Test di rilascio del mediatore umanizzato come lettura per la potenza degli allergeni

Riepilogo

Qui presentiamo il test di rilascio del mediatore, utilizzando una linea cellulare di leucemia basofila di ratto trasfetta con il recettore IgE umano, per simulare la degranulazione delle cellule effezionali tipicamente osservata nelle reazioni allergiche di tipo 1. Questo metodo studia l'attività biologica degli allergeni in modo altamente sensibile, riproducibile e personalizzabile.

Abstract

I test di rilascio del mediatore analizzano la degranulazione mediata dall'immunoglobulina E (IgE) in vitro e la secrezione di mediatori da parte di cellule emotrici, come mastociti e basofili, dopo stimolazione con diluizioni seriali di allergeni putativi. Pertanto, questi test rappresentano uno strumento essenziale che imita il processo di degranulazione in vivo, che si verifica in caso di esposizione agli allergeni in pazienti sensibilizzati o in prick test cutanei. Inoltre, questi saggi sono solitamente impiegati per studiare il potenziale allergenico delle proteine e la reattività della reattività dei sieri dei pazienti. Qui, descriviamo un semplice protocollo di 2 giorni che utilizza una linea cellulare di leucemia basofila di ratto immortalizzata trasfetta e umanizzata con il recettore della membrana plasmatica IgE umana ad alta affinità (FcεRI). Questa variante del test di rilascio del mediatore è un sistema cellulare in vitro robusto, sensibile e riproducibile senza la necessità di immobilizzare l'antigene in matrici solide. Il protocollo consiste nelle seguenti fasi: (1) inattivazione del complemento dei sieri umani, (2) raccolta, semina e sensibilizzazione passiva delle cellule, (3) stimolazione con antigene per causare il rilascio del mediatore e (4) misurazione dell'attività della β-esosaminidasi come surrogato dei mediatori infiammatori rilasciati, come l'istamina. Il test rappresenta uno strumento utile per valutare la capacità del cross-linking allergene-IgE di innescare la degranulazione cellulare e può essere implementato per standardizzare gli estratti di allergeni, per confrontare la reattività dei pazienti con allergeni minori o maggiori e con estratti allergenici (polline, peli di gatto, ecc.), per indagare la potenza degli omologhi allergenici, delle isoforme e delle varianti di piega (ad esempio, ipoallergenicità), nonché gli effetti dei ligandi sull'attività allergenica. Un'applicazione più recente include l'uso del test per monitorare l'efficacia del trattamento nel corso dell'immunoterapia con allergeni.

Introduzione

Le reazioni di ipersensibilità di tipo I, caratterizzate dalla produzione di immunoglobuline E (IgE) specifiche per un rispettivo antigene, colpiscono quasi un terzo della popolazione mondiale. Queste reazioni sono associate a diverse manifestazioni allergiche come l'asma e la rinocongiuntivite e possono anche portare a reazioni sistemiche potenzialmente letali¹. A differenza dei test in vivo, gli approcci immunochimici, come il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), sono adatti esclusivamente per studiare il legame bersaglio degli anticorpi, ma non affrontano l'aspetto funzionale delle proteine che possono causare reazioni di ipersensibilità immediate. L'immobilizzazione degli allergeni su supporti solidi (ad esempio, piastre ELISA) potrebbe causare cambiamenti nella loro integrità strutturale e la distruzione degli epitopi rilevanti per l'allergia². Anche i prick test cutanei (SPT), lo strumento più comune per confermare la sensibilizzazione contro determinati allergeni, hanno i loro limiti per quanto riguarda l'individuazione di allergia alimentare sintomatica IgE-mediata o disponibilità di allergeni^3,4. Al fine di trovare un metodo etico, altamente specifico, sensibile ed economico per testare la potenza biologica degli allergeni per causare una reazione di ipersensibilità di tipo I, sono stati stabiliti i cosiddetti test di rilascio del mediatore.

Il principio di questi saggi si basa su eventi successivi alla fase di sensibilizzazione e sulla capacità di legame delle IgE alla catena α dei recettori ad alta affinità espressi sulla superficie delle cellule emotrici, come mastociti e basofili. Le IgE sono prodotte principalmente dalle plasmacellule nel tessuto linfoide associato alla mucosa. Sebbene sia l'immunoglobulina meno abbondante (circa lo 0,05% negli individui non atopici) nel sangue, possiede un'attività biologica straordinariamente elevata essendo la causa principale dei sintomi allergici. L'emivita delle IgE può aumentare da 2-3 giorni a diverse settimane e persino mesi quando legata ai suoi recettori sulle cellule estattori. Il successivo legame di un antigene alla regione variabile di due molecole di IgE legate al recettore porta al loro cross-linking seguito dall'induzione di una cascata di segnalazione a valle nella cellula estruttrice che porta alla degranulazione e al rilascio di diversi mediatori pro-infiammatori che causano vasodilatazione, come istamina, proteasi serina (ad esempio, triptasi) e prostaglandine^5,6,7. La secrezione di citochine come l'interleuchina 4 (IL-4) e IL-13 sono responsabili del mantenimento della risposta infiammatoria T helper 2 (Th2) e del passaggio di classe delle cellule B alle plasmacellule produttrici di IgE^5,8,9. D'altra parte, il trombossano rilasciato provoca broncocostrizione e i leucotrieni stimolano la contrazione della muscolatura liscia e la perdita vascolare e svolgono un ruolo cruciale nell'infiammazione delle vie aeree che porta all'asma o alla rinite allergica^10,11.

Sono stati istituiti strumenti di ricerca per analizzare la maggior parte dei suddetti mediatori, anche se con alcuni importanti svantaggi. I saggi di triptasi sono approcci clinici adatti per la misurazione dell'anafilassi sistemica attraverso l'attivazione dei mastociti, ma la loro sensibilità e specificità nelle diagnosi di allergia è troppo imprecisa rispetto ai metodi gold standard come SPT. D'altra parte, i test di cisteinil leucotriene non sono in grado di diagnosticare allergie a β-lattamici o farmaci antinfiammatori non steroidei¹². I protocolli per la misurazione dell'istamina come principale mediatore rilasciato nelle reazioni allergiche erano già stabiliti nel 1960. Una volta rilasciata nel sangue periferico, l'istamina viene immediatamente degradata dalle istamina metiltransferasi con conseguente emivita plasmatica di pochi minuti, rendendo la sua analisi piuttosto impegnativa¹³. A parte la sua instabilità, il monitoraggio dell'istamina ha dimostrato di avere una bassa specificità e sensibilità per le allergie ai farmaci, nonché proteine alimentari commerciali e veleni di vespe¹².

Modelli in vitro con linee cellulari emozionali sono stati introdotti come alternativa alle procedure ad alta intensità di lavoro di isolamento e coltivazione di basofili da pazienti allergici per eseguire test di rilascio. Pertanto, il test basato sulla leucemia basofila del ratto (RBL-) utilizzando la linea cellulare RBL-2H3 è stato stabilito³. Poiché questa linea cellulare non è in grado di legare le IgE umane, è stata prima trasfetta con la catena α, β e γ del recettore della membrana plasmatica delle IgE umane (FcεRI). Diversi cloni sono stati generati e testati per i livelli di espressione e l'omogeneità della catena α umana, di cui il clone RBL-30/25 è emerso come il candidato più promettente per i test in vitro. La cascata di segnalazione indotta dall'attivazione del recettore del clone trasfettato è stata testata tramite saggi di mobilizzazione del calcio. Come indicatore per la degranulazione e surrogato per il rilascio di istamina, è stato misurato l'enzima lisosomiale β-esosaminidasi, che ha il vantaggio significativo di una maggiore stabilità¹⁴. Il rilascio del mediatore utilizzando cellule RBL-30/25 raggiunge fino al 100% ed è, quindi, utilizzato per testare sieri derivati da pazienti allergici. Il test è stato testato per il rilascio del mediatore dopo aver sfidato le cellule sensibilizzate con estratti di allergeni commerciali. Ciò ha portato alla scoperta che esiste un'enorme variazione nella composizione (fino a 60 volte per quanto riguarda il contenuto proteico totale) degli estratti di allergeni derivati da diversi produttori e utilizzati per approcci diagnostici (ad esempio, SPT) o terapeutici^3,15,16.

Qui forniamo una descrizione dettagliata del protocollo RBL per eseguire il test di rilascio del mediatore utilizzando siero di donatori allergici. Durante la sensibilizzazione passiva, le IgE nel siero vengono catturate dal recettore FcεR1 ad alta affinità espresso sulla superficie delle cellule basofile. Dopo la stimolazione dell'antigene, le IgE legate specifiche per l'antigene sono reticolate, innescando la degranulazione cellulare e il rilascio del mediatore β-esosaminidasi. L'attività della β-esosaminidasi viene successivamente misurata utilizzando un substrato adatto. Per il test sono state utilizzate cellule huRBL-2H3 e denominate huRBL nel seguente protocollo. Il protocollo descrive una serie standard di diluizione dell'antigene con 8 fasi diluite 1:10 che vanno da 1 μg/mL a 0,1 pg/mL di allergene.

Protocollo

L'approvazione etica per l'uso di sieri derivati da pazienti allergici al polline di betulla è stata ottenuta dal comitato etico olandese (numero di approvazione: NL65758.018.18).

1. Procedure di sicurezza

1. Lavorare in condizioni sterili utilizzando un banco di lavoro di classe di sicurezza biologica 2 durante il primo giorno dell'esperimento (livello di biosicurezza 2). Seguire le linee guida di sicurezza dell'istituzione per l'uso del siero umano.

2. Inattivazione del complemento dei sieri umani

1. Raccogliere una densa coltura di cellule P3X63Ag8.653 (d'ora in poi denominate cellule Ag8), dal pallone di coltura cellulare e trasferirle in un tubo di centrifugazione.
   1. Utilizzare il seguente terreno di coltura per queste cellule: Modified Eagles's Minimum Essential Medium con ridotta concentrazione sierica, 1% di penicillina-streptomicina (100 unità Pen., 0,1 mg/mL streptococco), 5% di siero fetale inattivato dal calore/siero bovino (FCSi).
2. Centrifugare celle Ag8 per 5 min a 250 x g a temperatura ambiente.
3. Sospendere di sospendere il pellet cellulare ad una concentrazione finale di circa 1 x^{10 6} celle/mL in mezzo huRBL (Minimum Essential Medium Eagle con Alpha Modification, 4 mM L-Glutammina, 5% FCSi, 1% G418 (100% stock: 10 g/125 mL dH₂O).
   NOTA: Mantenere le cellule Ag8 passando anche per un uso futuro.
4. Diluire i sieri umani 1:10 in sospensione cellulare Ag8. La diluizione finale del siero nel test sarà 1:20.
   NOTA: Per i sieri con IgE poco specifiche può essere utilizzato un 1:5 (diluizione finale 1:10).
5. Incubare per 1 ora a 37 °C e 5%-7% CO₂.

3. Raccolta e semina di cellule huRBL

1. Aspirare accuratamente il mezzo da un pallone di coltura cellulare T-75 senza toccare le cellule huRBL (le cellule huRBL sono aderenti). Assicurarsi che le cellule siano confluenti intorno al 50%-90%.
   NOTA: a seconda della confluenza cellulare, il contenuto cellulare di un pallone denso di coltura cellulare T-75 è solitamente sufficiente per una o due piastre da 96 pozzetti.
2. Lavare le cellule due volte aggiungendo 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Aggiungere DPBS sul lato opposto del pallone e non direttamente sulle celle.
3. Aspirare DPBS e aggiungere 5 ml di tripsina-EDTA preriscaldata 1x (0,05%/0,02% EDTA diluito in DPBS) per il distacco cellulare.
4. Incubare il matraccio per 5 minuti a 37 °C.
5. Staccare le cellule picchiettando con cura il pallone.
6. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifugazione da 15 mL e riempire con mezzo huRBL o DPBS per diluire la tripsina-EDTA.
7. Centrifugare le celle a 250 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Aspirare il surnatante e risuspenare il pellet in 5 mL di mezzo huRBL per il conteggio delle cellule.
9. Contare le cellule e diluirle in mezzo huRBL per ottenere una concentrazione finale di 2 x 10⁶ cellule/ml.
10. Utilizzare una piastra sterile a 96 pozzetti e aggiungere 50 μL di sospensione di cellule huRBL per pozzetti, che equivale a 1 x 10⁵ celle / pozzettino.

4. Sensibilizzazione passiva delle cellule huRBL

1. Centrifugare la sospensione pre-incubata ag8/sierica per 5 min a 250 x g.
2. Trasferire 50 μL della sospensione centrifuga Ag8/siero in ciascun pozzo contenente cellule huRBL senza disturbare il pellet di cellule Ag8.
   1. Includere il controllo senza antigene, che sono sensibilizzate, ma cellule non stimolate (non aggiungere antigene), che serve come indicazione per il plateau / sfondo del segnale inferiore. I pozzi di controllo dello sfondo e della massima lisi non devono essere sensibilizzati con il siero. Aggiungere invece 50 μL di mezzo huRBL per controllare i pozzi.
3. Coprire la piastra con il coperchio e incubare durante la notte a 37 °C e 5%-7% CO₂.

5. Degranulazione stimolata dall'antigene e rilascio di mediatori

1. Preparare in anticipo la diluizione dell'antigene in 1x tampone di Tyrode (9,5 g/L sali di Tyrode, 0,1% di albumina sierica bovina (BSA), 0,5 g/L di carbonato acido di sodio (NaHCO₃₎in dH₂O). È necessaria una quantità finale di 100 μL per pozzedo.
   NOTA: Non tutti gli allergeni, purificati da fonti naturali o prodotti in modo ricombinante, potrebbero essere stabili nel tampone di Tyrode 1x. Pertanto, eseguire test di stabilità nel buffer di Tyrode 1x prima della procedura di analisi. In alternativa, diluire 1x tampone di Tyrode in ossido di deuterio (D₂O) per aumentare il rapporto segnale-rumore del saggio.
2. Effettuare 8 diluizioni dell'antigene di interesse di una serie di diluizione 1:10 in provette di reazione a partire da 10 o 1 μg/mL di proteine.
   NOTA: testare sempre in anticipo la serie di diluizione. In alternativa, adattare la serie di diluizione 1:10 (ad esempio, 1:5, 1:20 o 1:30) per coprire l'intera curva di rilascio. Inoltre, la concentrazione iniziale può variare a seconda della configurazione sperimentale.
3. Per lavare le celle huRBL placcate sulla piastra a 96 pozzi, rimuovere prima il mezzo cellulare contenente sieri aspirando, invertendo e picchiettando attentamente la piastra su carta assorbente.
4. Lavare le cellule con 200 μL di 1x tampone di Tyrodes per pozzo. Tratta tutti i pozzi allo stesso modo.
   NOTA: Aggiungere lentamente la soluzione di lavaggio alle cellule per non disturbarle.
5. Lasciare per circa 30 s e ripetere la fase di lavaggio tre volte in totale.
6. Dopo aver aggiunto la soluzione di lavaggio per l'ultima volta, lasciare la soluzione nei pozzeggi fino a quando non è pronta per continuare con l'aggiunta della diluizione dell'antigene.
   NOTA: evitare di esporre le celle all'aria per troppo tempo.
7. Trasferire 100 μL di soluzione antigene a ciascun pozzetto contenente le cellule huRBL pre-sensibilizzate.
   NOTA: se si analizzano diversi parametri, trasferire i singoli campioni della serie di diluizione in un'ulteriore piastra a 96 pozzetti non vincolante (utilizzare lo stesso layout della piastra huRBL) e trasferirli successivamente con una pipetta multicanale direttamente sulla piastra della cella huRBL. In questo modo, è possibile evitare di esporre le celle all'aria per troppo tempo, il che potrebbe comportare scarse prestazioni del test (segnale inferiore / nullo).
8. Coprire i pozzi di controllo (lisi massima e celle di fondo non sensibilizzate) con 100 μL di 1x tampone di Tyrode. Non stimolare questi pozzeli di controllo con l'antigene.
   1. Inoltre, aggiungere 100 μL di 1x tampone di Tyrode ai pozzetto sensibilizzati senza antigene della serie di diluizione, che è necessario per prendere in considerazione il rilascio spontaneo indipendente dall'antigene di cellule sensibilizzate durante l'analisi dei dati.
9. Incubare le cellule huRBL per 1 ora a 37 °C e 5%-7% DI CO₂.

6. Misurazione della fluorescenza dell'attività della β-esosaminidasi

1. Trattare i pozzetti del massimo controllo della lisi con 10 μL di Triton X-100 al 10% per pozzetto e mescolare correttamente per lisi completamente le cellule e ottenere il rilascio al 100% di β-esosaminidasi.
2. Aggiungere 50 μL di soluzione di substrato in una nuova piastra a 96 pozzetti non vincolante. Soluzione di substrato per una piastra a 96 pozzi: 5 mL di tampone citrico da 0,1 M, pH 4,5; e 80 μL di 10 mM 4-metilumbelliferil N-acetil-β-D-glucosaminide.
3. Trasferire 50 μL di surnatante cellulare di tutti i pozzi alla nuova piastra contenente la soluzione di substrato.
   NOTA: Pipettare il surnatante con attenzione dalla piastra huRBL per non disturbare le cellule huRBL.
4. Incubare la piastra con soluzione di substrato e surnatante cellulare per 1 ora a 37 °C per consentire la conversione del substrato fluorogenico.
   NOTA: Conservare la piastra huRBL per il test di vitalità cellulare.
5. Aggiungere 100 μL di soluzione di arresto (15 g/L glicina, 11,7 g/L NaCl disciolto in dH₂O, pH 10,7) per pozzo.
6. Misurare la fluorescenza a 360 nm di eccitazione e 465 nm di emissione utilizzando un lettore di piastre.

7. Analisi dei dati

1. Per i calcoli di base del rilascio percentuale, utilizzare qualsiasi software per fogli di calcolo.
2. Per la sottrazione di sfondo/rimozione della linea di base, sottrarre la media dei pozzi di fondo da tutti gli altri pozzi.
3. Calcolare la media dei pozzi di lisi massima ed esprimere i dati della serie di diluizione in percentuale. In questo modo si possono esprimere i dati come percentuale di rilascio cellulare normalizzato al massimo rilascio enzimatico causato dalla lisi cellulare.
4. Le curve complete di rilascio del mediatore dose-risposta sono rappresentate meglio come grafici XY con la concentrazione dell'antigene su un registro sull'asse X e la percentuale di rilascio del mediatore sull'asse Y.
5. Aggiungere i valori del controllo senza antigene come linea tratteggiata per indicare lo sfondo o il plateau inferiore.
   NOTA: Diversi sieri trattati in modo simile possono essere confrontati utilizzando questa strategia di normalizzazione. Per il confronto diretto, si raccomanda inoltre di calcolare il rilascio semi-massimo, che è la concentrazione di antigene (in ng/mL) necessaria per il rilascio mezzo massimo definito come la media dei valori massimali e minimi per curva. La concentrazione di antigene per stimolare il rilascio mezzo massimo è calcolata mediante interpolazione del valore di rilascio mezzo massimo in una linea di regressione logaritmica.

Risultati

Il test di rilascio del mediatore, basato su cellule huRBL (Figura 1A e B), si traduce in una curva dose-risposta a forma di campana ( Figura1C). Per una rappresentazione semplificata dei dati, la concentrazione di antigene necessaria per il rilascio del mediatore semi-massimo può essere calcolata utilizzando la regressione lineare (Figura 1D). Viene eseguito un test di vitalità cellulare per escludere effetti citotossici derivati dal siero sensibilizzante o dall'antigene utilizzato per la stimolazione (Figura 1E). Il test può essere utilizzato per testare la reattività di diversi sieri a un determinato antigene. Nel nostro caso, 4 sieri su 5, derivati da pazienti allergici al polline di betulla, hanno risposto alla stimolazione di Bet v 1. Il siero #1 ha mostrato il più alto rilascio di mediatore (Figura 2). Il siero #5 non ha risposto alla stimolazione di Bet v 1 e, quindi, potrebbe reagire ad altri allergeni del polline di betulla (ad esempio, Bet v 2, profilina). Questi dati indicano che Bet v 1 è un potente allergene responsabile dei sintomi allergici mediati da IgE. Utilizzando il test huRBL, è possibile valutare la cross-reattività delle IgE agli allergeni omologhi (Figura 3). Qui, entrambi i pazienti allergici al polline di betulla hanno risposto bene a Bet v 1, mentre solo il paziente #2 ha risposto anche a Cor a 1, l'allergene alimentare omologo Bet v 1 trovato nelle nocciole. Sulla base di questi dati, il paziente #2 molto probabilmente ha livelli di IgE Cor a 1-cross-reattivi più elevati rispetto al paziente #1, con conseguenti sintomi di allergia orale al consumo di nocciole. Anche la valutazione della natura ipoallergenica delle varianti mutanti degli allergeni (diminuzione della potenza) può essere analizzata e confrontata con la loro controparte wild-type (Figura 4). Nell'esempio fornito, la curva di rilascio della variante fold si è spostata verso una concentrazione di antigene più elevata rispetto all'allergene wild-type, determinando una concentrazione significativamente più elevata di antigene necessaria per provocare il rilascio mezzo massimo (Figura 4B). Questi dati implicano che la variante mutante/fold generata è meno allergenica rispetto alla proteina wild-type. Questa potenza ridotta per innescare la degranulazione mediata da IgE evidenzia il carattere ipoallergenico della variante fold. Sulla base di questo test, la variante fold è un candidato interessante per l'immunoterapia allergene-specifica poiché potrebbe causare una riduzione degli effetti collaterali associati alle IgE durante il trattamento.

Figura 1: Cellule RBL umanizzate e una curva rappresentativa a campana di rilascio di β-esosaminidasi indotta da IgE-allergene. Le cellule RBL sono aderenti ai palloni di coltura, il che conferisce loro una forma a bastoncello mentre cercano di attaccarsi (A). Un livello ideale di confluenza per le cellule da raccogliere non è superiore al 90% (B). Le celle sono mostrate con ingrandimento di 40x e 10x, rispettivamente. Cellule che sono state sensibilizzate con siero umano di un individuo allergico al polline di betulla che reagisce alla sfida con Bet v 1 ricombinante (rBet v 1), il principale allergene del polline di betulla (C). Come surrogato per il rilascio del mediatore, l'attività della β-esosaminidasi viene misurata nei supernatanti cellulari. La curva a campana deriva da un'occupazione monovalente di epitopi di antigene sulle IgE a causa dell'eccesso di allergene, che inibisce in modo competitivo il cross-linking allergene-IgE ad alte concentrazioni di antigene. Un'altra spiegazione per il basso rilascio ad alte concentrazioni di allergeni è l'inibizione delle vie intracellulari in presenza di antigene in eccesso. Per la determinazione della concentrazione di allergeni necessaria per ottenere il rilascio mezzo massimo, è stata utilizzata una linea di regressione logaritmica basata sui valori sperimentali che rappresentano la parte lineare della pendenza della curva di rilascio del mediatore (D). La linea tratteggiata rossa rappresenta la linea di regressione logaritmica utilizzata per il calcolo. La formula della linea di regressione è mostrata in rosso. Il rilascio mezzo massimo è definito come: metà rilascio massimo = (valore di rilascio minimo + valore di rilascio massimo)/2. Nell'esempio, il rilascio mezzo massimo calcolato era del 20,6%. Il siero umano rappresentativo utilizzato in questo esperimento è stato diluito 1:20 per l'incubazione con cellule huRBL e la concentrazione di antigene utilizzata per la stimolazione variava da 100 μg / mL a 0,004 pg / mL di Bet v 1. Un test di vitalità cellulare, in questo caso un test MTT, è stato eseguito con le cellule rimanenti dopo stimolazione antigenica per valutare l'influenza del siero sensibilizzante e della diluizione dell'antigene sulla vitalità cellulare e sulla conta cellulare (E). Le cellule di fondo non trattate e le cellule lizzate (lisi massima) sono mostrate come linea tratteggiata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Curve rappresentative del rilascio percentuale di β-esosaminidasi di cinque diversi sieri umani. Lo stesso intervallo di concentrazione dell'antigene di rBet v 1 è stato incubato con cellule huRBL sensibilizzate con sieri di diversi individui sensibilizzati al polline di betulla. C'è una chiara differenza di rilascio percentuale tra i diversi pazienti corrispondente alla gravità dei loro sintomi. Si noti che il paziente #5 non è reattivo al principale allergene del polline di betulla Bet v 1. Tutti e cinque i sieri umani utilizzati per ottenere queste curve di rilascio del mediatore sono stati diluiti equamente 1:20 per l'incubazione con cellule huRBL. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Cross-reattività delle IgE derivate da sieri di polline di betulla sensibilizzati pazienti con l'allergene omologo alla nocciola Bet v 1 Cor a 1. Due sieri rappresentativi di pazienti sensibilizzati al polline di betulla reagiscono fortemente a Bet v 1 e in misura minore all'allergene omologo Cor a 1. Il paziente 2 mostra una reazione significativa a Cor a 1, e quindi probabilmente mostrerà sintomi di allergia orale al consumo di nocciole, rispetto al paziente 1 in cui il rilascio del mediatore è quasi trascurabile. La linea tratteggiata rappresenta il controllo senza antigene, che sono cellule sensibilizzate con i sieri umani ma non stimolate con un allergene, e, quindi, serve come indicazione per il plateau / sfondo del segnale inferiore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto della percentuale di rilascio tra rBet v 1 wild type e una variante ipoallergenica fold-variant. Lo stesso siero di un individuo sensibilizzato al polline di betulla è stato incubato con rBet v 1 wild type (wt) e una variante ipoallergenica del principale allergene del polline di betulla (A). Anche se il rilascio del mediatore è visto in entrambi gli antigeni, c'è un chiaro spostamento verso concentrazioni di antigene più elevate quando si confronta la variante fold a rBet v 1 di tipo selvaggio per lo stesso rilascio percentuale. Un modo standard per confrontare la differenza di rilascio percentuale di diversi antigeni è calcolare la concentrazione di antigene necessaria per raggiungere la metà del rilascio massimo (B). Questo di solito viene eseguito in repliche biologiche (test dello stesso intervallo di antigeni per ciascun allergene in diversi sieri umani). Di solito, al fine di trarre conclusioni significative, il rilascio del mediatore viene eseguito con sieri da almeno 8 a 10 pazienti diversi. Qui i risultati di quattro diversi sieri sono tracciati come esempio. Un t-test accoppiato è stato utilizzato per l'analisi statistica. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Potenziali domande e risoluzione dei problemi	Soluzione
Variabilità da test a saggio dovuta all'alterata reattività cellulare	Assicurarsi che il numero del ciclo di passaggio cellulare non superi i 20-30 passaggi. Crea scorte congelate ai primi passaggi per esperimenti futuri.
	Piuttosto affidarsi a repliche biologiche (uso di sieri diversi) rispetto a quelle tecniche.
Sera contiene bassi livelli di IgE specifiche	È possibile utilizzare una diluizione sierica finale inferiore (cioè 1:10) invece di 1:20. Al contrario, i sieri contenenti alti livelli di IgE specifiche possono essere ulteriormente diluiti (1:30 o 1:40).
Non abbastanza cellule per eseguire il test	Assicurarsi che la confluenza in un pallone T-75 sia di circa il 50-90%. Passaggio più fiaschi.
Effetti citotossici dei sieri, cioè dovuti all'inattivazione incompleta del complemento	Eseguire un test di vitalità cellulare in aggiunta al test di rilascio del mediatore. Aumentare la concentrazione di Ag8 per evitare l'inattivazione incompleta del complemento.
Segnale basso	Migliorare il rapporto segnale-rumore del test diluendo il tampone di Tyrode 1x in ossido di deuterio (D2O) invece di dH2O, o utilizzando un sieri con livelli più elevati di IgE specifiche per l'allergene di interesse.
L'allergene non è stabile nel tampone di Tyrode (ad es. precipitazione)	Effettuare test di stabilità in 1x tampone di Tyrode prima della procedura di analisi. La sostituzione del buffer di Tyrode non è raccomandata.
Problemi a trovare la giusta concentrazione iniziale per il rispettivo allergene	Adattamento delle serie di diluizione per coprire l'intera curva di rilascio (più fasi di diluizione, diluizione 1:20 anziché 1:10).
Scarse prestazioni del test indicate da segnale basso/nullo	Evitare gli effetti citotossici della stimolazione dei sieri o dell'antigene (ad es. allergeni enzimatici). Lavare e immergere accuratamente le cellule. Evitare l'esposizione all'aria per troppo tempo e impedire alle cellule di asciugarsi.
Come faccio a sapere se viene raggiunto il plateau del segnale inferiore?	Aggiungi controlli "nessun antigene" alla tua piastra. Queste sono cellule sensibilizzate, che sono state stimolate solo con 1x tampone di Tyrode ma senza un allergene.
Ho bisogno di un controllo positivo oltre ai pozze pozzi di lisi massima?	Come ulteriore controllo positivo può essere utilizzata una combinazione di siero e antigene nota per causare degranulazione o un anticorpo anti-FcεR1.
Di quanti pozzi ho bisogno?	Dipende dalla serie di titolazione, dal numero di antigeni e sieri che si desidera analizzare.  Pianifica il layout per le piastre a 96 pozzetti in base a quanti sieri / antigeni stai per testare. Non dimenticare di aggiungere i "controlli senza antigene", le cellule di fondo (non sensibilizzate, non stimolate) e i pozzetto di lisi massima.
Quanti sieri dovrei testare? E ho bisogno di repliche?	Sebbene il test sia abbastanza robusto, c'è una certa variabilità da test a test a causa dell'alterata reattività cellulare. Pertanto, si raccomanda di fare affidamento piuttosto su repliche biologiche (utilizzando sieri diversi) piuttosto che su repliche tecniche. Un minimo di otto sieri diversi è sufficiente per analizzare gli allergeni. Tuttavia, come mostrato in Fig. 4B, risultati significativi possono già essere ottenuti utilizzando meno sieri.

Tabella 1: Risoluzione dei problemi.

Discussione

Il test di rilascio del mediatore basato su cellule huRBL qui descritto è un metodo robusto che può essere facilmente eseguito e implementato in qualsiasi laboratorio. L'unico requisito è che le cellule debbano essere coltivate in condizioni sterili. Il test viene utilizzato per valutare la probabilità che un allergene o una fonte allergenica evochi la reticolazione delle IgE e la degranulazione basofila dei^{pazienti 17}. Il test può essere facilmente adattato a qualsiasi allergene o fonte allergenica purché sia disponibile il siero del paziente con un alto livello di IgE specifiche, riconoscendo l'allergene di interesse. Si raccomanda di eseguire un test di vitalità cellulare in aggiunta al test di rilascio del mediatore al fine di tenere conto di eventuali potenziali effetti citotossici che potrebbero causare scarse prestazioni del test. Ciò potrebbe essere dovuto all'inattivazione incompleta del complemento dei sieri o ad altri effetti citotossici derivati dal siero. Anche l'antigene stesso, ad esempio, a causa dell'attività proteolitica / enzimatica, può danneggiare le cellule huRBL. Di solito utilizziamo un test di vitalità cellulare con MTT (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazolio Bromuro) per valutare potenziali effetti citotossici. Il test può essere facilmente eseguito con le cellule huRBL rimaste dopo che il surnatante cellulare è stato raccolto e trasferito (vedere il punto 6.3. del protocollo). Rispetto ad altri metodi immunochimici, come ELISA e western blotting, per determinare il potenziale allergenico di singoli allergeni o estratti complessi basati sul legame allergene-IgE, questo test può rilevare non solo il legame delle IgE a un allergene, ma può anche misurare la funzionalità di entrambi, IgE umane e l'allergene, per provocare la degranulazione basofila mediata da IgE¹⁸. Pertanto, può aiutare a studiare la gravità dei sintomi allergici ex vivo utilizzando i sieri dei pazienti. Il test è segnalato per essere più coerente ed efficiente rispetto ai classici test di anafilassi cutanea passiva poiché il test utilizza le cellule RBL-2H3, che sono relativamente facili da maneggiare e producono meno variabilità nei risultati rispetto alle cellule primarie, come i mastociti o i basofili umani^19,20. Oltre a questo, il test fornisce una buona rappresentazione dell'attività biologica degli allergeni e può stimare con precisione il contenuto totale di allergeni in un determinato campione complesso³. Per la risoluzione dei problemi relativi a determinati passaggi del protocollo, fare riferimento alla Tabella 1.

Per quanto riguarda l'applicabilità di questa versione del test di rilascio del mediatore, è stato utilizzato principalmente per scopi di ricerca ma anche per la standardizzazione degli estratti allergenici in base alla loro attività biologica. Ciò include l'analisi di diversi lotti di soluzioni SPT, soluzione di test di provocazione e estratti utilizzati per l'immunoterapia specifica degli allergeni; come mostrato per polline, peli di gatto, acari della polvere domestica ed estratti di arachidi, nonché veleno d'api^3,17,21. La tecnica può essere applicata soprattutto nella diagnosi di allergie alimentari, in quanto può rilevare anche quantità minime di costituenti allergenici in prodotti alimentari complessi come arachidi, latte, grano e uova²². A questo proposito, è stato anche segnalato come uno strumento prezioso per la valutazione dell'allergenicità degli allergeni degli alimenti animali, come le tropomiosine, e può aiutare a distinguere i potenti allergeni dagli anallergici²³. Come strumento di ricerca, il test viene utilizzato per studiare l'impatto della lavorazione degli alimenti e per valutare l'influenza del legame del ligando agli allergeni e il suo effetto sull'allergenicità^24,25. Ad esempio, il legame di Bet v 1 ai ligandi ha dimostrato di non influenzare il cross-linking allergene-IgE, sebbene abbia causato un aumento della sua stabilità termica e proteolitica²⁵. Il test può essere utilizzato per confrontare la reattività del paziente con allergeni minori e maggiori, nonché per studiare la cross-reattività degli omologhi e delle isoforme allergeniche, come mostrato nel nostro esempio utilizzando Bet v 1 e l'allergene alimentare omologo Cor a 1 (Figura 3). Per quanto riguarda le isoforme allergeniche, il test di rilascio del mediatore è stato utilizzato per identificare il principale allergene Amb a 1,01 come la più potente isoforma IgE-reattiva nel polline di ambrosia (Ambrosia artemisiifolia). In confronto, le altre due isoforme identificate negli estratti di polline di ambrosia, Amb a 1,02 e Amb a 1,03, hanno mostrato una ridotta reattività alle IgE²⁶dei pazienti.

Negli ultimi anni, il test è stato applicato per studiare potenziali composti antiallergici e nuove varianti ipoallergeniche di allergeni, aiutando nell'identificazione di candidati idonei per l'immunoterapia allergene-specifica^27,28. Un altro nuovo approccio consiste nell'utilizzare il test per monitorare l'efficacia del trattamento nel corso dell'immunoterapia allergene-specifica. A questo proposito, il nostro gruppo di ricerca ha sviluppato un sistema di inibizione del test huRBL, che si correla bene con la riduzione del punteggio dei sintomi del paziente durante l'immunoterapia allergene-specifica²⁹. Il test è stato anche proposto per studiare gli effetti immunosoppressivi del TGFβ1 sulla degranulazione³⁰mediata da IgE indotta da allergeni.

I limiti del test sono che anche se le cellule huRBL possiedono alcune caratteristiche dei mastociti o dei basofili, non imitano completamente la funzione naturale di queste cellule estazionali. Ad esempio, i mastociti esprimono ampiamente il recettore di riconoscimento del pattern Toll-like receptor 4 (TLR4), necessario per il riconoscimento dei patogeni, mentre è completamente carente nelle cellule RBL-2H3³¹. A causa di questa differenza di funzionalità, il test non imita completamente la situazione della vita reale, che deve essere tenuta a mente quando si interpretano i dati. Inoltre, poiché le cellule huRBL sono cellule basofile cancerose, i cambiamenti nelle condizioni di coltura e la coltivazione prolungata possono portare a differenze fenotipiche che portano a risultati alterati tra i diversi laboratori²⁰. Un altro aspetto è la scelta della concentrazione di allergeni che deve essere presa in considerazione quando si adatta questo metodo poiché alte concentrazioni di allergeni potrebbero causare una degranulazione non mediata da IgE a causa della presenza di elevate quantità di proteasi o endotossine¹⁸. Altre limitazioni sono la dipendenza dai sieri umani con livelli di IgE specifici relativamente elevati (classe RAST 5-6) e la necessità di sistemi di coltura cellulare, che rimane un ostacolo che deve essere superato per implementare la tecnica nella routine clinica quotidiana.

Oltre a queste limitazioni, il test huRBL rappresenta un prezioso strumento di ricerca per la diagnosi e il trattamento delle malattie allergiche e può essere utilizzato in una vasta gamma di applicazioni.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide	Sigma	M2133
96-well plate for huRBL cells (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, flat-bottom microplate)	ThermoFisher Scientific	167008
96-well plate for substrate solution and cell supernatant (Greiner Bio-One non-treated 96-well microplates)	Fisher Scientific	655101
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	10735078001
Citric acid	Applichem	131018
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS without calcium and magnesium)	Sigma	D8537
G418	Sigma	A1720
Glycine	Applichem	A3707
Heat-inactivated fetal calf/bovine serum (FCSi)	Sigma	F0804
L-Glutamine (200 mM)	Sigma	G7513
Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, with ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma	M8042
Opti-MEM reduced serum medium, GlutaMAX supplement	Gibco/ThermoFisher Scientific	51985034
Penicillin-Streptomycin (10K units Pen.  10 mg/mL Strep.)	Sigma	P4333
Sodium chloride (NaCl)	Applichem	A2942
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Applichem	131638
Triton X-100	Sigma	X100
Trypsin-EDTA	Sigma	59418C
Tyrode’s salt	Sigma	T2145