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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole fournit des instructions pour déclencher et surveiller la pexophagie médiée par Stub1 dans les cellules vivantes.

Résumé

Les cellules de mammifères peuvent retourner les peroxysomes par pexophagie médiée par Stub1. La voie permet potentiellement le contrôle cellulaire de la quantité et de la qualité des peroxysomes. Au cours de ce processus, la protéine de choc thermique 70 et l’ubiquitine E3 ligase, Stub1, se transloquent sur les peroxysomes pour être retournés pour initier la pexophagie. L’activité de la ligase Stub1 permet l’accumulation d’ubiquitine et d’autres modules liés à l’autophagie sur des peroxysomes ciblés. L’élévation des niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans la lumière peroxysomale peut activer la pexophagie médiée par Stub1. On peut donc utiliser la génération de ROS assistée par colorant pour déclencher et surveiller cette voie. Cet article décrit les procédures d’utilisation de deux classes de colorants, les protéines fluorescentes et les fluorophores synthétiques, pour initier la pexophagie dans les cultures de cellules de mammifères. Ces protocoles basés sur la génération de ROS assistés par colorant peuvent non seulement être utilisés pour cibler tous les peroxysomes au sein d’une population cellulaire à l’échelle mondiale, mais peuvent également permettre la manipulation de peroxysomes individuels dans des cellules individuelles. Nous décrivons également comment la pexophagie médiée par Stub1 peut être suivie à l’aide de la microscopie à cellules vivantes.

Introduction

Les peroxysomes sont des organites à membrane unique présents dans la plupart des cellules eucaryotes. Les peroxysomes sont un compartiment métabolique essentiel pour effectuer la bêta-oxydation des acides gras à très longue chaîne, le catabolisme purique, et la synthèse des phospholipides éthers et des acides biliaires1. L’acétyl-CoA dérivé du peroxysome contrôle l’homéostasie lipidique en régulant la signalisation centrale dans le métabolisme2. Par conséquent, il n’est pas surprenant que des fonctions peroxysomiques compromises soient impliquées dans diverses maladies, notamment les troubles neurodégénératifs, le vieillissement, les cancers, l’obésité et le diabète 3,4,5. Un processus essentiel dans le maintien du fonctionnement peroxysomal est la pexophagie. La pexophagie est un processus catabolique pour le renouvellement sélectif des peroxysomes par autophagie. Les cellules utilisent la pexophagie pour aider à contrôler la quantité et la qualité des peroxysomes, assurant ainsi une fonction peroxysomale appropriée. Une étude récente a démontré que la perte de peroxysomes causée par des mutations des facteurs de biogenèse peroxysomale PEX1 1 et 6 résulte d’une pexophagie6 non contrôlée. Notamment, 65% de tous les patients atteints de trouble de biogenèse des peroxysomes (PBD) présentent des déficiences dans le complexe peroxysomal AAA ATPase, composé de PEX1, PEX6 et PEX26 dans les cellules de mammifères7.

Un certain nombre de méthodes peuvent être utilisées pour initier et étudier la pexophagie. Chez la levure, la pexophagie est déclenchée lorsque les nutriments fournis passent de sources de carbone dépendantes des peroxysomes à des sources de carbone indépendantes des peroxysomes (pour réduire le nombre de peroxysomes cellulaires)8. Par exemple, le transfert de cellules de Pichia pastoris cultivées au méthanol du milieu méthanol au milieu glucose et au milieu éthanol induit respectivement la micropexophagie et la macropexophagie, respectivement 8,9,10. La micropexophagie séquestre les peroxysomes regroupés pour les dégrader en remodelant la vacuole pour former des membranes de séquestration vacuolaire en forme de coupe et une structure en forme de couvercle appelée appareil membranaire spécifique à la micropexophagie (MIPA). Dans la macropexophagie, les peroxysomes individuels sont engloutis par des structures à double membrane appelées pexophagosomes, suivies d’une fusion avec la vacuole pour la dégradation 8,9,10. La phosphorylation des récepteurs de pexophagie, tels que Atg36p chez Saccharomyces cerevisiae et Atg30p chez Pichia pastoris, est essentielle pour que les récepteurs recrutent la machinerie autophagie centrale et facilitent le ciblage peroxysomal des autophagosomes 8,11.

Dans les cellules de mammifères, la pexophagie peut être induite par ubiquitination. Le marquage des protéines membranaires peroxysomiques PMP34 ou PEX3 avec de l’ubiquitine du côté cytosolique induit la pexophagie12. La surexpression de PEX3 induit l’ubiquitination des peroxysomes et l’élimination des peroxysomes par les lysosomes13. De plus, la fusion de PEX5 avec un EGFP C-terminal nuit à l’exportation de PEX5 monoubiquitiné et aboutit à la pexophagie14. D’autre part, la pexophagie peut également être déclenchée par un traitement H2O2. Les peroxysomes produisent des espèces réactives de l’oxygène (ROS); plus précisément, l’enzyme peroxysomale Acox1, qui catalyse l’étape initiale de la bêta-oxydation des acides gras à très longue chaîne (carbone > 22), produit non seulement de l’acétyl-CoA mais aussi des ROS peroxysomaux. En réponse aux niveaux accrus de ROS sous traitement H2O2, les cellules de mammifères activent la pexophagie pour réduire la production de ROS et atténuer le stress. Il a été rapporté que le traitementH2O2entraîne le recrutement de l’ataxie-télangiectasie mutée (ATM) en peroxysomes. ATM phosphoryle ensuite PEX5 pour favoriser le renouvellement peroxysomal par pexophagie15.

Étant donné que les peroxysomes sont des centres générateurs de ROS, ils sont également sujets aux dommages causés par les ROS. Les lésions peroxysomiques provoquées par les ROS forcent les cellules à activer la pexophagie pour initier des voies de contrôle de la qualité des peroxysomes (élimination du peroxysome endommagé par autophagie). Ici, nous décrivons une approche pour le déclenchement à la demande de lésions peroxysomiques provoquées par les ROS. Le protocole tire parti de la production de ROS activées par la lumière dans les organites 16,17,18,19,20 (Figure 1). Les peroxysomes marqués au colorant sont éclairés, ce qui entraîne la production de ROS dans la lumière peroxysomale, ce qui déclenche spécifiquement des lésions peroxysomales. En utilisant ce protocole, il est démontré que les peroxysomes soumis à un stress ROS sont éliminés par une voie de dégradation dépendante de l’ubiquitine. Les peroxysomes stressés par les ROS recrutent l’ubiquitine E3 ligase Stub1 pour permettre leur immersion dans les autophagosomes pour leur élimination individuelle par pexophagie16. On peut utiliser ce protocole pour comparer le sort des peroxysomes blessés et sains dans la même cellule par microscopie accélérée. La méthode peut également être utilisée pour endommager globalement tous les peroxysomes (dans toutes les cellules) sur une boîte de culture, permettant l’analyse biochimique de la voie pexophagie.

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Protocole

1. Préparation de cellules exprimant des protéines diKillerRed ou auto-marquantes (SLP) dans la lumière du peroxysome

  1. Ensemencez les cellules désirées sur des boîtes de culture cellulaire à fond de verre. Pour l’expérience ici, ensemencer 2 x 105 cellules SHSY5Y humaines dans 840 μL de milieu de culture (DMEM/F-12 supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline/streptomycine) ou 6 x 104 cellules NIH3T3 de souris dans 840 μL de milieu de culture (DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin et 1% de pénicilline/streptomycine) sur une boîte de culture de 35 mm avec un micropuits en verre de 20 mm de diamètre.
    NOTA : Le nombre de cellules ensemencées doit être ajusté proportionnellement en fonction de la zone du micropuits en verre lors de l’utilisation de plats à fond de verre d’autres spécifications.
  2. Faire pousser les cellules sous 5% de CO2/37 °C pendant 24 h.
  3. Transfecter les cellules avec les plasmides désirés à l’aide d’un réactif de transfection.
    1. Utilisez PMP34-TagBFP pour marquer les peroxysomes dans les cellules vivantes. Utilisez diKillerRed-VKSKL ciblant les peroxysomes ou SLP-VKSKL (+ ligands SLP marqués par colorant) pour la génération de ROS dans la lumière du peroxysome (par production de ROS activée par la lumière). Dans ce protocole, nous utilisons la protéine d’auto-marquage HaloTag-VKSKL21. Pour surveiller la translocation de Stub1/Hsp70, l’accumulation de protéines ubiquitinées et la formation d’autophagosomes sur les peroxysomes stressés par les ROS, transfectez EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub ou EGFP-LC3B, respectivement. Pour vérifier la génération de ROS dans la lumière peroxysomale, co-transfecter diKillerRed-VKSKL avec la sonde redox fluorescente localisée par peroxysomes roGFP2-VKSKL22.
    2. Pour la transfection cellulaire SHSY5Y, diluer les plasmides dans 55 μL de DMEM/F-12 sans sérum et diluer 1 μL de réactif de transfection dans 55 μL de DMEM/F12 sans sérum. Combinez l’ADN dilué avec le réactif dilué. Mélanger délicatement et incuber pendant 30 min à température ambiante.
    3. Ajouter le complexe au micropuits de 20 mm préalablement plaqué avec 100 μL de milieu de culture pour SHSY5Y sans antibiotiques (DMEM/F-12 avec 10% de sérum bovin fœtal). Secouez doucement le plat d’avant en arrière.
    4. Pour la transfection cellulaire NIH3T3, substituer le milieu sérique réduit au DMEM/F-12 sans sérum pour diluer les plasmides et le réactif de transfection. Remplacer le milieu de culture de placage par SHSY5Y par un milieu de culture pour cellules NIH3T3 sans antibiotiques (DMEM avec 10% de sérum bovin).
  4. Après 2 h de transfection, retirer le milieu contenant le réactif de transfection et ajouter 1 mL de milieu de culture frais. Incuber les cellules NIH3T3 ou SHSY5Y à 37°C et 5% CO2 pendant 24 h.
    REMARQUE : D’autres lignées cellulaires peuvent également être utilisées pour étudier la pexophagie médiée par Stub1 (p. ex. cellules HeLa).

2. Coloration des peroxysomes avec des ligands SLP marqués par colorant (pour la production de ROS activées par la lumière)

  1. 24 h après la transfection, retirer le milieu de culture et ajouter 100 μL de ligand HaloTag TMR 200 nM ou Janelia Fluor 646 HaloTag ligand 200 nM sur le micropuits de verre de 20 mm.
    REMARQUE: Les ligands SLP marqués au colorant doivent être dilués avec le milieu de culture respectif pour chaque lignée cellulaire. Le choix des ligands marqués Janelia Fluor 646 libérera les canaux bleu, vert et rouge pour l’imagerie de fluorescence en aval.
  2. Transférer la capsule dans un incubateur à 37°C, 5% CO2 . Coloration pendant 1 h. Après 1 h, retirer soigneusement le milieu de coloration et ajouter 1 mL de milieu de culture frais.

3. Contrainte ROS des peroxysomes sur un microscope confocal à balayage laser

  1. Placez une antenne parabolique à fond de verre contenant les cellules souhaitées sur un microscope confocal à balayage laser équipé d’un incubateur sur scène.
  2. Cliquez sur Tool Window (Fenêtre de l’outil), choisissez Ocular, puis cliquez sur le bouton DIA (Figure 2A) pour allumer la lumière transmise. Visualisez l’antenne parabolique à travers l’oculaire du microscope et mettez les cellules au point en tournant le bouton de mise au point.
  3. Choisissez LSM et cliquez sur le bouton Dye & Detector Select (Sélection de colorant et de détecteur ) (Figure 2B). Double-cliquez sur les colorants souhaités dans la fenêtre contextuelle pour sélectionner les paramètres de laser et de filtre appropriés pour l’imagerie des cellules (Figure 2C). Cliquez sur Livex4 dans le panneau Live pour lancer un balayage laser rapide afin de commencer à détecter les signaux de fluorescence des cellules (Figure 2D).
  4. Déplacez la scène à l’aide du contrôleur du joystick et localisez les cellules exprimant le milieu diKillerRed-VKSKL ou SLP-VKSKL pour appliquer une contrainte ROS (sur les peroxysomes). Acquérir une image de la cellule souhaitée.
  5. Cliquez sur Fenêtre Outil et choisissez LSM Stimulation (Stimulation LSM ) (Figure 2E). Cliquez sur le bouton d’ellipse et, dans la fenêtre de l’image en direct, utilisez la souris pour dessiner un ROI circulaire de 15 μm de diamètre (Figure 2F) contenant les peroxysomes souhaités acquis à l’étape 3.4 auxquels la contrainte ROS sera appliquée (voir Figure 3 pour un exemple).
  6. Pour appliquer une contrainte ROS, utilisez 561 nm pour les cellules avec le ligand SLP marqué diKillerRed-PTS1 ou TMR, et utilisez 640 nm pour les cellules colorées avec le ligand SLP marqué Janelia Fluor 646.
  7. Sélectionnez la longueur d’onde laser pour appliquer la contrainte ROS. Entrez le pourcentage laser souhaité et la durée (Figure 2G).
  8. Cliquez sur Acquire, puis sur le bouton Stimulation (Figure 2H) pour lancer le balayage avec une lumière 561/640 nm à travers les ROI pendant 30 s chacun. Cela correspond à un réglage de puissance laser de ~5% pour 561 nm et 640 nm sur le microscope confocal utilisé ici. Cette opération conduira à la production de ROS dans les peroxysomes.
    REMARQUE: On peut sélectionner des ROI de différentes tailles. Il convient d’ajuster proportionnellement le temps d’éclairage pour chaque ROI en fonction de sa zone.
  9. Après 30 s d’éclairage laser, les peroxysomes dans les ROI auront perdu leurs signaux diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646. Cette perte de signal permet de distinguer les peroxysomes illuminés des peroxysomes non éclairés (endommagés ou sains) dans une cellule.

4. Surveillance de la pexophagie dans les cellules vivantes par imagerie accélérée

  1. Suivez la translocation de Stub1, Hsp70, Ub, p62 ou LC3B marqués EGFP sur les peroxysomes éclairés/soumis à un stress ROS par imagerie accélérée en utilisant des intervalles de 10 minutes entre les images (pour des exemples, voir les figures 3 à 7).
    REMARQUE: Les signaux EGFP-Stub1 ou EGFP-Hsp70 commencent à apparaître 10-20 min après l’éclairage et restent sur tous les peroxysomes endommagés jusqu’à ~40 min après l’éclairage. Les signaux EGFP-Ub apparaissent 30 minutes après l’éclairage et durent 2-3 h. La translocation EGFP-p62 apparaît 60 min après l’éclairage, et les signaux EGFP-LC3B deviennent visibles ~3 h après l’éclairage.
  2. Quantifier les signaux EGFP sur les peroxysomes endommagés (de Stub1, Ub, p62 ou LC3B) à l’aide d’ImageJ. Procédez comme suit pour utiliser ImageJ afin de quantifier une image à trois canaux (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
    1. Ouvrez l’image et appliquez des sélections elliptiques ou des sélections à main levée pour enfermer la région contenant tous les peroxysomes illuminés (signal PMP34-TagBFP positif et signal ligand HaloTag blanchi; Figure 8A).
    2. Cliquez sur Dupliquer pour sélectionner le canal PMP34-TagBFP (Figure 8A). Définissez un seuil à l’aide du menu déroulant Image > Ajuster > seuil pour marquer les peroxysomes (figure 8B).
    3. Sélectionnez Analyser > Analyser les particules pour déterminer les régions exactes des peroxysomes illuminés. ImageJ enregistre ces régions d’intérêt (ROI) dans le gestionnaire de ROI (Figure 8C).
    4. Cliquez sur Dupliquer pour sélectionner le canal EGFP permettant d’analyser le signal de fluorescence de Ub, p62 ou LC3B conjugué EGFP (Figure 8D). Sélectionnez tous les ROI dans le Gestionnaire de ROI (Figure 8E).
    5. Appliquer Mesure dans le gestionnaire de retour sur investissement pour mesurer les signaux EGFP sur les peroxysomes (Figure 8E). Trouvez la valeur de la surface et de la densité intégrée (la somme de toutes les intensités de pixels) pour chaque retour sur investissement dans le tableau Résultats (Figure 8E).
    6. Pour obtenir les intensités moyennes de fluorescence EGFP à différents moments après l’éclairage, divisez l’intensité EGFP intégrée par la surface totale des peroxysomes éclairés (PMP34-TagBFP signal positif et HaloTag signal négatif du ligand). Pour obtenir le signal accumulé sur les peroxysomes, soustrayez l’intensité moyenne à un point temporel par l’intensité moyenne au temps = 0, puis normalisez par l’intensité moyenne au temps = 0.

5. Endommager globalement tous les peroxysomes (dans chaque cellule) sur une boîte de culture

  1. Effectuer l’étape 1 (préparation des cellules exprimant le diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] ou le SLP [SLP-VKSKL]) et l’étape 2 (coloration des peroxysomes avec le ligand SLP [pour la production de ROS activée par la lumière]).
  2. Après 1 h de coloration du ligand marqué TMR, retirer le milieu de coloration et ajouter 1 mL de milieu de culture contenant 30 mM de 3-AT (3-amino-1,2,4-triazole; un inhibiteur de la catalase).
    REMARQUE: La catalase est un piégeur ROS exprimé dans la lumière du peroxysome, de sorte que le traitement 3-AT aide à augmenter les dommages oxydatifs induits par la lumière sur les peroxysomes.
  3. Placez le plat de culture au-dessus d’une LED (555-570 nm). Illuminer toutes les cellules avec une densité de puissance de 1,8 W/cm2 pendant 9 h dans un incubateur.
    REMARQUE: Pour effectuer cette étape à l’extérieur d’un incubateur, placez la capsule de culture sur une plaque chauffante à 37 ° C. Ajouter 20 mM HEPES au milieu contenant du 3-AT et couvrir la capsule de culture d’un film transparent pour minimiser les échanges gazeux. HEPES est un agent tampon qui maintient le pH physiologique dans la culture cellulaire à l’extérieur d’un incubateur de CO2 pendant l’éclairage LED.
  4. Valider le succès des dommages causés par les LED en imageant les signaux EGFP-Ub, EGFP-p62 ou EGFP-LC3B sur les peroxysomes. En utilisant la condition d’éclairage décrite ci-dessus, 82% des cellules SHSY5Y exprimant de manière stable HaloTag-VKSKL présentaient une pexophagie médiée par Stub1.
  5. Récolter les cellules pour l’analyse biochimique en aval.

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Résultats

Le schéma d’induction de la pexophagie médiée par Stub1 illustré ici tire parti de la génération de ROS assistée par colorant dans la lumière du peroxysome. Cette opération nécessite des intensités lumineuses minimales. Les peroxysomes contenant des protéines fluorescentes ou des colorants peuvent donc être éclairés à l’aide de microscopes confocaux standard à balayage laser. L’éclairage focal conduit à une production instantanée et localisée de ROS dans les peroxysomes individuels, comme indiq...

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Discussion

Ce protocole détaille comment déclencher la pexophagie médiée par Stub1 dans les cultures cellulaires en élevant les niveaux de ROS peroxysomaux avec de la lumière. Comme le protocole repose sur la génération de ROS assistée par colorant, il faut s’assurer d’une expression suffisante de la coloration du ligand SLP marqué par diKillerRed-VKSKL ou colorant dans les cellules d’intérêt. Étant donné que différents types de cellules ou de cellules de différents antécédents génétiques peuvent abriter d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de recherche MOST 111-2311-B-001-019-MY3 du Conseil national des sciences et de la technologie de Taïwan.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell MatTekP35G-1.5-20-C20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)Sigma AldrichA8056
bovine serumThermoFisher Scientific16170060
Cell culture incubatorNuaireNU-4750
diKillerRed-PTS1Academia Sinicamade by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher Scientific11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)ThermoFisher Scientific11330032
EGFP-C1ClontechpEGFP-C1The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70Academia SinicaHsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3BAddgene11546
EGFP-p62Academia Sinicagenerated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1Academia Sinicagenerated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-UbAddgene11928
fetal bovine serumThermoFisher Scientific10437028
HaloTag TMR ligand PromegaG8252
HaloTag-PTS1Academia SinicaPTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPESThermoFisher Scientific15630080
Inverted Confocal Microscope OlympusFV3000RS405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag LigandPromegaGA1120
LEDVitaStarPAR6480 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000 ThermoFisher Scientific11668transfection reagent
NIH3T3 cellATCCCRL-1658adherent
Opti-MEMThermoFisher Scientific319850reduced serum media
penicillin/streptomycinThermoFisher Scientific15140
PMP34-TagBFPAcademia SinicaPMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1Academia Sinicagenerated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cellATCCCRL-2266adherent

Références

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