 위한 T25 플라스크 1개 또는 5개의 뇌를 위한 T75 플라스크 하나를 준비합니다. 사용하지 않은 코팅 플라스크는 최대 한 달 동안 4 °C에서 보관할 수 있습니다. 시간을 절약하기 위해 실험 시작 전에 PDL의 10x(1mg/mL) 원액을 준비하고 -20°C에서 일회용 분취액으로 보관할 수 있습니다. 사용 직전에 분취액을 멸균 1x PBS로 희석하십시오.
4. 커버슬립 준비: 상업용 유리 커버슬립을 0.1M HCl로 1시간 동안 세척하고 오토클레이브 물로 두 번 헹군 다음 100% 에탄올에 보관하십시오. 사용하기 전에 버너 l과 함께 미세한 집게를 사용하여 커버슬립을 불태우십시오.amp 잔류 에탄올을 제거합니다. 8mm 유리 커버슬립은 48웰 플레이트에 배치할 수 있으며, 12mm 유리 커버슬립은 24웰 플레이트에 배치할 수 있습니다.
5. 해부 도구 준비: 가는 가위, 집게 및 스테인리스 스틸 마이크로 스푼을 75% 에탄올에 최소 20분 동안 담그십시오. 그런 다음 이러한 도구를 조직 배양 후드의 자외선 아래에 30분 동안 놓습니다.

2. 쥐의 뇌 해부

참고: 프로토콜의 효능을 평가하기 위해 여기에서는 미세아교세포⁹를 추적하기 위해 CX3CR1^GFP 넉인 마우스를 사용했습니다. CX3CR1^GFP/GFP 마우스와 야생형 C57BL/6J 암컷을 2개월에서 8개월 사이에 교배하여 CX3CR1^+/GFP 마우스를 생성했으며, 둘 다 원래 상업용 소스에서 얻었습니다. 생쥐는 상하이 자오퉁 대학교(Shanghai Jiao Tong University)의 특정 병원체가 없는(SPF) 환경에서 12-12시간의 명암 주기로 사육되었습니다. 출생 후 1일차부터 4일차까지의 새끼를 이 프로토콜에 사용할 수 있습니다.

1. 수술용 가위로 모든 강아지의 목을 베십시오. 오염을 최소화하려면 모든 헤드를 75% 에탄올로 헹구고 얼음처럼 차가운 1x PBS에 빠르게 넣습니다. 한편, 소화 완충액과 공동 배양 배지를 37°C 수조에서 따뜻하게 합니다.
   참고: 구조적 무결성을 보존하기 위해 한 번에 한 마리의 강아지에서 뇌 조직을 참수하고 분리하십시오. 오염을 방지하기 위해 모든 수술 도구는 참수 사이에 75% 에탄올에 넣어야 합니다.
2. 미세한 해부 가위를 사용하여 수질과 함께 두개골을 자릅니다. 절단 부위의 뇌 조직 아래에 스테인리스 스틸 마이크로 스푼을 놓고 두강에서 뇌를 짜냅니다. 웰당 2mL의 사전 냉각 1x PBS가 들어 있는 새 냉각 6웰 플레이트로 옮깁니다.
3. 소뇌와 후각구를 잘라서 버립니다. 남은 뇌 조직을 사전 냉간 1x PBS 2mL가 들어 있는 냉각된 6웰 플레이트에 부드럽게 옮깁니다.
   참고: 한 웰에 4-5개의 뇌 조직을 넣습니다.
4. 모든 조직이 수집될 때까지 나머지 머리에 대해 동일한 절차를 반복합니다.

3. 혼합 1 차 세포를 씨를 뿌리십시오

1. 1.5웰 플레이트에서 1x PBS 6mL를 흡인하고 스프링 가위를 사용하여 뇌 조직을 작은 조각(약 1mm²)으로 완전히 다집니다.
   알림: 미세한 파편의 양을 줄이려면 조직을 과도하게 다지지 마십시오.
2. 원하는 양의 소화 완충액을 웰에 추가한 다음(뇌당 0.5mL의 소화 완충액), 플레이트를 5% CO₂, 37°C 가습 인큐베이터에 20분 동안 놓습니다. 10분마다 접시를 휘젓습니다.
   참고: 배양 시간 동안 70μm 세포 스트레이너를 배양 배지(DMEM의 경우 10% FBS)로 적신 다음 세포 여과기를 새 50mL 수집 튜브에 놓습니다.
3. 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내고 각 웰에 배양 배지 3mL를 추가하여 파파인 분해를 종료합니다. 1mL 피펫을 사용하여 세포를 위아래로 10회 가볍게 피펫팅합니다. 혼합물을 15mL 튜브에 옮기고 1분 동안 그대로 둡니다. 흐린 세포 알갱이가 아래쪽에서 볼 수 있습니다. 큰 덩어리와 세포 파편을 제거하려면 70μm 세포 여과기에 세포 현탁액을 조심스럽게 통과시키고 50mL 수집 튜브에 관류를 수집합니다.
4. 15mL 튜브의 해리되지 않은 세포 펠릿에 3mL의 가온 배양 배지(DMEM의 10% FBS)를 추가합니다. 3.3단계에서와 같이 10번 삼연산하여 해리를 계속합니다. 조직을 1분 동안 가라앉힌 다음 세포 현탁액을 스트레이너를 통해 50mL 수집 튜브에 통과시킵니다. 이 단계를 반복하고 남아 있는 세포 파편을 버립니다.
5. 50mL 수집 튜브에서 15mL 튜브로 세포 현탁액을 옮기고 실온에서 10분 동안 200 x g 에서 세포를 원심분리합니다.
6. 상등액을 흡인하고 5mL의 배양 배지에 세포를 재현탁합니다. 약 5 x 10⁶ 의 세포 밀도로 T25 또는 T75 플라스크에 일차 세포를 파종하고 가습 인큐베이터(5% CO₂, 37 °C)에서 배양합니다. 이 문화 일정에서 0일차입니다.
   참고: 세포가 T25 플라스크에 파종된 경우 플라스크당 5mL 배지의 최종 부피로 충분합니다. T75 플라스크에 파종할 때 각 플라스크에 5mL의 배양 배지를 추가로 추가합니다.

4. 원발성 미세아교세포의 수집

1. 다음 날(1일차)에 혼합 세포의 농도를 평가합니다. 혼합된 세포는 상당히 높은 밀도로 파종되었기 때문에 성상세포가 합류점에 도달하는 데 3-4일이 소요되어 1-2일 후에 미세아교세포를 수집할 수 있습니다.
   참고: 다음 날 플라스크 바닥에 세포가 부착되지 않은 경우 주의하십시오. 과도한 소화 또는 가혹한 취급으로 인한 세포 오염 또는 세포 사멸 때문일 수 있습니다.
2. 2일차에 따뜻한 1x PBS 3mL로 플라스크를 두 번 세척하고 각 T25 플라스크(T75 플라스크의 경우 7-10mL)에 3-5mL의 신선한 배양 배지를 추가하여 배지를 변경합니다. 버려진 배양 배지에는 세포 파편과 뉴런, 희소돌기아교세포, 미세아교세포를 포함한 다양한 유형의 세포가 포함되어 있습니다.
3. 4일차에는 플라스크 바닥에 부착된 성상세포가 100% 포화 상태에 있는지 확인합니다. 한편, 미세아교세포의 하위 집단은 혼합 세포 표면층에 느슨하게 부착되어 있으며, 이는 표면에서 쉽게 분리되어 핸드셰이킹에 의해 배양 배지에 떠다닐 수 있습니다. 배양 배지를 새로운 6-well plate로 옮기고, 이 과정에서 배지에 농축된 1차 미세아교세포를 수집합니다. 다음으로, 추가 세포 수집을 위해 원래의 6-well 플레이트에 새로운 배양 배지를 제공합니다.
   참고: 매체 전달 전에 180rpm에서 30분 동안 테이블 위의 플라스크를 두드리거나 실험실용 셰이커에서 플라스크를 흔드는 것이 더 많은 세포를 생성하는 데 적합합니다.
4. 세포가 부착될 수 있도록 6-well을 인큐베이터에 조심스럽게 놓습니다. 배양 후 약 2시간 후에 모든 세포가 플레이트에 부착됩니다. 세포가 부착되면 따뜻한 1x PBS로 두 번 부드럽게 세척하여 세포 응집체와 세포 파편을 제거합니다. 그런 다음 세포에 3mL의 신선한 미세아교세포 배양 배지를 공급합니다. 분리된 미세아교세포는 미세아교세포배양액을 2일마다 refresh하여 시험관내(in vitro)에서 한 달 이상 유지될 수 있습니다.
   참고: 집락 자극 인자 1(CSF1)은 체외 미세아교세포의 생존을 지원하는 중요한 성장 인자입니다. 이전 연구에서는 쥐 골수 세포에서 유래한 형질전환된 세포주인 LADMAC 세포주에서 CSF1이 분비될 수 있다고 보고했습니다. LADMAC 컨디셔닝 배지는 200 x g 에서 10분 동안 LADMAC 배양을 원심분리하여 수집할 수 있습니다. 그런 다음 상층액을 0.22μm 세포 스트레이너에 통과시킵니다. Microglia 배양 배지는 배양 배지에 20% LADMAC 조건의 배지(10% FBS, DMEM)를 첨가하여 제조하였다.
5. 2-3일마다 4.4단계와 같이 혼합 세포 배양 배지에서 미세아교세포를 계속 수집합니다. 플라스크에 남아 있는 혼합 세포를 배양하고 최대 1개월 동안 2-3일마다 미세아교세포를 지속적으로 수확하는 데 사용합니다.
   참고: Microglia는 최대 50일 동안 혼합 배양 세포의 배지를 수집하여 성공적으로 수확할 수 있습니다. 매번, 수집된 공동 배양 배지는 T75 플라스크당 약 ~1-3 x 10⁵ microglia 세포를 생성합니다. 필요한 경우 미세아교세포를 결합합니다.
6. 원하는 기능 분석을 위해 1차 미세아교세포를 사용합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

세포 파종 후 7일과 35일에 CX3CR1^+/GFP 에서 채취한 1차 미세아교세포는 그림 1에서 입증되었습니다. 미세아교세포/대식세포 마커 IBA1의 면역형광 염색에서 알 수 있듯이, 모든 IBA1 양성 세포는 GFP 신호에 대해 양성이고 S100β(성상세포 마커) 및 CC1(희소돌기아교세포 마커)에 대해 음성이며, 이는 정제된 GFP 양성 세포가 실제로 미세아교세포임을 ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

이 프로토콜은 일부 변형예⁽¹¹)와 함께 앞서 설명한 방법들을 기반으로 한다. 분리된 미세아교세포의 생존력과 순도를 개선하기 위한 팁은 다음과 같습니다. 먼저, 조직 분리 및 세포 배양에 사용되는 완충액을 준비할 때 오염을 방지하도록 주의하십시오. 수술 도구, 용기 및 플라스틱 장비가 멸균 상태인지 확인하십시오. 일반적으로 교차 오염을 피하기...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell strainers, 40 µm	ThermoFisher Scientific	22-363-547
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco by Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco by Life Technologies	10099141
Papain, Suspension	Sangon Biotech	Papain, Suspension
Penicillin-Streptomycin 100X solution	Hyclone	SV30010
Poly-D-Lysine	ThermoFisher Scientific	A3890401