Stub1 매개 Pexophagy 모니터링

요약

이 프로토콜은 살아있는 세포에서 Stub1 매개 pexophagy를 트리거하고 모니터링하기 위한 지침을 제공합니다.

초록

포유류 세포는 Stub1 매개 pexophagy를 통해 과산화소체를 뒤집을 수 있습니다. 이 경로는 잠재적으로 과산화소체의 양과 질에 대한 세포 제어를 허용합니다. 이 과정에서 열 충격 단백질 70과 유비퀴틴 E3 리가아제인 Stub1은 과산화소체로 전위되어 펙소파지를 시작합니다. Stub1 리가제 활성은 표적 과산화소체에 유비퀴틴 및 기타 자가포식 관련 모듈의 축적을 허용합니다. 퍼옥시좀 루멘 내에서 활성 산소종(ROS) 수준을 높이면 Stub1 매개 축척을 활성화할 수 있습니다. 따라서 염료 보조 ROS 생성을 사용하여 이 경로를 트리거하고 모니터링할 수 있습니다. 이 기사에서는 포유류 세포 배양 내에서 펙소파지를 시작하기 위해 형광 단백질과 합성 형광단의 두 가지 종류의 염료를 사용하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이러한 염료 보조 ROS 생성 기반 프로토콜은 전 세계적으로 세포 집단 내의 모든 과산화소체를 표적으로 삼는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 단일 세포 내에서 개별 과산화소체의 조작을 허용할 수도 있습니다. 또한 생세포 현미경을 사용하여 Stub1 매개 pexophagy를 추적하는 방법도 설명합니다.

서문

과산화소체는 대부분의 진핵 세포에 존재하는 단일 막 결합 소기관입니다. 과산화소체는 매우 긴 사슬 지방산의 베타 산화, 퓨린 이화 작용, 에테르 인지질 및 담즙산 합성을 수행하는 데 필수적인 대사 구획입니다¹. 과산화소체 유래 아세틸-CoA는 대사에서 중추 신호 전달을 조절하여 지질 항상성을 조절합니다². 따라서 손상된 과산화소체 기능이 신경퇴행성 장애, 노화, 암, 비만 및 당뇨병을 포함한 다양한 질병에 내포되어 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다 ^3,4,5. 퍼옥시솜 작동의 유지에 필수적인 과정은 pexophagy입니다. Pexophagy는 autophagy에 의한 peroxisomes의 선택적 회전율을위한 이화 작용 과정입니다. 세포는 펙소파지를 사용하여 과산화소체의 양과 질을 조절하여 적절한 과산화소체 기능을 보장합니다. 최근 연구에 따르면 PEX1 퍼옥시좀 생물 발생 인자 1 및 6의 돌연변이로 인한 과산화소체 손실은 제어되지 않은 pexophagy⁶의 ....

프로토콜

1. 퍼옥시좀 루멘에서 diKillerRed 또는 자가 표지 단백질(SLP)을 발현하는 세포의 제조

1. 유리 바닥의 세포 배양 접시에 원하는 세포를 뿌립니다. 여기에서 실험을 위해 840μL^{의 배양 배지} (10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F-12)의 2 x 10 5 인간 SHSY5Y 세포 또는 직경 20mm 유리 마이크로웰이 있는 35mm 배양 접시에 840μL의 배양 배지(10% 소 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM)의 6 x 10⁴ 마우스 NIH3T3 세포.
   주: 씨를 뿌린 세포의 수는 다른 명세의 유리제 밑바닥 접시를 사용할 경우의 유리제 마이크로웰 지역에 따라 비례적으로 조정되어야 합니다.
2. 세포를 5%_CO2/37°C 하에서 24시간 동안 성장시킨다.
3. 형질주입 시약을 사용하여 원하는 플라스미드로 세포를 형질주입합니다.
   1. PMP34-TagBFP를 사용하여 살아있는 세포의 과산화소체를 라벨링합니다. 과산화소체 내강에서 ROS 생성을 위해 과산화소체 표적 diKillerRed-VKSKL 또는 SLP-VKSKL(+ 염료 표지 SLP 리간드)을 사용합니다(광 활성화 ROS 생산을 통....

결과

여기에 표시된 Stub1 매개 pexophagy 유도 방식은 퍼옥시좀 내강 내에서 염료 보조 ROS 생성을 활용합니다. 이 작업에는 최소한의 광도가 필요합니다. 따라서 형광 단백질 또는 염료를 포함하는 과산화소체는 표준 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 조명할 수 있습니다. 초점 조명은 형광 리포터 roGFP2-VKSKL에 의해 표시된 바와 같이 개별 과산화소체 내에서 즉각적이고 국부적인 ROS 생성으로 이어?.......

토론

이 프로토콜은 빛으로 퍼옥시좀 ROS 수준을 높여 세포 배양 내에서 Stub1 매개 pexophagy를 유발하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 염료 보조 ROS 생성에 의존하기 때문에 관심 세포 내에서 diKillerRed-VKSKL 또는 염료 표지 SLP 리간드 염색의 충분한 발현을 보장해야 합니다. 서로 다른 세포 유형 또는 서로 다른 유전적 배경을 가진 세포가 약간 다른 특성을 가진 과산화소체를 보유할 수 있다는 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell	MatTek	P35G-1.5-20-C	20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)	Sigma Aldrich	A8056
bovine serum	ThermoFisher Scientific	16170060
Cell culture incubator	Nuaire	NU-4750
diKillerRed-PTS1	Academia Sinica		made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher Scientific	11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)	ThermoFisher Scientific	11330032
EGFP-C1	Clontech	pEGFP-C1	The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70	Academia Sinica		Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3B	Addgene	11546
EGFP-p62	Academia Sinica		generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1	Academia Sinica		generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Ub	Addgene	11928
fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10437028
HaloTag TMR ligand	Promega	G8252
HaloTag-PTS1	Academia Sinica		PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
Inverted Confocal Microscope	Olympus	FV3000RS	405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand	Promega	GA1120
LED	VitaStar	PAR64	80 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668	transfection reagent
NIH3T3 cell	ATCC	CRL-1658	adherent
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	319850	reduced serum media
penicillin/streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140
PMP34-TagBFP	Academia Sinica		PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1	Academia Sinica		generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cell	ATCC	CRL-2266	adherent