Reconstitution et caractérisation de composites actine-microtubule avec dynamique et mécanique induites par moteur accordable

Résumé

Cet article présente des protocoles pour l’ingénierie et la caractérisation de réseaux composites tridimensionnels accordables de filaments d’actine et de microtubules co-intriqués. Les composites subissent une restructuration active et un mouvement balistique, entraînés par des moteurs de myosine II et de kinésine, et sont réglés par les concentrations relatives d’actine, de microtubules, de protéines motrices et de réticulations passives.

Résumé

Le cytosquelette composite, comprenant des réseaux en interaction de filaments d’actine semi-flexibles et de microtubules rigides, se restructure et génère des forces en utilisant des protéines motrices telles que la myosine II et la kinésine pour piloter des processus clés tels que la migration, la cytokinèse, l’adhésion et la mécanodétection. Bien que les interactions actine-microtubule soient essentielles à la polyvalence et à l’adaptabilité du cytosquelette, la compréhension de leur interaction avec l’activité de la myosine et de la kinésine en est encore à ses balbutiements. Ce travail décrit comment concevoir des réseaux composites tridimensionnels accordables de filaments d’actine et de microtubules co-enchevêtrés qui subissent une restructuration active et un mouvement balistique, entraînés par des moteurs de myosine II et de kinésine, et sont réglés par les concentrations relatives d’actine, de microtubules, de protéines motrices et de réticulations passives. Les protocoles de marquage par fluorescence des microtubules et des filaments d’actine pour visualiser plus efficacement la restructuration et le mouvement des composites à l’aide de l’imagerie confocale multispectrale sont également détaillés. Enfin, les résultats des méthodes d’analyse de données qui peuvent être utilisées pour caractériser quantitativement la structure, la dynamique et la mécanique hors équilibre sont présentés. Recréer et étudier cette plate-forme biomimétique accordable fournit des informations précieuses sur la façon dont l’activité motrice couplée, la mécanique composite et la dynamique du filament peuvent conduire à une myriade de processus cellulaires allant de la mitose à la polarisation en passant par la mécano-sensation.

Introduction

Le cytosquelette est un réseau composite dynamique de biopolymères en interaction qui fournit un soutien structurel et mécanique aux cellules. Les moteurs moléculaires associés et les protéines de liaison restructurent et adaptent le cytosquelette pour permettre aux cellules de croître, de changer de forme, de se raidir, de se déplacer et même de s’auto-guérir, permettant une myriade de processus cellulaires allant de la migration et de la division à la mécanodétection ^1,2. Au-delà de son importance en biophysique cellulaire, le cytosquelette est également un exemple par excellence de matière active avec des applications potentielles de matériaux allant de la cicatrisation des plaies et de l’administration de médicaments à la filtration et à la robotique douce 1,3,4,5,6,7,8,9.

Les deux caractéristiques clés qui confèrent au cytosquelette sa diversité structurelle et mécanique unique et sa multifonctionnalité sont: 1) sa nature composite, comprenant de multiples filaments de protéines en interaction, tels que des filaments d’actine semi-flexibles et des microtubules rigides, ainsi que leurs protéines de liaison et de réticulation^{associées 3,5,10}; et 2) sa capacité à restructurer, déplacer, grossir et effectuer des travaux en continu via des moteurs consommateurs d’énergie, tels que les myosines et les kinésines, poussant et tirant sur les protéines filamenteuses 1,7,11,12,13. Bien que cette élégante complexité permette au cytosquelette de servir de médiateur à des processus aussi divers que la motilité cellulaire, la cytocinèse et la cicatrisation des plaies 3,6,7,11^, elle entrave la capacité des chercheurs à reproduire les caractéristiques in vivo du cytosquelette dans des systèmes in vitro reconstitués.

Les efforts actuels de reconstitution des frontières se concentrent sur les composites de filaments d’actine et de microtubules 3,10,14,15,16,17, les réseaux d’actomyosine générateurs de force 2,8,18,19,20,21 et la nématique active pilotée par la kinésine-microtubule Interactions 22,23,24,25,26. Il a été démontré que les composites actine-microtubule à l’état d’équilibre présentent des propriétés mécaniques émergentes^15,16,27, telles qu’une mobilité accrue du filament et une rigidité accrue par rapport aux systèmes à composant unique ²⁷. Des études sur les systèmes d’actomyosine in vitro ont rapporté un large éventail de propriétés structurelles et dynamiques qui dépendent des concentrations d’actine, de myosine et de réticulants 28,29,30,31. Par exemple, avec une réticulation suffisante, les réseaux d’actomyosine subissent une contraction à grande échelle et un grossissement 2,28,30,32,33,34,35,36, alors que sans réticulation, les réseaux présentent un flux rapide et déstabilisant et se rompent ^19,29 . Il a été signalé que les nematiques actives reconstituées à base de microtubules qui utilisent des grappes de moteurs kinésine pour réticuler et tirer sur les faisceaux de microtubules présentent des écoulements turbulents de longue durée, une extension, un flambage, une fracturation et une cicatrisation 12,22,23,24,25,37,38,39,40,41^, 42,43,44,45,46,47.

Plus récemment, il a été démontré que les composites actine-microtubule entraînés par des mini-filaments de myosine II conduisent à une contraction plus ordonnée et à une intégrité du réseau par rapport au flux désordonné et à la rupture du réseau que les réseaux d’actomyosine sans réticulateurs présentent 17,26,48. De plus, la combinaison de la robustesse du composite et de la génération de force est optimisée lorsque l’actine et les microtubules sont présents à des concentrations comparables. Les principales caractéristiques émergentes dans cette région de l’espace de formulation comprennent une résistance mécanique accrue 26, un mouvement coordonné de l’actine et des microtubules²⁶, une contraction soutenue constante et une restructuration à mésoéchelle¹⁷.

Ici, des protocoles sont décrits pour concevoir et ajuster des composites co-enchevêtrés et réticulés de microtubules et de filaments d’actine qui sont poussés hors de l’équilibre par les mini-filaments de myosine II et les grappes de kinésine agissant respectivement sur les filaments d’actine et les microtubules (Figure 1). La dynamique, la structure et la mécanique de cette classe de composites peuvent être ajustées par les concentrations relatives des filaments, des moteurs et des agents de réticulation pour présenter un riche espace de phase d’écoulement advectif et turbulent, de contraction isotrope, d’accélération, de décélération, de démélange, de raidissement, de relaxation et de rupture. L’objectif de ce travail est de préparer et de régler cette classe de composites cytosquelettiques actifs. Cependant, pour aider les chercheurs à comparer et à caractériser les composites actifs décrits, des méthodes d’imagerie efficaces utilisant la microscopie confocale multispectrale sont également détaillées. Enfin, les résultats des principales méthodes d’analyse computationnelle pouvant être utilisées pour mesurer la dynamique, la structure et la mécanique des composites sont présentés. Les chercheurs sont encouragés à adopter ces méthodes, qui comprennent la microscopie dynamique différentielle (DDM), l’autocorrélation spatiale des images (SIA) et la vélocimétrie par image de particules (PIV), car elles ont été optimisées pour caractériser la dynamique complexe et la diversité structurelle des composites 17,26,49.

Les étapes décrites ci-dessous se concentrent sur la préparation des composites et leur imagerie à l’aide de la microscopie confocale. Des protocoles décrivant l’analyse des données post-acquisition et les mesures de pincettes optiques peuvent être trouvés dans les travaux précédents 17,26,48,50^, et fournis sur demande. Tous les matériaux sont énumérés dans le tableau des matériaux fourni.

Protocole

1. Préparer des lames de couverture silanisées et des lames de microscope pour empêcher l’adsorption des protéines sur les surfaces de la chambre

REMARQUE: Il s’agit d’un processus de 2 jours. Les lames silanisées peuvent être préparées jusqu’à 1 mois avant utilisation.

1. Placez les lames de couverture no 1 (24 mm x 24 mm) et les lames de microscope (1 po x 3 po) dans un support désigné qui s’adaptera au nettoyeur plasma. Placer la grille dans un nettoyeur plasma et faire fonctionner pendant 20 min.
2. Transférer les lames de couverture et les glissières dans un nouveau support conçu uniquement pour une utilisation avec du silane et placer le support dans un récipient en verre pour nettoyer les verres comme décrit ci-dessous.
   1. Immergez les lames de couverture et les lames dans 100% acétone pendant 1 h. Immerger les lames de couverture et les glissières dans de l’éthanol à 100% pendant 10 min.
   2. Immerger les lames de couverture et les lames dans de l’eau désionisée (DI) pendant 5 min. Répétez les étapes de nettoyage deux fois de plus.
   3. Immergez les lames de couverture et les diapositives dans 0,1 M KOH fraîchement préparé pendant 15 min. Immergez les lames de couverture et les diapositives dans un DI frais pendant 5 min. Répétez cette étape deux fois de plus.
3. Sécher à l’air libre les lames de couverture et les toboggans pendant 10 min. Traiter les lames de couverture et les lames nettoyées avec du silane pour produire des surfaces hydrophobes comme décrit ci-dessous.
   REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes dans une hotte.
   1. Plonger les lames de couverture séchées et les lames dans du silane à 2 % (dissous dans du toluène) pendant 5 min. Utilisez un entonnoir pour verser du silane dans sa bouteille désignée pour le réutiliser jusqu’à cinq fois.
   2. Immerger les lames de couverture et les glissières dans de l’éthanol à 100% pendant 5 min. Remplacez l’éthanol par de l’éthanol frais. Immergez les lames de couverture et les diapositives pendant 5 min.
   3. Immergez les lames de couverture et les diapositives dans un DI frais pendant 5 min. Répétez l’étape de lavage à l’éthanol et à l’AI deux fois de plus en utilisant de l’éthanol frais et du DI à chaque fois. Sécher à l’air libre les lames de couverture et les toboggans pendant 10 min.

2. Préparation d’un composite actine-microtubule actif entraîné par des mini-filaments de myosine

1. Éliminer la myosine inactive via la liaison du filament d’actine et effectuer le pull-down par ultracentrifugation comme décrit ci-dessous.
   1. Polymériser l’actine en filaments. À l’aide d’une micropipette de précision et d’embouts de pipettes stériles, combiner dans un tube microcentrifuge : 1,87 μL de DI, 1,3 μL de 10x G-buffer, 1,3 μL de 10x F-buffer, 1,63 μL de 4 M KCl, 4,53 μL d’actine (47,6 μM) et 1,08 μL de phalloïdine 100 μM.
      NOTE: Pour assurer une polymérisation suffisante, la concentration d’actine et le rapport molaire actine:phalloïdine doivent être de 18,4 μM et 2:1, respectivement.
   2. Verser doucement la solution de haut en bas pour la mélanger, puis laisser reposer sur la glace dans l’obscurité pendant ≥1 h. Refroidir l’ultracentrifugeuse à 4 °C. Retirer la partie aliquote de la myosine à -80 °C et la mettre sur de la glace.
      REMARQUE: Terminez l’étape 2.2 à ce stade pendant que l’actine polymérise.
   3. Après ≥1 h de polymérisation de l’actine, ajouter 1,3 μL d’ATP 10 mM et 2 μL de myosine 19 μM à l’actine polymérisée.
      REMARQUE : Le rapport molaire actine/myosine doit être de >5 pour assurer une élimination suffisante des moteurs de myosine inactifs (c.-à-d. les têtes mortes).
   4. Verser doucement la solution de haut en bas pour mélanger. Transférer dans un tube de qualité ultracentrifugeuse.
      Centrifuger à 4 °C et 121 968 x g pendant 30 min.
2. Préparer un réseau composite co-intriqué de filaments d’actine et de microtubules comme décrit ci-dessous.
   REMARQUE : Commencer 30 minutes avant la rotation de la myosine (étape 2.1.4).
   1. Réglez un bloc de chaleur à 37 °C. Utilisez une micropipette de précision et des embouts de pipette stériles pour ajouter ce qui suit à un tube microcentrifuge : 13,9 μL de PEM, 3 μL de Tween20 à 1 %, 1,55 μL d’actine 47,6 μM, 0,36 μL de 34,8 μM de R-actine, 0,3 μL d’ATP 250 mM, 0,87 μL de phalloïdine 100 μM, 1,91 μL de 5-488-tubuline, 0,3 μL de 100 mM GTP, et 0,75 μL de 200 μM de Taxol, pour un volume total de 23 μL.
      NOTA : Les concentrations d’actine et de tubuline indiquées sont pour un composite avec 2,9 μM d’actine et 2,9 μM de tubuline. La concentration totale en protéines est c = c A + c T = 5,8 μM et la fraction molaire d’actine est c A/(c A + c_T) = Φ _A = 0,5. Voir l’étape 2.5 pour ajuster ces valeurs.
   2. Verser doucement la solution de haut en bas pour la mélanger et la placer sur un bloc de chaleur à 37 °C à l’abri de la lumière pendant 1 h.
3. Préparer des chambres d’échantillonnage pour les expériences d’imagerie confocale décrites ci-dessous.
   REMARQUE : Effectuez les étapes 2.1.4 et 2.2.2 pendant les périodes d’attente.
   1. Placez deux lames silanisées côte à côte sur une plaque chauffante (éteinte), posez deux bandes de film d’étanchéité thermoplastique sur les lames à ~3 mm l’une de l’autre et placez deux lamelles de couverture silanisées sur le film d’étanchéité thermoplastique pour former une chambre d’échantillonnage.
   2. Tournez la plaque chauffante à faible réglage jusqu’à ce que les lamelles de recouvrement se lient fermement aux lames avec un film d’étanchéité thermoplastique fondu (~1-2 min). Appuyez avec une pression uniforme pour assurer la liaison tout en maintenant un espacement de ~100 μm entre les deux surfaces.
   3. Retirez les chambres et éteignez la plaque chauffante. Chambres d’étiquetage avec (+) et (-). La chambre (+) sera pour l’échantillon actif (avec la myosine) et la chambre (-) sera le témoin (pas de myosine). Assurez-vous que chaque chambre peut contenir ≤10 μL de liquide.
4. Préparez des échantillons à imager comme décrit ci-dessous.
   Remarque : Il est important de terminer cette étape immédiatement après les étapes 2.1 et 2.2 sont terminées.
   1. Retirer délicatement l’échantillon de myosine-actine de l’ultracentrifugeuse (étape 2.1.4) et remonter immédiatement les 7,5 μL supérieurs du surnageant et transférer dans un nouveau tube microcentrifugeux.
   2. Retirer l’échantillon d’actine-microtubule du bloc thermique et mélanger délicatement 1,5 μL de 10x D-glucose, 1,5 μL de 10x GOC et 1,5 μL de 1 mM de blébbistatine. Diviser la solution en deux aliquotes de 13,7 μL et étiqueter comme (+) et (-).
   3. Incorporer 1,28 μL du surnageant de l’étape 2.4.1 à (+) aliquote. Incorporer 1,28 μL de DI à l’aliquote (-). Écouler lentement chaque solution dans la chambre correspondante (étape 2.3) par capillarité. Veillez à ne pas introduire de bulles d’air dans le canal.
   4. Scellez les deux extrémités ouvertes de chaque canal avec de la colle époxy ou UV à séchage rapide. Assurez-vous que l’adhésif est complètement sec avant de le placer sur le microscope. Image immédiatement comme décrit à l’étape 3.
      REMARQUE: La colle UV est avantageuse car elle durcit presque instantanément lors de l’exposition aux UV. Cependant, comme la blébbistatine est sensible aux UV, il est important de n’éclairer la colle que localement (sur les bords de la chambre d’échantillonnage) à l’aide d’une petite baguette UV pour éviter de désactiver la blebbistatine.
5. Facultatif : faites varier les concentrations en protéines pour ajuster la dynamique et la structure des composites.
   REMARQUE: Les étapes suivantes sont suggérées des modifications aux étapes ci-dessus pour faire varier les concentrations d’actine, de microtubules et de myosine si vous le souhaitez.
   1. Suivez les étapes décrites ci-dessus, à l’exception des modifications suivantes aux étapes 2.2.1 et 2.4.3.
   2. Pour faire varier les concentrations d’actine et de microtubules, ajustant ainsi c et Φ_A, augmenter ou diminuer le volume d’actine, de R-actine et de 5-488-tubuline utilisés à l’étape 2.2.1, comme souhaité²⁶. Lorsque vous faites varier la concentration d’actine, ajuster les concentrations molaires de R-actine et de phalloïdine proportionnellement pour maintenir les mêmes rapports molaires que l’actine. Ajuster le volume de PEM de telle sorte que le volume final du mélange reste de 23 μL. Tous les autres volumes et concentrations de composants restent les mêmes.
   3. Pour faire varier la concentration en myosine, ajuster le volume de myosine ajouté à la partie aliquote (+) à l’étape 2.4.3 comme souhaité. Ajustez le volume d’ID ajouté à la (-) aliquote en conséquence. Ajustez le volume de PEM à l’étape 2.2.1 pour tenir compte de l’augmentation ou de la diminution du volume de myosine (+) et de DI (-), en veillant à ce que le volume final de chaque échantillon ((+) et (-)) soit de 14,98 μL.

3. Imagerie et caractérisation de composites actifs par microscopie confocale

1. Pour imager les composites actomyosine-microtubule préparés à l’étape 2, utilisez un microscope confocal à balayage laser (LSCM) ou un microscope similaire, avec un objectif d’immersion dans l’huile 60x 1,4 NA. Pour visualiser simultanément les filaments d’actine et les microtubules dans des canaux de fluorescence séparés, utilisez un laser de 561 nm avec des filtres d’excitation/émission de 565/591 nm et un laser de 488 nm avec des filtres d’excitation/émission de 488/525 nm.
2. Placez la chambre d’échantillonnage sur le microscope de manière à ce que le canal de contrôle soit positionné directement au-dessus de l’objectif. Assurez-vous qu’il y a une interface d’huile entre l’objectif et la lamelle de couverture.
3. Utilisez les commandes de scène pour mettre au point le composite de commande, puis trouvez les deux surfaces de la chambre d’échantillonnage. Déplacez la position z vers le centre de la chambre d’échantillonnage. Vérifiez la présence de réseaux filamenteux transparents comme illustré à la figure 2.
4. Toujours en visualisant la chambre de contrôle, ajustez l’intensité de chaque laser pour permettre la visualisation simultanée des filaments d’actine et des microtubules. Maintenir l’intensité laser la plus faible possible pour prévenir le photoblanchiment (plus répandu dans le canal d’actine) et le saignement (généralement des microtubules dans le canal d’actine).
5. Pour caractériser l’échantillon de contrôle inactif, collectez trois séries chronologiques (vidéos) d’images de 256 x 256 pixels carrés (213 μm x 213 μm) à 2,65 ips pour un total de ≥ 1000 images. Prélever chaque série chronologique dans une région différente de la chambre d’échantillonnage, séparée par ≥ 500 μm. Assurez-vous qu’il y a un minimum de mouvement détectable et qu’il n’y a pas de flux ou de restructuration.
6. Déclenchez le laser 488 nm et utilisez les commandes de la scène pour vous déplacer vers la chambre (+).
7. À l’aide du laser 568 nm, visualiser les microtubules dans le canal (+) pour assurer la bonne formation du réseau (Figure 2) et identifier le centre axial de la chambre d’échantillonnage (qui peut être différent de la position z centrale de la chambre de contrôle).
8. Allumez le laser 488 nm et répétez l’étape 3.5 ci-dessus avec les modifications suivantes. Recueillir des séries chronologiques jusqu’à 45 minutes, en arrêtant l’acquisition lorsque l’échantillon sort du champ de vision, se rompt ou se blesse photo. Notez 5 à 10 séries chronologiques et gardez une trace de l’heure à laquelle chaque série chronologique commence par rapport au début de la première série chronologique.
9. Analysez les données à l’aide de DDM, SIA et PIV comme décrit dans la Figure 3, la Figure 4, la Figure 5 et précédemment^17,48,50,51.
   REMARQUE: Le laser de 488 nm active localement l’activité de la myosine ATPase en désactivant la blébbistatine, il ne doit donc être activé qu’au début de l’acquisition des données de sorte que t = 0 soit au début de la série chronologique. Ces paramètres d’acquisition sont optimisés pour l’analyse en microscopie dynamique différentielle (DDM) comme cela a été fait précédemment²⁶.

4. Préparation de composites actine-microtubule actifs entraînés par des moteurs kinésine

REMARQUE: Les étapes suivantes créent des composites actine-microtubule qui sont entraînés hors de l’équilibre par des moteurs kinésine ou une combinaison de kinésine et de myosine⁵⁰.

1. Préparez les moteurs kinésine et myosine comme décrit ci-dessous.
   1. Si vous incorporez de la myosine, suivez l’étape 2.1.
   2. Pour former des grappes de moteurs kinésines qui se lient et exercent des forces entre des paires de microtubules, utilisez une micropipette et des pointes de pipettes stériles pour ajouter ce qui suit à un tube microcentrifuge stérile de 1,5 mL : 1,16 μL PEM, 2,74 μL 8,87 μM dimères de kinésine, 7,29 μL 83,3 μM NeutrAvidine, 0,81 μL 2mM DTT. Mélanger délicatement en pipetant la solution de haut en bas et incuber à l’abri de la lumière (utiliser un tube à microcentrifuger noir ou envelopper dans du papier d’aluminium) pendant 30 min à 4 °C.
      NOTE: Le rapport molaire des dimères kinésine à NA est de 1:25.
2. Suivez l’étape 2.3 pour préparer les chambres d’échantillonnage et faire trois chambres au lieu de deux. Réaliser cette étape lors de l’incubation de la kinésine (étape 4.1.2) et de l’ultracentrifugation de la myosine (étape 4.1.1).
3. Préparer un réseau composite co-enchevêtré de filaments d’actine et de microtubules.
   1. Régler le bloc de chaleur à 37 °C. Utilisez une micropipette et des embouts de pipette stériles pour ajouter ce qui suit à un tube microcentrifuge stérile de 1,5 mL : 3,21 μL de PEM, 4,5 μL de Tween20 à 1 %, 2,18 μL d’actine 47,6 μM, 3,46 μL de 5-R-tubuline, 4,5 μL d’ATP 100 mM, 4,5 μL de GTP 10 mM, 1,13 μL de 200 μM de Taxol et 1,57 μL de 20 μM de 488-phalloïdine. Assurez-vous que le volume total est de 25 μL.
   2. Verser doucement la solution de haut en bas pour la mélanger et la placer sur le bloc de chaleur à 37 °C à l’abri de la lumière pendant 1 h. Retirez le tube du bloc de chaleur et utilisez une micropipette pour mélanger doucement 0,84 μL de phalloïdine 100 μM. Incuber pendant 5-10 min à température ambiante, à l’abri de la lumière.
      REMARQUE: L’ajout de phalloïdine à cette étape, plutôt qu’à l’étape 4.3.1, améliore le marquage de fluorescence des filaments d’actine, car la 488-phalloïdine n’a pas à entrer en compétition avec la phalloïdine non marquée pour les sites de liaison à l’actine.
4. Préparer les composites actifs pour l’imagerie confocale.
   1. Ajouter 1,13 μL de blébbistatine 200 μM, 1,35 μL de 10x Glu et 1,35 μL de GOC 10x à la solution de l’étape 4.3.2 et mélanger doucement en pipetant de haut en bas. Diviser la solution en trois aliquotes de 10 μL et étiqueter comme (K), (K+M) et (-).
   2. Incorporer 2,54 μL de myosine de l’étape 2.1.4 à l’aliquote (K+M). Incorporer 2,54 μL de PEM aux (K) et (-) aliquotes.
   3. Utilisez une micropipette et des embouts de pipettes stériles pour ajouter 2,5 μL de grappes de kinésine de l’étape 4.1.2 aux aliquotes (K) et (K+M). Tuyler de haut en bas pour mélanger. Incorporer 2,5 μL de PEM à (-) en utilisant la même technique.
      NOTA : Les concentrations d’actine et de tubuline indiquées sont pour un composite avec 2,32 μM d’actine et 3,48 μM de tubuline. La concentration totale en protéines est c = c A + c T = 5,8 μM et la fraction molaire d’actine est c A/(c A + c_T) = Φ _A = 0,4. Les concentrations de kinésine et de myosine sont respectivement de 0,35 μM et 0,47 μM. Voir l’étape 2.5 pour des directives générales pour ajuster c A, c_T, c et Φ_A.
   4. À l’aide d’une micropipette, faire couler lentement chaque solution dans le canal correspondant des chambres d’échantillonnage préparées (étape 4.2) par capillarité. Poussez très lentement et doucement sur la pipette afin de ne pas introduire de bulles d’air dans le canal.
   5. Scellez les deux extrémités ouvertes de chaque canal avec de la colle époxy ou UV à séchage rapide. Assurez-vous que l’adhésif est complètement sec avant de le placer sur le microscope.
      REMARQUE: Il est important que cette étape soit effectuée rapidement pour minimiser le temps pendant lequel la kinésine agit sans être surveillée. Pour cette raison, l’époxy qui durcit en 1 min (plutôt que 5 ou 10 min) est recommandé. La colle durcissable aux UV est avantageuse à cet égard, car elle durcit presque instantanément en cas d’exposition aux UV.
5. Échantillons préparés par l’image immédiatement, après l’étape 3, à l’exception des modifications importantes suivantes. Parce que la kinésine n’est pas contrôlée par l’activation de la lumière, elle commence à fonctionner immédiatement après l’étape 4.4.3, alors marquez cette fois comme t = 0. Pour imager le composite aussi près que possible de l’état inactif initial (t = 0), imagez d’abord les canaux (K) et (K+M) et notez le temps écoulé entre l’étape 4.4.3 et le début de l’acquisition des données (étape 3.8). En pratique, ce temps écoulé est de ~5 min.

5. Incorporation de réticulants passifs dans des composites actifs

REMARQUE : Ces étapes décrivent comment utiliser les sous-unités biotinylées d’actine et de tubuline et la NeutrAvidine (NA) pour réticuler passivement l’actine à l’actine (A-A) ou les microtubules aux microtubules (M-M) dans les composites actifs décrits à l’étape 4.

1. Préparer des complexes de réticulation A-A ou M-M avec des protéines biotinylées (biotine-actine ou biotine-tubuline), NA et biotine à un rapport de 2:2:1 biotine-actine/tubuline:biotine:NA. Démarrez ce processus avant l’étape 4.
   1. Pour les agents de réticulation A-A, utilisez une micropipette et des embouts de pipette stériles pour ajouter 2 μL de biotine-actine de 11,6 μM, 1,39 μL de NA de 8,33 μM, 2,27 μL de biotine de 1,02 μM et 4,34 μL de PEM à un tube de microcentrifugeuse. Mélanger doucement en pipetant de haut en bas.
   2. Pour les agents de réticulation M-M, utilisez une micropipette et des pointes de pipette stériles pour ajouter 1,86 μL de biotine-tubuline de 4,55 μM, 1,11 μL de 8,33 μM NA, 1,82 μL de biotine de 1,02 μM et 5,21 μL de PEM à un tube microcentrifugeux. Mélanger doucement en pipetant de haut en bas.
   3. Envelopper le(s) tube(s) des étapes 5.1.1 et/ou 5.1.2 dans un film d’étanchéité thermoplastique pour créer un joint étanche. Placer dans un radeau de flottaison dans un bain de sonicateur à température contrôlée réglé à 4 °C.
   4. Sonifier pendant 90 min à 4 °C. En pratique, il est préférable de mettre le sonicateur dans une chambre froide et d’ajouter des sacs de glace au bain de sonication pour maintenir une température basse.
2. Pour incorporer des complexes de réticulation dans des échantillons pour l’imagerie, suivez l’étape 4.3, en modifiant l’étape 4.3.1 comme décrit ci-dessous pour la réticulation A-A (étape 5.2.1) ou la réticulation M-M (étape 5.2.2).
   1. Pour la réticulation A-A, combiner les éléments suivants dans un tube microcentrifugé : 1,94 μL de PEM, 4,50 μL de Tween20 à 1 %, 2,18 μL d’actine 47,6 μM, 3,46 μL de 45,5 μM de 5-R-tubuline, 1,13 μL de réticulateurs A-A (étape 5.1.1), 4,50 μL d’ATP 100 mM, 4,50 μL de GTP 10 mM, 1,13 μL de Taxol 200 μM, et 1,57 μL de 488-phalloïdine 20 μM. Assurez-vous que le volume total est de 25 μL.
   2. Pour la réticulation M-M, combiner les éléments suivants dans un tube microcentrifuge : 1,97 μL de PEM, 4,50 μL de Tween20 à 1 %, 2,18 μL d’actine 47,6 μM, 3,76 μL de 45,5 μM de 5-R-tubuline, 1,13 μL de dilution 1:4 de réticulants M-M (étape 5.1.2), 4,50 μL d’ATP 100 mM, 4,50 μL de GTP 10 mM, 1,13 μL de 200 μM de Taxol, et 1,57 μL de 488-phalloïdine 20 μM. Assurez-vous que le volume total est de 25 μL.
3. Suivez les étapes 4.3.2-4.5 avec les concentrations spécifiques pour un rapport molaire réticulant:actine de R_A = 0,02 et un rapport molaire réticulateur:tubuline de R_T = 0,005. Ces valeurs R A et_R T donnent des longueurs similaires entre les agents de réticulation le long des filaments d’actine et des microtubules (d A 60 nm et d MT 67 nm), estimées en utilisant d A = I monomère/2R _A, où I monomère est la longueur d’un_monomère d’actine, et d_MT = I_cycle/26R_T, où I anneau est la longueur d’un_anneau de 13 tubulines ^{15, 17}.

Résultats

Pour déterminer la préparation réussie des composites actifs (Figure 1) et caractériser leur dynamique et leur structure, un microscope à fluorescence à balayage laser avec au moins deux canaux de fluorescence est utilisé pour visualiser simultanément les filaments d’actine et les microtubules (Figure 2 et Figure 6). Tous les filaments d’actine et les microtubules dans les composites sont peu marqués, plutôt que le dopage dans les filaments brillants traceurs, comme cela se fait souvent dans les études in vitro. Cette méthode garantit que la dynamique et la structure mesurées sont représentatives du composite lui-même plutôt que des traceurs qui sont formés dans des conditions différentes de celles des composites. Pour cette raison, les filaments d’actine et les microtubules individuels ne peuvent généralement pas être résolus, mais plutôt les images représentent la structure du réseau à mésoéchelle (Figure 2 et Figure 6).

Cette approche de marquage a été optimisée pour les analyses d’autocorrélation d’images spatiales (SIA) et de microscopie dynamique différentielle (DDM) qui examinent la dynamique et la structure dans l’espace de Fourier réciproque (Figure 4, Figure 5 et Figure 8)^52,53,54,55. La vélocimétrie particule-image (PIV) peut également être utilisée pour décrire et caractériser la dynamique et les champs d’écoulement (Figure 3 et Figure 7), mais elle nécessite un regroupement de pixels (résolution spatiale inférieure) et des incréments de temps de latence plus importants (résolution temporelle inférieure) que SIA et DDM pour éliminer les vecteurs erronés qui résultent du bruit dans les images denses à faible signal. Néanmoins, la PIV est recommandée pour l’examen qualitatif des champs d’écoulement et la corroboration des résultats du DDM (Figure 4 et Figure 8)^26,50.

La caractérisation des échantillons des réseaux décrits à l’aide de ces analyses (c.-à-d. DDM, SIA, PIV) est fournie pour aider les chercheurs à adopter des analyses similaires pour comparer et caractériser leurs échantillons. Cependant, les descriptions détaillées de ces techniques ne font pas partie de la portée de ce travail. Pour des descriptions détaillées de la façon d’effectuer DDM sur ces systèmes et d’autres systèmes similaires, y compris le code Python convivial, reportez-vous aux travaux précédents 17,26,49,50 et aux références qu’ils contiennent. Pour plus de détails sur la façon d’effectuer SIA et PIV sur les systèmes décrits ici, le lecteur est dirigé vers les travaux précédents^17,50.

Plusieurs contrôles, décrits ci-dessous, doivent être effectués pour s’assurer que les composites fonctionnent comme prévu. Un composite sans myosine ni kinésine doit apparaître essentiellement statique avec un minimum de fluctuations thermiques ou de dérive. Les filaments d’actine et les microtubules doivent apparaître co-enchevêtrés et répartis de manière homogène, avec un minimum de groupage, d’agrégation ou de séparation de phase de l’actine et des microtubules dans un champ de vision de ~200 μm x 200 μm (figure 2, à l’extrême gauche)¹⁷. Il faut s’attendre à un résultat similaire pour les composites qui contiennent de la myosine mais qui ne sont pas exposés à une lumière de 488 nm (pour désactiver la blébbistatine).

Lors de l’incorporation de la myosine et de l’exposition à une lumière de 488 nm, les composites subissent une contraction largement isotrope et similaire pour l’actine et les microtubules, comme on le voit sur les images au microscope prises avant et après l’activité de la myosine (Figure 2), ainsi que les champs d’écoulement PIV correspondants pour différents moments de l’activité (Figure 3). Pour déterminer si le mouvement est balistique, diffusif, sous-diffusif, etc., le temps de décorrélation caractéristique τ(q) déterminé à partir de DDM est évalué en fonction du vecteur d’onde (c’est-à-dire l’espace réciproque). Voir comme décrit en détail précédemment 17,26,49. La figure 4 montre également comment utiliser DDM pour caractériser ces composites. La mise à l’échelle de la loi de puissance τ(q)~1/vq β, avec^β = 1, indique un mouvement balistique avec la vitesse v. Pour référence, β = 2 représente la dynamique diffusive, v étant le coefficient de diffusion. Tous les composites actifs présentent une échelle balistique (figure 4A) avec des vitesses qui sont réglées par les concentrations d’actine et de myosine (figure 4B), et qui peuvent varier dans le temps au cours de l’activité, accélérant ou décélérant (figure 4C,D).

La restructuration et le regroupement du réseau, visibles sur la figure 2 et plus évidents pour des concentrations plus élevées d’actine et de myosine, peuvent être caractérisés à l’aide de SIA, comme illustré à la figure 5, et décrit précédemment 17,48,50. En bref, une longueur de corrélation ξ, qui est une mesure de la taille caractéristique des caractéristiques d’une image, peut être déterminée en ajustant chaque courbe d’autocorrélation d’intensité spatiale g(r) à une fonction exponentielle de distance r entre pixels. Des pics g(r) plus grands qui persistent sur de plus longues distances indiquent des caractéristiques structurelles plus importantes (c.-à-d. groupage, regroupement des filaments individuels). Comme le montre la figure 5, pour des fractions d’actine et des concentrations de myosine plus élevées, une restructuration et une agrégation significatives se reflètent dans l’augmentation de ξ au fil du temps.

Les propriétés viscoélastiques et la réponse mécanique non linéaire des composites actifs peuvent également être mesurées à l’aide de la microrhéologie des pinces optiques (OTM). Cependant, les protocoles et les résultats représentatifs de ces expériences ne font pas partie du cadre de ce travail. Les lecteurs intéressés sont invités à se référer aux travaux précédents^48,56 qui décrivent en détail comment effectuer des mesures OTM et les résultats attendus.

En utilisant le même programme d’outils expérimentaux et d’analyse décrit ci-dessus, la section suivante décrit comment la dynamique et la structure changent lorsque des moteurs kinésine et des agents de réticulation biotine-NA sont incorporés dans les composites (Figure 6, Figure 7 et Figure 8). La figure 6 montre des images confocales représentatives de composites pilotés par kinésine seule (K) ou kinésine et myosine (K+M), avec et sans réticulation passive (XL) de filaments d’actine ou de microtubules.

L’incorporation de kinésine dans les composites entraîne initialement une dynamique et une restructuration similaires à celles des composites à base de myosine, comme le montre la rangée supérieure de la figure 7 (classe 1). Cependant, la dynamique passe généralement à un écoulement anisotrope à grande échelle (figure 7 rangée du milieu, classe 2), à l’accélération et à la décélération (figure 7 rangée inférieure, classe 3). Ces caractéristiques se couplent avec le regroupement et l’agrégation à mésoéchelle après 5-30 min (Figure 6 et Figure 8B). Les champs d’écoulement générés par PIV et les cartes de couleurs temporelles illustrées à la figure 7 illustrent des exemples de restructuration isotrope (classe 1, panneau supérieur), d’écoulement dirigé (classe 2, panneaux du milieu) et d’accélération bidirectionnelle (classe 3, panneaux inférieurs).

Les vitesses de l’actine et des microtubules à différents moments de l’activité, déterminées par ajustement aux courbes τ(q), illustrent l’accélération suivie d’une décélération (figure 8), qui dépend de la réticulation. Comme le montre également la figure 8, lorsque les deux protéines motrices sont incorporées, la dynamique est en fait plus lente que les composites de kinésine seule, et il y a un début retardé de l’écoulement à mésoéchelle. La myosine favorise également une interpénétration plus homogène des réseaux d’actine et de microtubules pendant toute la durée de l’activité, ainsi qu’une agrégation et une restructuration moindres. Ces effets peuvent être observés dans les images de la figure 6 et sont quantifiés par les longueurs de corrélation variables dans le temps calculées via SIA, qui sont généralement plus petites en présence de myosine (Figure 8B).

Graphique 1. Conception et caractérisation de composites actine-microtubule actifs avec plusieurs moteurs générateurs de force et agents de réticulation passifs. (A) Les monomères d’actine et les dimères de tubuline sont copolymérisés à des concentrations molaires c A et c T de 0,73-11,6 μM et des fractions molaires d’actine Φ A= c _A/ (c _A+ c _T) = 0, 0,25, 0,5, 0,75 et 1, pour former des réseaux co-enchevêtrés de filaments d’actine (vert) et de microtubules (rouge). La réticulation passive est réalisée en utilisant NA pour lier des filaments d’actine biotinylés (Actine XL) ou des microtubules (MT XL) à des rapports molaires réticulation:protéines de R _A = 0,01-0,08 et R_MT = 0,001-0,01 pour l’actine et les microtubules, respectivement. Les mini-filaments de myosine-II (violet) et les grappes de kinésine (orange), à des concentrations de c M = 0,12 - 0,48 _μM et c_K = 0,2 - 0,7 μM, poussent et tirent sur les filaments pour sortir les composites de l’état d’équilibre. (B) Schéma de l’espace de formulation. Les mini-filaments de myosine II (M), les grappes de kinésine (K) ou les deux moteurs (K + M) sont incorporés dans des composites sans réticulation passive (No XL), des liaisons croisées actine-actine (Actin XL) et des réticulations microtubule-microtubule (MT XL). Tous les dessins animés ne sont pas dessinés à l’échelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 2. Imagerie confocale bicolore de composites de cytosquelette induits par la myosine avec des concentrations variables de myosine c_M et d’actine molaire Φ_A. (A) 256 x 128 pixels carrés (212 x 106 μm²) images de microscopie confocale bicolore montrent comment les composites de filaments d’actine (vert) et de microtubules (rouge) sont réarrangés par l’activité motrice de la myosine. Aucun moteur kinesin ou réticulant passif n’est présent. Dans chaque panneau, des images prises au début (à gauche, avant) et à la fin (à droite, après) de l’activation de la myosine de 45 min (via un éclairage avec une lumière de 488 nm pour désactiver la blébbistatine) sont montrées. Les panneaux sont ordonnés en augmentant la concentration molaire de myosine (c_M), allant de gauche à droite, et en augmentant la fraction molaire d’actine (Φ_A), allant de haut en bas. Les couleurs qui décrivent chaque panneau correspondent au code couleur utilisé dans la Figure 4 et la Figure 5. Les barres d’échelle sont de 50 μM. Pour capturer au mieux la dynamique et la structure pour l’analyse, nous utilisons des fréquences d’images de 1 à 5 ips, des ROI de 50 à 250 μm de côtés et des durées de séries chronologiques de 5 à 45 min, en fonction du taux de contraction et de réarrangement. Les panneaux dans lesquels les images avant et après se ressemblent indiquent une restructuration minimale, comme on le voit dans les panneaux rose, magenta et cyan. Le regroupement à petite échelle, mis en évidence par une hétérogénéité accrue et la présence de caractéristiques ponctuées brillantes, peut être vu dans les panneaux orange, vert et rouge. La contraction à grande échelle, considérée comme un réseau qui se rétrécit uniformément, est évidente dans les panneaux bleus et violets. Ce chiffre a été modifié par rapport à la référence¹⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 3. La vélocimétrie par image de particules (PIV) montre que l’activité de l’actomyosine déclenche une dynamique contractile coordonnée de l’actine et des microtubules dans des composites co-enchevêtrés. Champs d’écoulement PIV pour l’actine (rangée du haut) et les microtubules (rangée du bas) dans un composite piloté par la myosine avec (Φ_A, c_M) = (0,5, 0,24) à des temps croissants au cours d’une série chronologique de 6 minutes. Les champs de flux ont été générés à l’aide du plug-in Fiji/ImageJ PIV avec un temps de latence de 20 s et un binning de 2 pixels x 2 pixels. L’actine et les microtubules montrent un mouvement constant dirigé vers la région centrale du champ de vision tout au long de la durée du film. Les barres d’échelle dans toutes les images sont de 50 μm. Différentes couleurs de flèche correspondent à différentes vitesses comme indiqué dans l’échelle de couleurs à droite des champs vectoriels. Ce chiffre a été modifié par rapport à la référence²⁶. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 4. La microscopie dynamique différentielle à résolution temporelle (DDM) mesure la vitesse et le type de mouvement de l’actine et des microtubules dans les composites actifs. (A) La DDM est effectuée sur les canaux microtubules (symboles ouverts, supérieurs) et actine (symboles remplis du bas) des séries chronologiques afin de déterminer les temps de désintégration caractéristiques τ par rapport au nombre d’onde q pour l’actine (symboles remplis) et les microtubules (symboles ouverts) comme décrit précédemment^17,26. Toutes les courbes suivent τ ~ q-1 mise à l’échelle, indiquant un mouvement balistique, avec des vitesses v qui sont déterminées par des ajustements à τ(q) = (vq)^-1. Des vitesses plus rapides correspondent à des valeurs τ(q) plus petites pour un q donné. Les couleurs et les formes des symboles correspondent aux combinaisons (Φ A, c_M) indiquées en B. (B) Les vitesses de contraction v sont déterminées par ajustement aux courbes τ(q) indiquées dans _A, qui sont moyennées sur tous les temps de latence pour la durée de chaque série chronologique de 45 minutes. (C) Le DDM résolu dans le temps (trDDM) quantifie la façon dont la dynamique varie au fil du temps en évaluant τ(q) pour l’actine (symboles remplis, à gauche) et les microtubules (symboles ouverts, à droite) pour des intervalles consécutifs de 6 minutes (désignés par différentes nuances de la même couleur) pendant le temps d’activation de 45 minutes. trDDM est effectué pour chaque combinaison (Φ_A, c_M) (désignée par différents symboles et couleurs) comme décrit dans la légende en bas à droite. Les courbes τ(q) montrées en C suivent une échelle et des tendances similaires à celles de A, mais montrent également une dépendance temporelle pour certaines compositions (Φ A, c_M), notamment pour Φ _A = 0,75. (D) Les vitesses de contraction des filaments d’actine (symboles fermés) et des microtubules (symboles ouverts) sont déterminées à partir des ajustements aux courbes τ(q) correspondantes. Les barres d’erreur dans tous les graphiques représentent l’erreur type des valeurs sur trois à cinq réplications. Ce chiffre a été modifié par rapport à la référence¹⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 5. L’analyse d’autocorrélation d’images spatiales (SIA) quantifie la restructuration motrice des composites cytosquelettiques actifs. (A) Autocorrélation g(r) pour les microtubules au début (à gauche, t = 0 min, nuances foncées) et à la fin (à droite, t = 42 min, nuances claires) de l’expérience pour les formulations (Φ_A, c_M) énumérées dans la légende. Encart : exemple d’ajustement des données aux heures initiale et finale pour (Φ_A, c_M) = (0,75, 0,12). (B) Longueurs moyennes de corrélation ξ pour l’actine (symboles fermés) et les microtubules (symboles ouverts) pour chaque (Φ A, c_M) déterminées par ajustements exponentiels de chaque courbe g(r), comme indiqué dans l’encart de _A. Les données sont divisées en celles qui présentent une restructuration minimale (à gauche) et une restructuration substantielle (à droite). Les barres d’erreur dans A et B représentent l’erreur type sur trois à cinq répétitions. Ce chiffre a été modifié par rapport à la référence¹⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 6. Incorporer des moteurs kinésine et des réticulateurs passifs dans des composites actifs pour augmenter la programmabilité et élargir l’espace de phase de la dynamique et de la structure. (A) Les images confocales bicolores de l’actine (vert) et des microtubules (rouge) dans les composites actifs montrent une restructuration complexe dépendante de la formulation au fil du temps (indiquée en min). Les cinq images de chaque rangée correspondent à cinq images d’une série chronologique de 2000 images acquises pour un composite piloté par kinesine (K, lignes 1, 3, 5) ou kinésine et myosine (K+M, lignes 2, 4, 6), et comprenant soit aucun agent de réticulation passif (No XL, lignes 1, 2), de réticulation actine-actine (Actine XL, lignes 3, 4), soit des liaisons croisées microtubule-microtubule (MT XL, lignes 5 et 6). Les barres d’échelle sont toutes de 50 μm. Les couleurs du contour correspondent au jeu de couleurs de la figure 8. (B) Des canaux de fluorescence séparés de l’actine et des microtubules pour les composites à base de kinésine seule montrent des structures variées avec à la fois la colocalisation actine-MT et la séparation des microphases. Les images présentées concernent des composites avec c A = 2,32 μM, c _T = 3,48 μM, c _K = 0,35 μM, c M = 0,47 _μM (rangées 2, 4, 6), R _A = 0,02 (rangées 3, 4) et R_MT = 0,005 (lignes 5, 6). Tous les composites commencent par des réseaux interpénétrants uniformément répartis d’actine et de microtubules (colonne 1). Les composites pilotés par kinésine sans réticulation (ligne 1) forment des amas amorphes faiblement connectés qui sont riches en MT. L’actine co-localise d’abord dans les centres de ces agrégats, mais est ensuite évincée des régions riches en MT qui continuent à se contracter et à se déconnecter les unes des autres. La réticulation actine-actine (ligne 3) entrave cette séparation actine-MT à l’échelle microscopique, et à la place les agrégats riches en MT sont connectés via de longs brins d’actine. La réticulation de l’actine permet également une absorption lente de l’actine dans les régions riches en MT, de sorte que le composite devient un réseau connecté d’actine et de grappes MT colocalisées. La réticulation des microtubules (rangée 5) conduit à un regroupement amorphe de MT qui fusionnent au fil du temps, ce qui entraîne une séparation de phase à plus grande échelle de l’actine et des MT. L’ajout de myosine (rangées 2, 4, 6) réduit le démélange et la restructuration induits par la kinésine. Sans réticulation (ligne 2), les composites montrent peu de réarrangement au fil des heures. La réticulation augmente la restructuration et la colocalisation de l’actine et des microtubules (lignes 4, 6). Plus précisément, lorsque les microtubules sont réticulés (ligne 6), il y a une interpénétration et une réorganisation importantes en réseaux de fibres de type toile. Ce chiffre a été modifié par rapport à la référence⁵⁰. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 7. PIV montre que les composites actifs présentent trois classes de champs d’écoulement spatio-temporellement distincts. (A) Champs d’écoulement PIV pour les première (t _i) et dernière (t_f) trames de trois séries chronologiques représentatives, montrant les différentes classes dynamiques que présentent les composites illustrés à la figure 6. Champs d’écoulement PIV pour les microtubules (en haut) et l’actine (en bas) pour les exemples de vidéos de classe 1 (haut, violet), de classe 2 (milieu, orange) et de classe 3 (bas, magenta), avec les couleurs des flèches correspondant à l’échelle de vitesse universelle en bas et la carte de couleurs en niveaux de gris montrant la distribution spatiale de la vitesse, normalisée séparément pour chaque champ d’écoulement selon l’échelle indiquée en bas. Les barres d’échelle sont toutes de 50 μM. (B) Distributions angulaires des vecteurs vitesse de A (en unités de radians) avec les écarts-types initiaux et finaux énumérés σ _i et σ_f. (C) Les cartes de couleurs temporelles pour les vidéos analysées dans A et B montrent la position image par image de chaque pixel par rapport à son point de départ. Les cartes de classe 1 montrent des mouvements aléatoires à petite échelle; Les cartes de classe 2 représentent un mouvement unidirectionnel rapide avec une variation spatiale ou temporelle minimale; Les cartes de classe 3 présentent des caractéristiques des classes 1 et 2. Ce chiffre a été modifié par rapport à la référence⁵⁰. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 8. DDM et SIA mesurent la dynamique et la structure variables dans le temps des composites actine-microtubule à deux moteurs. (A) Les vitesses des composites décrites aux figures 6 et 7, mesurées par DDM, montrent l’accélération et la décélération des composites, programmées par réticulation et activité de la myosine. Les vitesses des microtubules (MT, cercles fermés) et de l’actine (A, cercles ouverts) sont tracées en fonction du temps d’activité dans les composites sans réticulation (haut, bleu), la réticulation d’actine (milieu, vert), la réticulation des microtubules (bas, rouge), sans myosine (K, nuances plus foncées) et avec la myosine (K+M, nuances plus claires). Pour les cas de classe 3, qui ont deux vitesses, la vitesse la plus lente est indiquée par une étoile. Les points de données entourés de cercles noirs pointillés correspondent à la vitesse maximale v_maxpour chaque formulation. Les barres d’erreur (la plupart trop petites pour être vues) sont l’erreur type sur les ajustements de la loi de puissance du τ(q) correspondant. (B) Longueurs de corrélation structurelle ξ, déterminées par SIA, en fonction du temps d’activité, pour le même ensemble de séries chronologiques évaluées en A. Chaque point de données est une moyenne des longueurs de corrélation déterminées pour la première et la dernière trame de la série chronologique correspondante. En général, ξ augmente dans le temps pour l’actine et les microtubules dans tous les systèmes composites, et les composites pilotés uniquement par la kinésine ont des longueurs de corrélation plus grandes que ceux dans lesquels la myosine est également présente. Les points de données de A et B qui correspondent aux trois séries chronologiques analysées à la figure 7 sont encerclés dans la couleur de classe correspondante (1 = violet, 2 = orange, 3 = magenta). Ce chiffre a été modifié par rapport à la référence⁵⁰. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Une avancée clé du système reconstitué décrit ci-dessus est sa modularité et son accordabilité, de sorte que les utilisateurs sont encouragés à modifier les concentrations de protéines, moteurs, réticulants, etc. pour les adapter aux résultats souhaités, qu’il s’agisse d’émuler un processus cellulaire particulier ou de concevoir un matériau avec des fonctionnalités ou des propriétés mécaniques spécifiques. Les limites de la plage de concentration de l’actine et de la tubuline sont fixées à la limite inférieure par la concentration critique nécessaire pour polymériser l’actine (~0,2 μM)^57,58,59 et la tubuline (~3 - 4 μM)60, et à la limite supérieure par le passage à l’alignement nématique des filaments d’actine (~90 μM)^61,62 ou des microtubules (~35 μM)⁶³ . Les monomères d’actine et les dimères de tubuline devraient être polymérisés en filaments ensemble, plutôt que mélangés ensemble après polymérisation, afin de s’assurer qu’ils forment des réseaux percolés interpénétrants homogènes qui se soutiennent mutuellement en synergie. La nouvelle dynamique des composites repose sur cette interaction. Bien qu’il soit généralement important de suivre toutes les étapes décrites dans le protocole pour reproduire avec succès les résultats présentés, certaines étapes sont plus exigeantes, tandis que d’autres ont la possibilité de les modifier et de s’ajuster pour répondre aux besoins spécifiques et aux ressources disponibles.

Par exemple, une étape importante pour assurer des résultats reproductibles consiste à préparer et à stocker correctement les réactifs conformément aux directives fournies dans le tableau des matériaux. Les protéines du cytosquelette (actine, tubuline, myosine, kinésine) sont labiles et doivent être aliquotes, surgelées avec de l’azote liquide et stockées à -80 °C dans des aliquotes à usage unique. Une fois retirées de -80 °C, les aliquotes doivent être conservées sur la glace. Les protéines du cytosquelette ne conservent pas leur fonction de manière fiable après des cycles supplémentaires de gel-dégel.

Les microtubules sont plus sensibles à la dépolymérisation et à la dénaturation que l’actine. Une fois retirée de -80 °C, la tubuline doit être conservée sur glace avant la polymérisation et utilisée dans les 12 heures. Une fois polymérisés, les microtubules doivent être conservés à température ambiante. Il est également essentiel de stabiliser les microtubules avec du taxol pour empêcher la dépolymérisation. La stabilisation phalloïdine des filaments d’actine est également importante pour supprimer le tapis roulant d’actine consommant de l’ATP qui rivalise avec l’activité de la myosine et de la kinésine.

L’ultracentrifugation des moteurs de myosine est une autre étape critique, car elle élimine les têtes mortes inactives de la myosine. Ne pas éliminer les monomères enzymatiquement inactifs entraîne une réticulation passive du réseau d’actine et une perte d’activité. Pour prolonger l’activité ATPase des moteurs, un système de régénération ATP tel que le phosphate de créatine et la créatine phosphokinase⁶⁴ peut être incorporé.

Enfin, le maintien de l’activité composite nécessite d’inhiber l’adsorption des filaments et des moteurs sur les parois de la chambre d’échantillonnage, ce qui peut être réalisé par passivation des lames de couverture et des lames du microscope. Les protéines motrices sont particulièrement sujettes à l’adsorption, ce qui entraîne l’extraction du composite à la surface de la chambre d’échantillonnage, la sortie du champ de vision, l’effondrement en 2D et l’activité suivante. La sylanisation des lamelles et des glissières est un moyen efficace de passiver les surfaces et d’empêcher l’adsorption (voir étape 1). Une méthode alternative de passivation utilisée efficacement dans les expériences in vitro sur le cytosquelette consiste à recouvrir la surface d’une bicouche lipidique, similaire à la membrane cellulaire¹⁸. Cette méthode est avantageuse si l’on souhaite attacher des protéines à la surface ou introduire d’autres interactions protéine-surface spécifiques, car la bicouche peut être fonctionnalisée. Pour les expériences de pinces optiques, la passivation des microsphères est également critique et peut être obtenue en recouvrant les microsphères carboxylées de BSA ou de PEG via la chimie de réticulation^{carbodiimide 48}.

Il y a quelques aspects des protocoles présentés que les chercheurs peuvent envisager de modifier pour répondre à leurs besoins. Tout d’abord, les chercheurs peuvent choisir de remplacer les agents de réticulation biotine-NA non natifs par des agents de réticulation biologiques, tels que l’alpha-actinine ou MAP65 qui réticulent l’actine et les microtubules, respectivement 28,65,66. L’utilisation de réticulations non natives dans les composites décrits ici est motivée par leur reproductibilité, leur stabilité et leur accordabilité améliorées par rapport aux réticulations natives. En raison de la forte liaison biotine-NA, on peut supposer que les agents de réticulation sont permanents, plutôt que la plupart des réticulateurs natifs qui se lient transitoirement avec des taux de rotation très variés. La dynamique de la réticulation transitoire complique l’analyse des contributions des agents de réticulation et des moteurs à la dynamique. De plus, les agents de liaison biotine-NA peuvent être utilisés de manière polyvalente pour réticuler à la fois l’actine et les microtubules, ainsi que pour réticuler l’actine aux microtubules. De cette façon, une comparaison sans ambiguïté entre les motifs de réticulation peut être faite, en gardant toutes les autres variables (par exemple, la taille de la réticulation, l’affinité de liaison, la stœchiométrie, etc.) fixes. Enfin, les réactifs nécessaires pour incorporer les liants biotine-NA sont largement disponibles dans le commerce, bien caractérisés et couramment utilisés dans de nombreux laboratoires de biophysique. Cependant, l’une des principales forces de la plateforme in vitro décrite ici est sa modularité, de sorte que les chercheurs devraient être en mesure de remplacer de manière transparente les agents de liaison biotine-NA par des agents de liaison natifs s’ils le souhaitent.

Deuxièmement, dans le protocole actuel, les monomères d’actine et les dimères de tubuline sont polymérisés en filaments ensemble dans un tube centrifuge avant d’être ajoutés à la chambre d’échantillonnage. L’écoulement de la solution de protéines filamenteuses intriquées dans la chambre d’échantillonnage peut provoquer un alignement de l’écoulement, en particulier des microtubules, ce qui rompt l’isotropie et l’homogénéité souhaitées des composites. En effet, une avancée majeure dans les travaux antérieurs sur les composites actine-microtubule à l’état d’équilibre a été la capacité de copolymériser l’actine et les microtubules in situ (dans la chambre d’échantillonnage) pour assurer la formation de réseaux interpénétrants isotropes d’actine et de microtubules^15,16,27. Cependant, l’extension de cette approche aux composites actifs nécessiterait d’ajouter les moteurs à l’échantillon avant la polymérisation de l’actine et de la tubuline et de faire incuber l’ensemble de l’échantillon à 37 °C avant les expériences. Les tests de cette variation du protocole ont entraîné une polymérisation réduite de l’actine et aucune activité motrice perceptible, probablement en raison de l’activité concurrente de l’ATPase et de l’incubation prolongée des moteurs à 37 °C. Heureusement, il n’y a pas d’alignement perceptible des flux composites lorsque l’on suit les protocoles actuels, comme on peut le voir à la figure 2, à la figure 3 et à la figure 6. Néanmoins, les chercheurs sont encouragés à concevoir des protocoles qui permettent la formation in situ de composites actifs.

Un autre point à considérer est le système d’étiquetage de fluorescence, qui implique un marquage clairsemé de tous les filaments d’actine et microtubules du réseau. Cette approche d’étiquetage a été optimisée pour visualiser directement la structure du réseau plutôt que d’en déduire la structure et la dynamique via des filaments traceurs ou des microsphères. Cependant, le compromis est que les filaments individuels ne sont pas clairement étiquetés et résolvables. Une approche que les chercheurs pourraient adopter à la fois pour résoudre des filaments simples et visualiser la structure du réseau consiste à doper des filaments préformés marqués avec un autre fluorophore, de sorte que le réseau environnant et les filaments individuels puissent être imagés simultanément. Cependant, lors de l’utilisation de plus de deux fluorophores et canaux d’excitation / émission, le saignement entre les canaux est souvent difficile à éliminer, il faut donc faire attention au choix des fluorophores, des filtres et des intensités laser.

Une limitation connexe est l’incapacité de visualiser les moteurs de myosine ou de kinésine dans les composites. Les monomères d’actine marqués par fluorescence et les dimères de tubuline utilisés sont disponibles dans le commerce, tandis que la visualisation de la myosine ou de la kinésine dans les composites nécessite un étiquetage interne. Les chercheurs sont encouragés à passer à l’étape suivante pour étiqueter les moteurs, comme cela a été fait précédemment^18,67, afin de pouvoir lier sans équivoque l’activité motrice et la liaison à la dynamique et aux structures que nos composites présentent.

Enfin, il est important de noter que, dans le protocole actuel, le début et la durée de l’activité de la kinésine ne sont pas contrôlés. Parce que l’activité de la myosine est contrôlée en utilisant la photo-désactivation de la blébbistatine, comme décrit ci-dessus, pour intégrer une activation lumineuse similaire de la kinésine, on peut incorporer de l’ATP activé par la lumière.

Pour renforcer la complexité des conceptions décrites ici, pour mieux imiter les conditions cellulaires et élargir l’espace des paramètres dynamique-structure-fonction, les travaux futurs se concentreront sur l’incorporation de filaments intermédiaires, tels que la vimentine^68,69, ainsi que d’autres moteurs tels que la dynéine^13,70. La gelsoline sera également incorporée à différentes concentrations pour contrôler la longueur^{d’actine 14}, ainsi que la protéine tau pour contrôler la rigidité des microtubules.

En résumé, les protocoles présentés décrivent comment concevoir, créer et caractériser la dynamique, la structure et la mécanique des systèmes de matière active inspirés du cytosquelette, qui contiennent deux composants distincts générateurs de force active qui agissent sur différents substrats dans un seul système. Cette plate-forme accordable et modulaire rapproche les efforts de reconstitution de l’imitation du cytosquelette cellulaire et offre la capacité unique de programmer ses propriétés sur un large espace de phase en incorporant, en supprimant et en ajustant indépendamment les différents composants. De plus, tous les composants de ce système polyvalent sont disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux), à l’exception des dimères de kinésine qui sont purifiés dans le laboratoire Ross, comme décrit précédemment⁵⁰, et disponibles sur demande. Enfin, tout le code d’analyse est disponible gratuitement via GitHub⁴⁹ et est basé sur des langages de programmation et des logiciels libres (Python et Fidji). La diffusion transparente des protocoles de conception de ces systèmes permettra, espérons-le, de rendre cette plate-forme plus accessible à un groupe diversifié d’utilisateurs ayant une expertise, des antécédents, des affiliations institutionnelles et des objectifs de recherche différents.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
(-)-Blebbistatin  Abbreviation used in paper: blebbistatin	Sigma Aldrich	B0560	Stock Concentration: 200 μM in DMSO Storage: dessicated, in DMSO, -20ºC Stock and Experiment Recipes: dissolve 1 mg of powder to 200 μM in DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: limited shelf-life, typically stops functioning reliably after 3-4 months. purchase and prepare new solution every 3 months.
1:20 488-tubulin:tubulin mixture  Abbreviation used in paper: 5-488-tubulin	NA	NA	Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and 488-tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light
1:20 R-tubulin:tubulin mixture  Abbreviation used in paper: 5-R-tubulin	NA	NA	Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and rhodamine tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light
actin (biotin): skeletal muscle  Abbreviation used in paper: biotin-actin	Cytoskeleton	AB07	Stock Concentration: 1 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: (1) immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM, (2) once removed from -80ºC, store  aliquot on ice at 4ºC for up to 1 week
actin (rhodamine): rabbit skeletal muscle  Abbreviation used in paper: R-actin	Cytoskeleton	AR05	Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store  aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week
adenosine triphosphate  Abbreviation used in paper: ATP	Thermo Fisher Scientific	A1048	Stock Concentration: 100 mM Storage: in solution (pH 7), -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconsitute in DI H20, bring pH to 7 with NaOH Storage, Handling, Troubleshooting Notes: routinely check pH and adjust as needed, hydrolyzes over time, replace every ~6-12 months
AlexaFluor488 Phalloidin  Abbreviation used in paper: 488-phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Stock Concentration: 100 μM DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 20 μM in PEM (1 μL in 4 μL PEM)
AlexaFluor488–labeled actin  Abbreviation used in paper: 488-actin	Thermo Fisher Scientific	A12373	Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: this item has been discontinued
Basic Plasma Cleaner  Abbreviation used in paper: plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film  Abbreviation used in paper: transparent film	Thermo Fisher Scientific	13-374-5
D-(+)-Glucose  Abbreviation used in paper:	Thermo Fisher Scientific	A1682836	Stock Concentration: 100x Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 4.5 mg/ml in DI H20 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should 45 μg/mL
D-Biotin  Abbreviation used in paper: biotin	Fisher Scientific	BP232-1	Stock Concentration: 1.02 mM in PEM Storage: dessicated, 4ºC
deionized nanopure water  Abbreviation used in paper: DI
Dimethyldichlorosilane  Abbreviation used in paper: silane	Thermo Fisher Scientific	D/3820/PB05	Stock Concentration: 2% dissolved in Toulene
Dithiothreitol  Abbreviation used in paper: DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861	Stock Concentration: 1 M in DMSO Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: dilute to 2 mM in PEM immediately before each experiment
DMSO Anhydrous  Abbreviation used in paper: DMSO	Thermo Fisher Scientific	D12345
F-Buffer  Abbreviation used in paper: F-buffer	NA	NA	Stock Concentration: 10x Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: 10 mM Imidazole (pH 7.0), 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.2 mM ATP
G-Buffer  Abbreviation used in paper: G-buffer	NA	NA	Stock Concentration: 10x Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: 2.0 mM Tris (pH 8), 0.2 mM ATP, 0.5 mM DTT, 0.1 mM CaCl2. Store at -20°C.
glass microscope slide  Abbreviation used in paper: slide	Thermo Fisher Scientific	22-310397
Glucose oxidase + catalase + β-mercaptoethanol  Abbreviation used in paper: GOC	Sigma Aldrich	G2133-250KU, C1345, 63689	Stock Concentration: 100x Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC Stock and Experiment Recipes: For 100x: 4.3 mg/ml glucose oxidase, 0.7 mg/ml catalase, 0.5% v/v  β-mercaptoethanol in DI H20 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should be: 0.005% β-mercaptoethanol, 43 μg/mL glucose oxidase, 7 μg/mL catalase
glu-GOC oxygen scavenging system  Abbreviation used in paper: glu-GOC	NA	NA	Stock Concentration: 100x Storage: prepare fresh each time Stock and Experiment Recipes: mix equal parts Glu and GOC and add at 1/100 final sample volume immediately before imaging Storage, Handling, Troubleshooting Notes: prepare from Glu and GOC immediately before imaging
Guanosine triphosphate  Abbreviation used in paper: GTP	Thermo Fisher Scientific	R0461	Stock Concentration: 100 mM Storage: 100 μL aliquots at -20ºC
Instant Mix 1-minute epoxy  Abbreviation used in paper: epoxy	Loctite	1366072
Kinesin-1 401 BIO 6x HIS  Abbreviation used in paper: kinesin	Prepared in JL Ross Lab at Syracuse University	NA	Stock Concentration: 8.87 μM in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Storage, Handling, Troubleshooting Notes: biotinylated dimers form kinesin clusters, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC
NeutrAvidin  Abbreviation used in paper: NA	Thermo Fisher Scientific	31000	Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM
No 1. glass coverslips (24 mm x 24 mm)  Abbreviation used in paper: coverslip	Thermo Fisher Scientific	12-548-CP
Paclitaxel   Abbreviation used in paper: Taxol	Thermo Fisher Scientific	P3456	Stock Concentration: 2 mM in DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 200 μM in DMSO (0.4 μL in 3.6 μL DMSO)
PEM-100  Abbreviation used in paper: PEM	NA	NA	Stock Concentration: 1x Storage: room temperature (RT) Stock and Experiment Recipes: 100 mM K-PIPES (pH 6.8), 2 mM EGTA, 2 mM MgCl2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: use KOH to adjust pH to 6.8, recheck pH often and adjust accordingly
phalloidin Abbreviation used in paper: phalloidin	Thermo Fisher Scientific	P3457	Stock Concentration: 100 μM in DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC, adhere closely to storage/handling conditions Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: susceptible to impurities in its preparation and denaturing, identifiable as large amorphous aggregates of actin in samples
porcine brain tubulin  Abbreviation used in paper: tubulin	Cytoskeleton	T240	Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC
Potassium Chloride  Abbreviation used in paper: KCl	Thermo Fisher Scientific	AM9640G	Stock Concentration: 4 M Storage: RT
Rabbit skeletal actin  Abbreviation used in paper: actin	Cytoskeleton	AKL99	Stock Concentration: 2 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store  aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week
Rabbit skeletal myosin II  Abbreviation used in paper: myosin	Cytoskeleton	MY02	Stock Concentration: 10 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 10 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: monomers form minifilaments at low KCl, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC
Tubulin (biotin): porcine brain  Abbreviation used in paper: biotin-tubulin	Cytoskeleton	T333P	Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM
Tubulin (fluorescent HiLyte 488): porcine brain  Abbreviation used in paper: 488-tubulin	Cytoskeleton	TL488M	Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light
tubulin (rhodamine): porcine brain  Abbreviation used in paper: R-tubulin	Cytoskeleton	TL590M	Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light
Tween 20  Abbreviation used in paper: Tween20	Thermo Fisher Scientific	J20605.AP	Stock Concentration: 1% v/v in DI H20 Storage: RT
ultracentrifuge grade microtubes  Abbreviation used in paper: Beckman-Coulter Optima Max XP	Beckman Coultier	343776	Storage, Handling, Troubleshooting Notes: 8x34 mm PC
UV light curing glue  Abbreviation used in paper: UV glue	Pharda	SKG-2869