Test humanisé de libération du médiateur comme lecture de la puissance des allergènes

Résumé

Nous présentons ici le test de libération du médiateur, utilisant une lignée cellulaire de leucémie basophile de rat transfectée avec le récepteur IgE humain, pour simuler la dégranulation des cellules effectrices généralement observées dans les réactions allergiques de type 1. Cette méthode étudie l’activité biologique des allergènes d’une manière très sensible, reproductible et personnalisable.

Résumé

Les tests de libération de médiateurs analysent la dégranulation médiée par l’immunoglobuline E (IgE) in vitro et la sécrétion de médiateurs par les cellules effectrices, telles que les mastocytes et les basophiles, lors de la stimulation avec des dilutions en série d’allergènes putatifs. Par conséquent, ces tests représentent un outil essentiel qui imite le processus de dégranulation in vivo, qui se produit lors de l’exposition aux allergènes chez les patients sensibilisés ou dans les tests cutanés. De plus, ces tests sont généralement utilisés pour étudier le potentiel allergène des protéines et la réactivité des sérums des patients. Ici, nous décrivons un protocole simple de 2 jours utilisant une lignée cellulaire de leucémie basophile de rat immortalisée transfectée et humanisée avec le récepteur de membrane plasmique IgE à haute affinité humaine (FcεRI). Cette variante du test de libération du médiateur est un système cellulaire in vitro robuste, sensible et reproductible sans qu’il soit nécessaire d’immobiliser l’antigène en matrices solides. Le protocole comprend les étapes suivantes: (1) l’inactivation du complément du sérum humain, (2) la récolte, l’ensemencement et la sensibilisation passive des cellules, (3) la stimulation par l’antigène pour provoquer la libération du médiateur, et (4) la mesure de l’activité de la β-hexosaminidase comme substitut des médiateurs inflammatoires libérés, tels que l’histamine. Le test représente un outil utile pour évaluer la capacité de la réticulation allergène-IgE à déclencher la dégranulation cellulaire et peut être mis en œuvre pour normaliser les extraits d’allergènes, pour comparer la réactivité des patients aux allergènes mineurs ou majeurs et aux extraits allergènes (pollen, squames de chat, etc.), pour étudier la puissance des homologues d’allergènes, des isoformes et des variantes de plis (par exemple, l’hypoallergénicité), ainsi que les effets des ligands sur l’activité allergène. Une application plus récente comprend l’utilisation du test pour surveiller l’efficacité du traitement au cours de l’immunothérapie allergénique.

Introduction

Les réactions d’hypersensibilité de type I, caractérisées par la production d’immunoglobuline E (IgE) spécifique d’un antigène respectif, affectent près d’un tiers de la population mondiale. Ces réactions sont associées à plusieurs manifestations allergiques telles que l’asthme et la rhinoconjonctivite et peuvent même entraîner des réactions systémiques potentiellement mortelles¹. Contrairement aux tests in vivo, les approches immunochimiques, telles que le test immuno-enzymatique (ELISA), conviennent uniquement à l’étude de la liaison cible des anticorps, mais ne traitent pas de l’aspect fonctionnel des protéines pouvant provoquer des réactions immédiates d’hypersensibilité. L’immobilisation des allergènes sur des supports solides (p. ex. plaques ELISA) pourrait entraîner des changements dans leur intégrité structurale et la destruction des épitopes pertinents pour l’allergie^2. Même les tests cutanés (SPT), l’outil le plus courant pour confirmer la sensibilisation contre certains allergènes, ont leurs limites concernant la détection d’une allergie alimentaire symptomatique médiée par les IgE ou la disponibilité des allergènes^3,4. Afin de trouver une méthode éthique, très spécifique, sensible et rentable pour tester la puissance biologique des allergènes à provoquer une réaction d’hypersensibilité de type I, les tests dits de libération de médiateur ont été établis.

Le principe de ces essais repose sur les événements qui suivent la phase de sensibilisation et la capacité des IgE qui l’accompagne à se lier à la chaîne α des récepteurs de haute affinité exprimés à la surface des cellules effectrices, tels que les mastocytes et les basophiles. Les IgE sont principalement produites par les plasmocytes dans le tissu lymphoïde associé aux muqueuses. Bien qu’il s’agisse de l’immunoglobuline la moins abondante (environ 0,05% chez les personnes non atopiques) dans le sang, elle possède une activité biologique extraordinairement élevée étant la principale cause des symptômes allergiques. La demi-vie des IgE peut augmenter de 2-3 jours à plusieurs semaines et même des mois lorsqu’elle est liée à ses récepteurs sur les cellules effectrices. La liaison ultérieure d’un antigène à la région variable de deux molécules IgE liées aux récepteurs conduit à leur réticulation suivie de l’induction d’une cascade de signalisation en aval dans la cellule effectrice conduisant à la dégranulation et à la libération de plusieurs médiateurs pro-inflammatoires provoquant une vasodilatation, tels que l’histamine, les protéases de sérine (par exemple, la tryptase) et les prostaglandines^5,6,7. La sécrétion de cytokines telles que l’interleukine 4 (IL-4) et l’IL-13 est responsable du maintien de la réponse inflammatoire T helper 2 (Th2) et du changement de classe des lymphocytes B en plasmocytes producteurs d’IgE^5,8,9. D’autre part, le thromboxane libéré provoque une bronchoconstriction, et les leucotriènes stimulent la contraction des muscles lisses ainsi que les fuites vasculaires, et jouent un rôle crucial dans l’inflammation des voies respiratoires conduisant à l’asthme ou à la rhinite allergique^10,11.

Des outils de recherche pour analyser la plupart des médiateurs susmentionnés ont été mis en place, bien qu’avec quelques inconvénients majeurs. Les tests de tryptase sont des approches cliniques appropriées pour la mesure de l’anaphylaxie systémique par activation des mastocytes, mais leur sensibilité et leur spécificité dans les diagnostics d’allergie sont trop imprécises par rapport aux méthodes de référence telles que le SPT. D’autre part, les tests de kystéinyl leucotriène ne sont pas capables de diagnostiquer les allergies aux β-lactamines ou aux anti-inflammatoires non stéroïdiens¹². Des protocoles pour la mesure de l’histamine en tant que médiateur majeur libéré dans les réactions allergiques ont déjà été établis dans les années 1960. Une fois libérée dans le sang périphérique, l’histamine est immédiatement dégradée par les histamine méthyltransférases, ce qui entraîne une demi-vie plasmatique de seulement quelques minutes, ce qui rend son analyse assez difficile¹³. Outre son instabilité, il a été démontré que la surveillance de l’histamine avait une faible spécificité et sensibilité pour les allergies médicamenteuses ainsi que pour les protéines alimentaires commerciales et les venins de guêpes¹².

Des modèles in vitro avec des lignées cellulaires effectrices ont été introduits comme alternative aux procédures laborieuses d’isolement et de culture de basophiles de patients allergiques pour effectuer des tests de libération. Par conséquent, le test basé sur la leucémie basophile chez le rat (RBL-) utilisant la lignée cellulaire RBL-2H3 a été établi³. Étant donné que cette lignée cellulaire n’est pas capable de lier les IgE humaines, elle a d’abord été transfectée avec la chaîne α, β et γ du récepteur de la membrane plasmique IgE humaine (FcεRI). Plusieurs clones ont été générés et testés pour les niveaux d’expression et l’homogénéité de la chaîne α humaine, dont le clone RBL-30/25 est apparu comme le candidat le plus prometteur pour les tests in vitro. La cascade de signalisation induite lors de l’activation du récepteur du clone transfecté a été testée par des tests de mobilisation du calcium. En tant qu’indicateur de dégranulation et substitut de la libération d’histamine, l’enzyme lysosomale β-hexosaminidase a été mesurée, ce qui présente l’avantage significatif d’une plus grande stabilité¹⁴. La libération du médiateur à l’aide de cellules RBL-30/25 atteint jusqu’à 100% et est donc utilisée pour tester les sérums dérivés de patients allergiques. Le test a été testé pour la libération du médiateur après avoir mis au défi les cellules sensibilisées avec des extraits d’allergènes commerciaux. Cela a conduit à la découverte qu’il existe une énorme variation dans la composition (jusqu’à 60 fois par rapport à la teneur totale en protéines) des extraits d’allergènes dérivés de différents fabricants et utilisés pour le diagnostic (par exemple, SPT) ou les approches thérapeutiques^3,15,16.

Ici, nous fournissons une description détaillée du protocole RBL pour effectuer le test de libération du médiateur en utilisant le sérum de donneurs allergiques. Lors de la sensibilisation passive, les IgE dans le sérum sont capturées par le récepteur FcεR1 de haute affinité exprimé à la surface des cellules basophiles. Lors de la stimulation de l’antigène, les IgE liées spécifiques à l’antigène sont réticulées, déclenchant la dégranulation cellulaire et la libération du médiateur β-hexosaminidase. L’activité de la β-hexosaminidase est ensuite mesurée à l’aide d’un substrat approprié. Pour le test, des cellules huRBL-2H3 ont été utilisées et appelées huRBL dans le protocole suivant. Le protocole décrit une série standard de dilution d’antigène avec 8 étapes diluées 1:10 allant de 1 μg/mL à 0,1 pg/mL d’allergène.

Protocole

L’approbation éthique pour l’utilisation de sérums dérivés de patients allergiques au pollen de bouleau a été obtenue auprès du comité d’éthique néerlandais (numéro d’approbation: NL65758.018.18).

1. Procédures de sécurité

1. Travailler dans des conditions stériles à l’aide d’un établi de classe de sécurité biologique 2 pendant le premier jour de l’expérience (niveau de biosécurité 2). Suivez les directives de sécurité de l’établissement pour l’utilisation du sérum humain.

2. Inactivation du complément de sérums humains

1. Récoltez une culture dense de cellules P3X63Ag8.653 (appelées cellules Ag8 ci-après), dans la fiole de culture cellulaire et transférez-les dans un tube de centrifugation.
   1. Utilisez le milieu de culture suivant pour ces cellules : Milieu essentiel minimal d’Eagles modifié avec concentration sérique réduite, 1 % de pénicilline-streptomycine (100 unités de pen., 0,1 mg/mL de streptocoque), 5 % de sérum fœtal/bovin inactivé par la chaleur (FCSi).
2. Centrifuger les cellules Ag8 pendant 5 min à 250 x g à température ambiante.
3. Reblouir la pastille cellulaire à une concentration finale d’environ 1 x^{10 6} cellules/mL dans le milieu huRBL (Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, 4 mM L-Glutamine, 5% FCSi, 1% G418 (100% stock: 10 g/125 mL dH₂O).
   REMARQUE: Maintenir les cellules Ag8 en les transmettant pour une utilisation future.
4. Diluer le sérum humain 1:10 dans une suspension de cellules Ag8. La dilution sérique finale dans le test sera de 1:20.
   REMARQUE: Pour les sérums à faible IgE spécifiques, une dilution finale de 1:5 (1:10) peut être utilisée.
5. Incuber pendant 1 h à 37 °C et 5%-7% de CO₂.

3. Récolte et ensemencement des cellules huRBL

1. Aspirer soigneusement le milieu d’une fiole de culture cellulaire T-75 sans toucher les cellules huRBL (les cellules huRBL adhèrent). Assurez-vous que les cellules sont confluentes à environ 50% à 90%.
   REMARQUE: Selon la confluence cellulaire, le contenu cellulaire d’une fiole de culture cellulaire T-75 dense est généralement suffisant pour une à deux plaques de 96 puits.
2. Lavez les cellules deux fois en ajoutant 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco. Ajouter le DPBS du côté opposé de la fiole et non directement sur les cellules.
3. Aspirer le DPBS et ajouter 5 mL de trypsine-EDTA préchauffée (0,05 %/0,02 % d’EDTA dilué dans du DPBS) pour le détachement cellulaire.
4. Incuber la fiole pendant 5 min à 37 °C.
5. Détachez les cellules en tapotant soigneusement la fiole.
6. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation de 15 mL et remplir de milieu huRBL ou DPBS pour diluer la trypsine-EDTA.
7. Centrifuger les cellules à 250 x g pendant 5 min à température ambiante.
8. Aspirer le surnageant et ressusser la pastille dans 5 mL de milieu huRBL pour le comptage cellulaire.
9. Compter les cellules et les diluer dans un milieu huRBL pour obtenir une concentration finale de 2 x 10⁶ cellules/mL.
10. Utilisez une plaque stérile de 96 puits et ajoutez 50 μL de suspension de cellules huRBL par puits, ce qui équivaut à 1 x 10⁵ cellules/puits.

4. Sensibilisation passive des cellules huRBL

1. Centrifuger la suspension Pré-incubée Ag8/sérum pendant 5 min à 250 x g.
2. Transférer 50 μL de la suspension Ag8/sérum centrifugée dans chaque puits contenant des cellules huRBL sans perturber la pastille de cellule Ag8.
   1. Inclure les cellules sans antigène, qui sont sensibilisées, mais nontimulées (n’ajoutent pas d’antigène), servant d’indication pour le plateau / arrière-plan du signal inférieur. Les puits de contrôle de fond et de lyse maximale n’ont pas besoin d’être sensibilisés avec du sérum. Ajouter 50 μL de milieu huRBL pour contrôler les puits à la place.
3. Couvrir la plaque avec le couvercle et incuber toute la nuit à 37 °C et 5%-7% CO₂.

5. Dégranulation stimulée par l’antigène et libération du médiateur

1. Préparer la dilution de l’antigène dans 1x tampon de Tyrode (9,5 g/L de sels de Tyrode, 0,1% d’albumine sérique bovine (BSA), 0,5 g/L d’hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO₃₎dans dH₂O) à l’avance. Une quantité finale de 100 μL par puits est nécessaire.
   REMARQUE: Tous les allergènes, purifiés à partir de sources naturelles ou produits de manière recombinante, ne peuvent pas être stables dans le tampon de 1x Tyrode. Par conséquent, effectuez des tests de stabilité dans le tampon de 1x Tyrode avant la procédure d’essai. Alternativement, diluez 1x le tampon de Tyrode dans de l’oxyde de deutérium (D₂O) pour augmenter le rapport signal/bruit du test.
2. Effectuer 8 dilutions de l’antigène d’intérêt d’une série de dilution 1:10 dans des tubes de réaction commençant par 10 ou 1 μg/mL de protéine.
   REMARQUE: Testez toujours la série de dilution au préalable. Vous pouvez également adapter la série de dilution 1:10 (par exemple, 1:5, 1:20 ou 1:30) afin de couvrir la courbe de libération complète. De plus, la concentration de départ peut varier en fonction de la configuration expérimentale.
3. Pour laver les cellules huRBL plaquées sur la plaque de 96 puits, retirez d’abord le milieu cellulaire contenant des sérums en aspirant, en inversant et en tapotant soigneusement la plaque sur du papier absorbant.
4. Lavez les cellules avec 200 μL de 1x tampon de Tyrodes par puits. Traitez tous les puits de la même manière.
   REMARQUE: Ajoutez lentement la solution de lavage aux cellules afin de ne pas les déranger.
5. Laissez-le pendant environ 30 s et répétez l’étape de lavage trois fois au total.
6. Après avoir ajouté la solution de lavage pour la dernière fois, laissez la solution dans les puits jusqu’à ce qu’elle soit prête à continuer à ajouter la dilution de l’antigène.
   REMARQUE: Évitez d’exposer les cellules à l’air trop longtemps.
7. Transférer 100 μL de solution d’antigène dans chaque puits contenant les cellules huRBL pré-sensibilisées.
   REMARQUE: Si vous analysez plusieurs paramètres différents, transférez les échantillons individuels de la série de dilution dans une plaque supplémentaire non contraignante de 96 puits (utilisez la même disposition que sur la plaque huRBL) et transférez-les ensuite avec une pipette multicanal directement sur la plaque cellulaire huRBL. De cette façon, l’exposition des cellules à l’air pendant trop longtemps peut être évitée, ce qui pourrait entraîner de mauvaises performances de test (signal inférieur / nul).
8. Couvrir les puits de contrôle (lyse maximale et cellules de fond non sensibilisées) avec 100 μL de tampon de 1x Tyrode. Ne stimulez pas ces puits de contrôle avec l’antigène.
   1. De plus, ajoutez 100 μL de tampon de 1x Tyrode aux puits sans antigène sensibilisés de la série de dilution, ce qui est nécessaire pour prendre en compte la libération spontanée indépendante de l’antigène des cellules sensibilisées lors de l’analyse des données.
9. Incuber des cellules huRBL pendant 1 h à 37 °C et 5%-7% de CO₂.

6. Mesure de fluorescence de l’activité de la β-hexosaminidase

1. Traiter les puits du contrôle de lyse maximale avec 10 μL de Triton X-100 à 10% par puits et mélanger correctement afin de lyser complètement les cellules et d’obtenir la libération à 100% de β-hexosaminidase.
2. Ajouter 50 μL de solution de substrat dans une nouvelle plaque non contraignante de 96 puits. Solution de substrat pour une plaque de 96 puits: 5 mL de tampon de dosage citrique de 0,1 M, pH 4,5; et 80 μL de 10 mM de 4-méthylumbelliféryle N-acétyl-β-D-glucosaminide.
3. Transférer 50 μL de surnageant cellulaire de tous les puits sur la nouvelle plaque contenant la solution de substrat.
   REMARQUE: Pipettez soigneusement le surnageant de la plaque huRBL afin de ne pas perturber les cellules huRBL.
4. Incuber la plaque avec une solution de substrat et un surnageant cellulaire pendant 1 h à 37 °C pour permettre la conversion du substrat fluorogénique.
   REMARQUE: Conservez la plaque huRBL pour le test de viabilité cellulaire.
5. Ajouter 100 μL de solution d’arrêt (15 g/L de glycine, 11,7 g/L de NaCl dissous dans dH₂O, pH 10,7) par puits.
6. Mesurez la fluorescence à une excitation de 360 nm et à une émission de 465 nm à l’aide d’un lecteur de plaques.

7. Analyse des données

1. Pour les calculs de base du pourcentage de libération, utilisez n’importe quel tableur.
2. Pour la soustraction de fond/l’élimination de la ligne de base, soustrayez la moyenne des puits de fond de tous les autres puits.
3. Calculer la moyenne des puits de lyse maximaux et exprimer les données de la série de dilution en pourcentage. De cette façon, on peut exprimer les données en pourcentage de la libération cellulaire normalisée à la libération maximale d’enzymes causée par la lyse cellulaire.
4. Les courbes complètes de libération du médiateur dose-réponse sont mieux représentées sous forme de graphiques XY avec la concentration d’antigène sur un logarithme sur l’axe X et le pourcentage de libération du médiateur sur l’axe Y.
5. Ajoutez les valeurs du contrôle sans antigène sous forme de ligne pointillée pour indiquer l’arrière-plan ou le plateau inférieur.
   REMARQUE: Plusieurs sérums traités de manière similaire peuvent être comparés à l’aide de cette stratégie de normalisation. À des fins de comparaison directe, il est en outre recommandé de calculer la moitié de la libération maximale, qui est la concentration d’antigène (en ng/mL) nécessaire pour la moitié de la libération maximale définie comme la moyenne des valeurs maximale et minimale par courbe. La concentration d’antigène pour stimuler la moitié de la libération maximale est calculée par interpolation de la valeur de libération de la moitié maximale dans une ligne de régression logarithmique.

Résultats

Le test de libération du médiateur, basé sur des cellules huRBL(figure 1A et B),donne une courbe dose-réponse en forme de cloche (figure 1C). Pour une représentation simplifiée des données, la concentration d’antigène nécessaire pour la moitié de la libération maximale du médiateur peut être calculée à l’aide d’une régression linéaire(Figure 1D). Un test de viabilité cellulaire est effectué pour exclure les effets cytotoxiques dérivés soit du sérum sensibilisant, soit de l’antigène utilisé pour la stimulation (Figure 1E). Le test peut être utilisé pour tester la réactivité de différents sérums à un certain antigène. Dans notre cas, 4 sérums sur 5, dérivés de patients allergiques au pollen de bouleau, ont répondu à la stimulation Bet v 1. Le sérum #1 a montré la libération de médiateur la plus élevée(Figure 2). Le sérum #5 n’a pas répondu à la stimulation Bet v 1 et, par conséquent, pourrait réagir à d’autres allergènes du pollen de bouleau (par exemple, Bet v 2, profiline). Ces données indiquent que Bet v 1 est un allergène puissant responsable des symptômes allergiques médiés par les IgE. En utilisant le test huRBL, la réactivité croisée des IgE aux allergènes homologues peut être évaluée (Figure 3). Ici, les deux patients allergiques au pollen de bouleau ont bien répondu à Bet v 1, tandis que seul le patient n ° 2 a également répondu à Cor a 1, l’allergène alimentaire Bet v 1-homologue trouvé dans les noisettes. Sur la base de ces données, le patient n ° 2 a très probablement des niveaux d’IgE cor 1-réactifs croisés plus élevés que le patient n ° 1, ce qui entraîne des symptômes d’allergie orale lors de la consommation de noisettes. Même l’évaluation de la nature hypoallergénique des variantes mutantes des allergènes (diminution de la puissance) peut être analysée et comparée à leur homologue de type sauvage(Figure 4). Dans l’exemple fourni, la courbe de libération de la variante du pli s’est déplacée vers une concentration d’antigène plus élevée que l’allergène de type sauvage, ce qui a entraîné une concentration significativement plus élevée d’antigène nécessaire pour provoquer une libération à moitié maximale(figure 4B). Ces données impliquent que la variante mutante/pli générée est moins allergène que la protéine de type sauvage. Cette puissance réduite pour déclencher la dégranulation médiée par les IgE met en évidence le caractère hypoallergénique de la variante du pli. Sur la base de ce test, la variante fold est un candidat intéressant pour l’immunothérapie spécifique à l’allergène, car elle pourrait entraîner une réduction des effets secondaires associés aux IgE pendant le traitement.

Figure 1: Cellules RBL humanisées et courbe représentative en forme de cloche de la libération de β-hexosaminidase induite par la réticulation des allergènes IgE. Les cellules RBL adhèrent aux flacons de culture, ce qui leur donne une forme de bâtonnet lorsqu’elles essaient de s’attacher (A). Un niveau idéal de confluence pour les cellules à récolter n’est pas supérieur à 90% (B). Les cellules sont affichées sous un grossissement de 40x et 10x, respectivement. Cellules qui ont été sensibilisées avec le sérum humain d’un individu allergique au pollen de bouleau réagissant lors d’un défi avec Bet v 1 recombinant (rBet v 1), le principal allergène du pollen de bouleau (C). En tant que substitut de la libération du médiateur, l’activité de la β-hexosaminidase est mesurée dans les surnageants cellulaires. La courbe en forme de cloche résulte d’une occupation monovalente des épitopes d’antigènes sur les IgE en raison de l’excès d’allergène, ce qui inhibe de manière compétitive la réticulation allergène-IgE à des concentrations élevées d’antigènes. Une autre explication de la faible libération à des concentrations élevées d’allergènes est l’inhibition des voies intracellulaires en présence d’un excès d’antigène. Pour déterminer la concentration d’allergènes nécessaire pour obtenir la moitié de la libération maximale, une ligne de régression logarithmique basée sur les valeurs expérimentales représentant la partie linéaire de la pente de la courbe de libération du médiateur a été utilisée (D). La ligne pointillée rouge représente la ligne de régression logarithmique utilisée pour le calcul. La formule de la droite de régression est indiquée en rouge. La moitié de la libération maximale est définie comme suit : moitié libération maximale = (valeur de libération minimale + valeur de libération maximale)/2. Dans l’exemple, la moitié de la libération maximale calculée était de 20,6 %. Le sérum humain représentatif utilisé dans cette expérience a été dilué à 1:20 pour l’incubation avec des cellules huRBL, et la concentration d’antigène utilisée pour la stimulation variait de 100 μg / mL à 0,004 pg / mL de Bet v 1. Un test de viabilité cellulaire, dans ce cas un test MTT, a été effectué avec les cellules restantes après stimulation de l’antigène pour évaluer l’influence du sérum sensibilisant ainsi que de la dilution de l’antigène sur la viabilité cellulaire et le nombre de cellules (E). Les cellules d’arrière-plan non traitées et les cellules lysées (lyse maximale) sont affichées en pointillés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Courbes représentatives de la libération de β-hexosaminidase pour cent de cinq sérums humains différents. La même plage de concentration d’antigène de rBet v 1 a été incubée avec des cellules huRBL qui ont été sensibilisées avec des sérums de différents individus sensibilisés au pollen de bouleau. Il existe une nette différence de pourcentage de libération entre les différents patients correspondant à la gravité de leurs symptômes. Notez que le patient #5 n’est pas réactif au principal allergène du pollen de bouleau Bet v 1. Les cinq sérums humains utilisés pour obtenir ces courbes de libération de médiateurs ont été dilués également 1:20 pour l’incubation avec des cellules huRBL. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Réactivité croisée des IgE dérivées de sérums de pollen de bouleau sensibilisés aux patients atteints de l’allergène homologue de la noisette Bet v 1 Cor a 1. Deux sérums représentatifs de patients sensibilisés au pollen de bouleau réagissent fortement à Bet v 1 ainsi que dans une moindre mesure à l’allergène homologue Cor a 1. Le patient 2 présente une réaction significative à Cor a 1 et présentera donc probablement des symptômes d’allergie orale lors de la consommation de noisettes, par rapport au patient 1 où la libération du médiateur est presque négligeable. La ligne pointillée représente le contrôle sans antigène, qui sont des cellules sensibilisées au sérum humain mais non stimulées par un allergène, et, par conséquent, sert d’indication pour le plateau / arrière-plan du signal inférieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Comparaison du pourcentage de libération entre le type sauvage rBet v 1 et une variante de pli hypoallergénique. Le même sérum d’un individu sensibilisé au pollen de bouleau a été incubé avec rBet v 1 de type sauvage (wt) et une variante hypoallergénique du pli du principal allergène du pollen de bouleau (A). Même si la libération de médiateurs est observée dans les deux antigènes, il y a un changement clair vers des concentrations d’antigènes plus élevées lorsque l’on compare la variante de pliage au type sauvage rBet v 1 pour le même pourcentage de libération. Une façon standard de comparer la différence en pourcentage de libération de différents antigènes consiste à calculer la concentration d’antigène nécessaire pour atteindre la moitié de la libération maximale (B). Ceci est généralement effectué dans des répliques biologiques (test de la même gamme d’antigènes pour chaque allergène dans différents sérums humains). Habituellement, afin de tirer des conclusions significatives, la libération du médiateur est réalisée avec des sérums d’au moins 8 à 10 patients différents. Ici, les résultats de quatre sérums différents sont tracés à titre d’exemple. Un test tapparié a été utilisé pour l’analyse statistique. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Questions potentielles et dépannage	Solution
Variabilité d’un essai à l’autre en raison d’une altération de la réactivité cellulaire	Assurez-vous que le nombre de cycles de passage cellulaire ne dépasse pas 20 à 30 passages. Faites des stocks congelés aux premiers passages pour de futures expériences.
	S’appuyer plutôt sur des répliques biologiques (utilisation de sérums différents) que sur des sérums techniques.
Le sérum contient de faibles niveaux d’IgE spécifiques	Une dilution sérique finale plus faible peut être utilisée (c’est-à-dire 1:10) au lieu de 1:20. Inversement, les sérums contenant des niveaux élevés d’IgE spécifiques peuvent être dilués davantage (1:30 ou 1:40).
Pas assez de cellules pour effectuer le test	Assurez-vous que la fluidité dans une fiole T-75 est d’environ 50-90%. Passage plus de flacons.
Effets cytotoxiques des sérums, c’est-à-dire dus à une inactivation incomplète du complément	Effectuer un test de viabilité cellulaire en plus du test de libération du médiateur. Augmenter la concentration d’Ag8 pour éviter une inactivation incomplète du complément.
Signal faible	Améliorer le rapport signal/bruit du test en diluant le tampon du 1x Tyrode dans de l’oxyde de deutérium(D2O) au lieu de dH2O, ou en utilisant un sérum avec des niveaux plus élevés d’IgE spécifiques pour l’allergène d’intérêt.
L’allergène n’est pas stable dans le tampon de Tyrode (p. ex. précipitations)	Effectuez des tests de stabilité dans le tampon de 1x Tyrode avant la procédure d’essai. La substitution du tampon de Tyrode n’est pas recommandée.
Difficultés à trouver la bonne concentration de départ pour l’allergène respectif	Adaptation des séries de dilution pour couvrir la courbe de libération complète (plus d’étapes de dilution, dilution 1:20 au lieu de 1:10).
Mauvaise performance de test indiquée par un signal faible/nul	Évitez les effets cytotoxiques de la stimulation des sérums ou des antigènes (par exemple, les allergènes enzymatiques). Lavez et faites tremper les cellules avec soin. Évitez l’exposition à l’air trop longtemps et empêchez les cellules de se dessécher.
Comment puis-je savoir si le plateau du signal inférieur est atteint?	Ajoutez des commandes « sans antigène » à votre assiette. Ce sont des cellules sensibilisées, qui n’ont été stimulées qu’avec 1x tampon de Tyrode mais sans allergène.
Ai-je besoin d’un témoin positif en plus des puits de lyse maximum?	Comme témoin positif supplémentaire, une combinaison de sérum et d’antigène connue pour provoquer la dégranulation peut être utilisée ou un anticorps anti-FcεR1.
De combien de puits ai-je besoin?	Cela dépend de votre série de titrage, du nombre d’antigènes et de sérums que vous souhaitez analyser.  Planifiez la disposition des plaques de 96 puits en fonction du nombre de sérums / antigènes que vous allez tester. N’oubliez pas d’ajouter les « contrôles sans antigène », les cellules de fond (non sensibilisées, non stimulées) ainsi que les puits de lyse maximum.
Combien de sérums dois-je tester? Et ai-je besoin de répliques ?	Bien que le test soit assez robuste, il existe une certaine variabilité d’essai à essai en raison de la réactivité cellulaire altérée. Par conséquent, il est recommandé de s’appuyer plutôt sur des répliques biologiques (utilisant des sérums différents) que sur des répliques techniques. Un minimum de huit sérums différents est suffisant pour analyser les allergènes. Cependant, comme le montre la Fig. 4B, des résultats significatifs peuvent déjà être obtenus en utilisant moins de sérums.

Tableau 1 : Dépannage.

Discussion

Le test de libération de médiateur à base de cellules huRBL décrit ici est une méthode robuste qui peut facilement être effectuée et mise en œuvre dans n’importe quel laboratoire. La seule exigence est que les cellules doivent être cultivées dans des conditions stériles. Le test est utilisé pour évaluer la probabilité qu’un allergène ou une source allergène évoque la réticulation IgE et la dégranulation basophile des patients¹⁷. Le test peut facilement être adapté à n’importe quel allergène ou source allergène tant que le sérum du patient avec un niveau élevé d’IgE spécifiques, reconnaissant l’allergène d’intérêt, est disponible. Il est recommandé d’effectuer un test de viabilité cellulaire en plus du test de libération du médiateur afin de tenir compte de tout effet cytotoxique potentiel qui pourrait entraîner une mauvaise performance du test. Cela pourrait être dû à une inactivation incomplète du sérum par le complément ou à d’autres effets cytotoxiques dérivés du sérum. Même l’antigène lui-même, par exemple, en raison de l’activité protéolytique / enzymatique, peut nuire aux cellules huRBL. Nous utilisons habituellement un test de viabilité cellulaire avec mtT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) pour évaluer les effets cytotoxiques potentiels. Le test peut facilement être effectué avec les cellules huRBL laissées après la collecte et le transfert du surnageant cellulaire (voir l’étape 6.3. du protocole). Comparé à d’autres méthodes immunochimiques, telles que les ELISA et le Western Blotting, pour déterminer le potentiel allergène d’allergènes individuels ou d’extraits complexes basés sur la liaison allergène-IgE, ce test peut détecter non seulement la liaison des IgE à un allergène, mais peut également mesurer la fonctionnalité des IgE humaines et de l’allergène, pour provoquer une dégranulation basophile médiée par les IgE¹⁸. Ainsi, il peut aider à étudier la gravité des symptômes allergiques ex vivo en utilisant le sérum des patients. Le test serait plus cohérent et plus efficace que les tests d’anaphylaxie cutanée passive classiques, car le test utilise les cellules RBL-2H3, qui sont relativement faciles à manipuler et produisent moins de variabilité dans les résultats par rapport aux cellules primaires, telles que les mastocytes ou les basophiles humains^19,20. En plus de cela, le test fournit une bonne représentation de l’activité biologique des allergènes et peut estimer avec précision la teneur totale en allergènes dans un échantillon complexe donné³. Pour résoudre certaines étapes du protocole, reportez-vous au Tableau 1.

En ce qui concerne l’applicabilité de cette version du test de libération du médiateur, elle a surtout été utilisée à des fins de recherche mais aussi pour la standardisation des extraits allergènes en fonction de leur activité biologique. Cela comprend l’analyse de différents lots de solutions SPT, solution de test de provocation, ainsi que des extraits utilisés pour l’immunothérapie spécifique à l’allergène; comme indiqué pour le pollen, les squames de chat, les acariens de la poussière domestique et les extraits d’arachide,^ainsique le venin^d’abeille3 ,^17,21. La technique peut être appliquée en particulier dans le diagnostic des allergies alimentaires, car elle peut détecter même des quantités minimes de constituants allergènes dans des produits alimentaires complexes tels que les arachides, le lait, le blé et les œufs²². À cet égard, il a également été signalé comme un outil précieux pour l’évaluation de l’allergénicité des allergènes alimentaires pour animaux, tels que les tropomyosines, et peut aider à distinguer les allergènes puissants des non-allergènes²³. En tant qu’outil de recherche, le test est utilisé pour étudier l’impact de la transformation des aliments ainsi que pour évaluer l’influence de la liaison des ligands aux allergènes et son effet sur l’allergénicité^24,25. Par exemple, il a été démontré que la liaison de Bet v 1 aux ligands n’affectait pas la réticulation allergène-IgE, bien qu’elle ait entraîné une augmentation de sa stabilité thermique et protéolytique²⁵. Le test peut être utilisé pour comparer la réactivité du patient aux allergènes mineurs et majeurs, ainsi que pour étudier la réactivité croisée des homologues allergènes et des isoformes, comme le montre notre exemple en utilisant Bet v 1 et l’allergène alimentaire homologue Cor a 1(Figure 3). En ce qui concerne les isoformes allergènes, le test de libération du médiateur a été utilisé pour identifier l’allergène majeur Amb a 1.01 comme l’isoforme réactive IgE la plus puissante dans le pollen d’herbe à poux (Ambrosia artemisiifolia). En comparaison, les deux autres isoformes identifiées dans les extraits de pollen d’herbe à poux, Amb a 1,02 et Amb a 1,03, ont montré une réactivité réduite aux IgE²⁶des patients.

Au cours des dernières années, le test a été appliqué pour étudier les composés anti-allergiques potentiels et les nouvelles variantes hypoallergéniques des allergènes, aidant à l’identification de candidats appropriés pour l’immunothérapie spécifique à l’allergène^27,28. Une autre nouvelle approche consiste à utiliser le test pour surveiller l’efficacité du traitement au cours d’une immunothérapie spécifique à un allergène. À cet égard, notre groupe de recherche a développé un système d’inhibition du test huRBL, qui était bien corrélé avec la réduction du score symptomatique du patient au cours de l’immunothérapie spécifique à l’allergène²⁹. Le test a également été proposé pour étudier les effets immunosuppresseurs de la TGFβ1 sur la dégranulation induite par les IgE induite par les allergènes^30.

Les limites du test sont que même si les cellules huRBL possèdent certaines caractéristiques des mastocytes ou des basophiles, elles n’imitent pas complètement la fonction naturelle de ces cellules effectrices. Par exemple, les mastocytes expriment largement le récepteur de reconnaissance de formes Toll-like receptor 4 (TLR4), nécessaire à la reconnaissance des agents pathogènes, alors qu’il est complètement déficient dans les cellules RBL-2H3³¹. En raison de cette différence de fonctionnalité, le test n’imite pas complètement la situation réelle, ce qui doit être gardé à l’esprit lors de l’interprétation des données. De plus, étant donné que les cellules huRBL sont des cellules basophiles cancéreuses, les changements dans les conditions de culture et la culture prolongée peuvent entraîner des différences phénotypiques conduisant à des résultats altérés entre différents laboratoires²⁰. Un autre aspect est le choix de la concentration d’allergènes qui doit être pris en compte lors de l’adaptation de cette méthode car des concentrations élevées d’allergènes peuvent entraîner une dégranulation non médiée par les IgE en raison de la présence de grandes quantités de protéases ou d’endotoxines¹⁸. D’autres limites sont la dépendance aux sérums humains avec des niveaux d’IgE spécifiques relativement élevés (classe RAST 5-6), et la nécessité de systèmes de culture cellulaire, qui reste un obstacle à surmonter afin de mettre en œuvre la technique dans la routine clinique quotidienne.

En dehors de ces limitations, le test huRBL représente un outil de recherche précieux pour le diagnostic et le traitement des maladies allergiques et peut être utilisé dans un large éventail d’applications.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide	Sigma	M2133
96-well plate for huRBL cells (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, flat-bottom microplate)	ThermoFisher Scientific	167008
96-well plate for substrate solution and cell supernatant (Greiner Bio-One non-treated 96-well microplates)	Fisher Scientific	655101
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	10735078001
Citric acid	Applichem	131018
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS without calcium and magnesium)	Sigma	D8537
G418	Sigma	A1720
Glycine	Applichem	A3707
Heat-inactivated fetal calf/bovine serum (FCSi)	Sigma	F0804
L-Glutamine (200 mM)	Sigma	G7513
Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, with ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma	M8042
Opti-MEM reduced serum medium, GlutaMAX supplement	Gibco/ThermoFisher Scientific	51985034
Penicillin-Streptomycin (10K units Pen.  10 mg/mL Strep.)	Sigma	P4333
Sodium chloride (NaCl)	Applichem	A2942
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Applichem	131638
Triton X-100	Sigma	X100
Trypsin-EDTA	Sigma	59418C
Tyrode’s salt	Sigma	T2145