JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол содержит инструкции по запуску и мониторингу Stub1-опосредованной пексофагии в живых клетках.

Аннотация

Клетки млекопитающих могут переворачивать пероксисомы через Stub1-опосредованную пексофагию. Этот путь потенциально позволяет клеточному контролю количества и качества пероксисом. Во время этого процесса белок 70 теплового шока и убиквитин-лигаза E3, Stub1, перемещаются на пероксисомы, чтобы перевернуться, чтобы инициировать пексофагию. Активность лигазы Stub1 позволяет накапливать убиквитин и другие модули, связанные с аутофагией, на целевых пероксисомах. Повышение уровня активных форм кислорода (АФК) в пероксисомальном просвете может активировать пексофагию, опосредованную Stub1. Таким образом, можно использовать генерацию АФК с помощью красителя для запуска и мониторинга этого пути. В этой статье описываются процедуры использования двух классов красителей, флуоресцентных белков и синтетических флуорофоров, для инициирования пексофагии в культурах клеток млекопитающих. Эти протоколы, основанные на генерации АФК с помощью красителей, могут не только использоваться для нацеливания на все пероксисомы в популяции клеток во всем мире, но также могут позволять манипулировать отдельными пероксисомами в отдельных клетках. Мы также описываем, как можно отслеживать пексофагию, опосредованную Stub1, с помощью микроскопии живых клеток.

Введение

Пероксисомы представляют собой органеллы, связанные с одной мембраной, присутствующие в большинстве эукариотических клеток. Пероксисомы представляют собой метаболический компартмент, необходимый для осуществления бета-окисления очень длинноцепочечных жирных кислот, катаболизма пуринов и синтеза эфирфосфолипидов и желчных кислот1. Ацетил-КоА, полученный из пероксисом, контролирует гомеостаз липидов, регулируя центральную передачу сигналов в метаболизме2. Поэтому неудивительно, что нарушенные пероксисомальные функции подразумеваются при различных заболеваниях, включая нейродегенеративные расстройства, старение, рак, ожирение и диабет 3,4,5. Важным процессом в поддержании пероксисомальной работы является пексофагия. Пексофагия - это катаболический процесс селективного оборота пероксисом путем аутофагии. Клетки используют пексофагию, чтобы помочь контролировать количество и качество пероксисом, тем самым обеспечивая надлежащую функцию пероксисомы. Недавнее исследование показало, что потеря пероксисом, вызванная мутациями в факторах пероксисомального биогенеза PEX1 1 и 6, является результатом неконтролируемой пексофагии6. Примечательно, что 65% всех пациентов с нарушением биогенеза пероксисом (PBD) имеют дефицит пероксисомального комплекса ААА АТФазы, состоящего из PEX1, PEX6 и PEX26 в клетках млекопитающих7.

Для инициирования и изучения пексофагии может быть использован ряд методов. У дрожжей пексофагия запускается, когда поставляемые питательные вещества переключаются с пероксисом-зависимых источников углерода на пероксисомно-независимые источники углерода (для снижения количества клеточных пероксисом)8. Например, перенос выращенных в метаноле клеток Pichia pastoris из метанольной среды в среду глюкозы и этаноловую среду индуцирует микропексофагию и макропексофагию соответственно 8,9,10. Секвестраторы микропексофагии кластеризовали пероксисомы для деградации путем ремоделирования вакуоли с образованием чашеобразных вакуолярных секвестрирующих мембран и структуры, похожей на крышку, называемой микропексофагией-специфическим мембранным аппаратом (MIPA). При макропексофагии отдельные пероксисомы поглощаются двухмембранными структурами, известными как пексофагосомы, с последующим слиянием с вакуолью для деградации 8,9,10. Фосфорилирование рецепторов пексофагии, таких как Atg36p у Saccharomyces cerevisiae и Atg30p у Pichia pastoris, имеет решающее значение для рецепторов, чтобы рекрутировать основной механизм аутофагии и облегчать пероксисомальное нацеливание на аутофагосомы 8,11.

В клетках млекопитающих пексофагия может быть индуцирована убиквитинированием. Маркировка пероксисомальных мембранных белков PMP34 или PEX3 убиквитином на цитозольной стороне индуцирует пексофагию12. Сверхэкспрессия PEX3 индуцирует убиквитинирование пероксисом и элиминацию пероксисомлизосомами 13. Кроме того, слияние PEX5 с C-концевым EGFP ухудшает экспорт моноубиквитинированного PEX5 и приводит к пексофагии14. С другой стороны, пексофагия также может быть вызвана лечениемH2O2. Пероксисомы продуцируют активные формы кислорода (АФК); в частности, пероксисомальный фермент Acox1, который катализирует начальную стадию бета-окисления очень длинноцепочечных жирных кислот (> 22 углерода), продуцирует не только ацетил-КоА, но и пероксисомальные АФК. В ответ на повышенные уровни АФК при лечении H 2 O2клетки млекопитающих активируют пексофагию, чтобы снизить выработку АФК и облегчить стресс. Сообщалось, что лечение H 2 O2приводит к набору мутировавших атаксий-телеангиэктазий (ATM) в пероксисомы. Затем ATM фосфорилирует PEX5, способствуя пероксисомальному обороту за счет пексофагии15.

Поскольку пероксисомы являются центрами, генерирующими АФК, они также подвержены повреждению АФК. Пероксисомальные повреждения, вызванные АФК, заставляют клетки активировать пексофагию, чтобы инициировать пути контроля качества пероксисом (удаление поврежденной пероксисомы аутофагией). Здесь мы описываем подход к запуску по требованию пероксисомного повреждения, вызванного АФК. В протоколе используется активируемая светом продукция АФК в органеллах 16,17,18,19,20 (рис. 1). Пероксисомы, меченные красителем, подсвечиваются, что приводит к образованию АФК в просвете пероксисомы, что специфически вызывает пероксисомальное повреждение. С помощью этого протокола показано, что АФК-стрессовые пероксисомы удаляются по убиквитин-зависимому пути деградации. Пероксисомы, стрессированные АФК, рекрутируют убиквитин-E3-лигазу Stub1, чтобы позволить им проникнуть в аутофагосомы для индивидуального удаления с помощью пексофагии16. Этот протокол можно использовать для сравнения судьбы поврежденных и здоровых пероксисом в одной клетке с помощью покадровой микроскопии. Этот метод также может быть использован для глобального повреждения всех пероксисом (во всех клетках) на чашке для культивирования, что позволяет проводить биохимический анализ пути пексофагии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка клеток, экспрессирующих diKillerRed или самомечеющиеся белки (SLP) в просвете пероксисом

  1. Высевают нужные клетки на чашки для клеточных культур со стеклянным дном. Для проведения эксперимента поместите 2 x 105 клеток SHSY5Y человека в 840 мкл питательной среды (DMEM/F-12 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина) или 6 x 104 клеток NIH3T3 мыши в 840 мкл питательной среды (DMEM с добавлением 10% бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина) на культуральную чашку диаметром 35 мм со стеклянной микролункой диаметром 20 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество засеянных ячеек должно быть пропорционально отрегулировано в соответствии с площадью стеклянной микролунки при использовании посуды со стеклянным дном других спецификаций.
  2. Выращивайте клетки при температуре ниже 5% CO2/37 °C в течение 24 часов.
  3. Трансфицируйте клетки желаемыми плазмидами с помощью реагента для трансфекции.
    1. Используйте PMP34-TagBFP для маркировки пероксисом в живых клетках. Используйте либо диKillerRed-VKSKL, нацеленный на пероксисомы, либо SLP-VKSKL (+ лиганды SLP, меченные красителем) для генерации АФК в просвете пероксисом (за счет производства АФК, активируемых светом). В этом протоколе мы используем самомаркирующийся белок HaloTag-VKSKL21. Для мониторинга транслокации Stub1/Hsp70, накопления убиквитинированных белков и образования аутофагосом на АФК-стрессовых пероксисомах трансфицируют EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub или EGFP-LC3B соответственно. Чтобы проверить генерацию АФК в пероксисомальном просвете, совместно трансфицируйте diKillerRed-VKSKL с локализованным пероксисомным флуоресцентным окислительно-восстановительным зондом roGFP2-VKSKL22.
    2. Для трансфекции клеток SHSY5Y разбавьте плазмиды в 55 мкл безсывороточного DMEM/F-12 и разбавьте 1 мкл реагента для трансфекции в 55 мкл DMEM/F12 без сыворотки. Соедините разбавленную ДНК с разбавленным реагентом. Аккуратно перемешайте и выдерживайте 30 минут при комнатной температуре.
    3. Добавьте комплекс в 20-миллиметровую микролунку, предварительно покрытую 100 мкл питательной среды для SHSY5Y без антибиотиков (DMEM/F-12 с 10% эмбриональной бычьей сывороткой). Аккуратно встряхните блюдо вперед и назад.
    4. Для трансфекции клеток NIH3T3 замените восстановленную сывороточную среду на безсывороточный DMEM/F-12 для разбавления плазмид и реагента для трансфекции. Замените гальваническую питательную среду SHSY5Y питательной средой для клеток NIH3T3 без антибиотиков (DMEM с 10% бычьей сывороткой).
  4. Через 2 ч после трансфекции удаляют среду, содержащую реагент для трансфекции, и добавляют 1 мл свежей питательной среды. Инкубируйте клетки NIH3T3 или SHSY5Y при 37 ° C и 5% CO2 в течение 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие клеточные линии также могут быть использованы для изучения пексофагии, опосредованной Stub1 (например, клетки HeLa).

2. Окрашивание пероксисом меченными красителем лигандами SLP (для получения светоактивируемых АФК)

  1. Через 24 часа после трансфекции удалите питательную среду и добавьте 100 мкл 200 нМ лиганда HaloTag TMR или 200 нМ лиганда Janelia Fluor 646 HaloTag на 20-миллиметровую стеклянную микролунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Меченные красителем лиганды SLP следует разбавлять соответствующей питательной средой для каждой клеточной линии. Выбор лигандов, меченных Janelia Fluor 646, освободит синий, зеленый и красный каналы для последующей флуоресцентной визуализации.
  2. Перенесите блюдо в инкубатор с температурой 37 ° C, 5% CO2 . Пятно на 1 ч. ч. Через 1 ч тщательно удалите окрашивающую среду и добавьте 1 мл свежей питательной среды.

3. АФК-стрессирование пероксисом на лазерно-сканирующем конфокальном микроскопе

  1. Поместите чашку со стеклянным дном, содержащую нужные клетки, на конфокальный микроскоп с лазерным сканированием, оснащенный настольным инкубатором.
  2. Нажмите « Окно инструментов», выберите «Окуляр» и нажмите кнопку DIA (рис. 2A), чтобы включить проходящий свет. Посмотрите на тарелку через окуляр микроскопа и сфокусируйте ячейки, повернув ручку фокусировки.
  3. Выберите LSM и нажмите кнопку « Выбор красителя и детектора » (рис. 2B). Дважды щелкните нужные красители во всплывающем окне, чтобы выбрать соответствующие настройки лазера и фильтра для визуализации клеток (рис. 2C). Нажмите на Livex4 на панели Live , чтобы начать быстрое лазерное сканирование, чтобы начать скрининг флуоресцентных сигналов клеток (рис. 2D).
  4. Перемещайте сцену с помощью джойстика и найдите средние клетки, экспрессирующие diKillerRed-VKSKL- или SLP-VKSKL, чтобы приложить АФК-стресс (к пероксисомам). Приобретите изображение нужной ячейки.
  5. Нажмите на Tool Window (Окно инструментов) и выберите LSM Stimulation (Стимуляция LSM ) (рис. 2E). Нажмите на кнопку эллипса и в окне живого изображения с помощью мыши нарисуйте круговой ROI диаметром 15 мкм (рис. 2F), содержащий желаемые пероксисомы, полученные на шаге 3.4, к которым будет приложено напряжение АФК (см. Рисунок 3 для примера).
  6. Чтобы применить стресс АФК, используйте 561 нм для клеток с лигандом SLP, меченным diKillerRed-PTS1 или TMR, и используйте 640 нм для клеток, окрашенных лигандом SLP, меченным Janelia Fluor 646.
  7. Выберите длину волны лазера для приложения напряжения АФК. Введите желаемый процент лазера и продолжительность (рис. 2G).
  8. Нажмите « Получить» и нажмите кнопку « Стимуляция » (рис. 2H), чтобы начать сканирование со светом 561/640 нм через ROI в течение 30 с каждый. Это соответствует настройке мощности лазера ~5% для 561 нм и 640 нм на используемом здесь конфокальном микроскопе. Эта операция приведет к образованию АФК в пероксисомах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно выбрать ROI разных размеров. Следует пропорционально регулировать время освещения для каждого ROI в соответствии с его площадью.
  9. После 30 секунд лазерного освещения пероксисомы в ROI потеряют свои сигналы diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646. Эта потеря сигнала позволяет отличить освещенные пероксисомы от неосвещенных (поврежденных и здоровых) внутри клетки.

4. Мониторинг пексофагии в живых клетках с помощью покадровой визуализации

  1. Проследите за транслокацией помеченных EGFP Stub1, Hsp70, Ub, p62 или LC3B на освещенные/напряженные АФК пероксисомы с помощью покадровой съемки с использованием 10-минутных интервалов между кадрами (например, см. Рисунки 3-7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сигналы EGFP-Stub1 или EGFP-Hsp70 начинают появляться через 10-20 минут после освещения и остаются на всех поврежденных пероксисомах до ~40 минут после освещения. Сигналы EGFP-Ub появляются через 30 минут после освещения и длятся 2-3 часа. Транслокация EGFP-p62 появляется через 60 минут после освещения, а сигналы EGFP-LC3B становятся видимыми через ~ 3 ч после освещения.
  2. Количественно оцените сигналы EGFP на поврежденных пероксисомах (из Stub1, Ub, p62 или LC3B) с помощью ImageJ. Выполните следующие действия для использования ImageJ для количественной оценки трехканального изображения (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
    1. Откройте изображение и примените эллиптический выбор или выбор от руки , чтобы заключить область, содержащую все освещенные пероксисомы (положительный сигнал PMP34-TagBFP и обесцвеченный сигнал лиганда HaloTag; Рисунок 8А).
    2. Нажмите « Дублировать », чтобы выбрать канал PMP34-TagBFP (рис. 8A). Установите порог с помощью выпадающего меню «Изображение» > «Настроить порог» > «Порог », чтобы отметить пероксисомы (рис. 8B).
    3. Выберите «Анализировать» > «Анализировать частицы», чтобы определить точные области освещенных пероксисом. ImageJ записывает эти области интереса (ROI) в менеджере ROI (рис. 8C).
    4. Нажмите « Дублировать », чтобы выбрать канал EGFP для анализа флуоресцентного сигнала из EGFP-сопряженного Ub, p62 или LC3B (рис. 8D). Выберите все ROI в ROI Manager (рис. 8E).
    5. Примените Measure в ROI Manager для измерения сигналов EGFP на пероксисомах (рис. 8E). Найдите значение площади и интегральной плотности (сумму всех интенсивностей пикселей) для каждого ROI в таблице результатов (рис. 8E).
    6. Чтобы получить среднюю интенсивность флуоресценции EGFP в разные моменты времени после освещения, разделите интегральную интенсивность EGFP на общую площадь освещенных пероксисом (положительные зоны сигнала PMP34-TagBFP и отрицательные зоны сигнала лиганда HaloTag). Чтобы получить накопленный сигнал на пероксисомах, вычтите усредненную интенсивность в момент времени на усредненную интенсивность в момент времени = 0, а затем нормализуйте на усредненную интенсивность в момент времени = 0.

5. Глобальное повреждение всех пероксисом (в каждой клетке) на культуральной чашке

  1. Выполните шаг 1 (подготовка клеток, экспрессирующих пероксисом-таргетированный diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] или SLP [SLP-VKSKL]) и шаг 2 (окрашивание пероксисом лигандом SLP [для светоактивируемой продукции АФК]).
  2. После 1 ч окрашивания лиганда, меченного TMR, удаляют окрашивающую среду и добавляют 1 мл питательной среды, содержащей 30 мМ 3-АТ (3-амино-1,2,4-триазол; ингибитор каталазы).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каталаза является поглотителем АФК, экспрессируемым в просвете пероксисом, поэтому лечение 3-AT помогает усилить окислительное повреждение пероксисом, вызванное светом.
  3. Поместите культуральную чашку над светодиодом (555-570 нм). Осветите все ячейки с плотностью мощности 1,8 Вт/см2 в течение 9 ч в инкубаторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы выполнить этот шаг вне инкубатора, поместите чашку с культурой на нагревательную пластину при температуре 37 ° C. Добавьте 20 мМ HEPES в среду, содержащую 3-AT, и накройте чашку для культивирования прозрачной пленкой, чтобы свести к минимуму газообмен. HEPES является буферным агентом, который поддерживает физиологический рН в клеточной культуре вне инкубатора CO2 во время светодиодного освещения.
  4. Подтвердите успешность повреждений, вызванных светодиодом, путем визуализации сигналов EGFP-Ub, EGFP-p62 или EGFP-LC3B на пероксисомах. Используя условия освещения, описанные выше, 82% клеток SHSY5Y, стабильно экспрессирующих HaloTag-VKSKL, проявляли пексофагию, опосредованную Stub1.
  5. Соберите клетки для последующего биохимического анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Показанная здесь схема индукции пексофагии, опосредованная Stub1, использует преимущества генерации АФК с помощью красителя в просвете пероксисом. Эта операция требует минимальной интенсивности света. Таким образом, пероксисомы, содержащие флуоресцентные белки или красители, могут быт...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом протоколе подробно описано, как запустить Stub1-опосредованную пексофагию в клеточных культурах путем повышения уровня пероксисомальных АФК с помощью света. Поскольку протокол основан на генерации АФК с помощью красителя, необходимо обеспечить достаточную экспрессию окрашивани...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана исследовательским грантом MOST 111-2311-B-001-019-MY3 от Национального совета по науке и технологиям Тайваня.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell MatTekP35G-1.5-20-C20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)Sigma AldrichA8056
bovine serumThermoFisher Scientific16170060
Cell culture incubatorNuaireNU-4750
diKillerRed-PTS1Academia Sinicamade by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher Scientific11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)ThermoFisher Scientific11330032
EGFP-C1ClontechpEGFP-C1The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70Academia SinicaHsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3BAddgene11546
EGFP-p62Academia Sinicagenerated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1Academia Sinicagenerated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-UbAddgene11928
fetal bovine serumThermoFisher Scientific10437028
HaloTag TMR ligand PromegaG8252
HaloTag-PTS1Academia SinicaPTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPESThermoFisher Scientific15630080
Inverted Confocal Microscope OlympusFV3000RS405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag LigandPromegaGA1120
LEDVitaStarPAR6480 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000 ThermoFisher Scientific11668transfection reagent
NIH3T3 cellATCCCRL-1658adherent
Opti-MEMThermoFisher Scientific319850reduced serum media
penicillin/streptomycinThermoFisher Scientific15140
PMP34-TagBFPAcademia SinicaPMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1Academia Sinicagenerated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cellATCCCRL-2266adherent

Ссылки

  1. Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83(2016).
  2. He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
  3. Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. Peroxisomal dysfunction in age-related diseases. Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).
  4. Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).
  5. Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
  6. Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
  7. Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
  8. Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
  9. Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
  10. Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721(2012).
  11. Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578(2020).
  12. Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
  13. Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
  14. Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
  15. Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
  16. Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267(2020).
  17. Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111(2013).
  18. Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345(2021).
  19. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
  20. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428(2013).
  21. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  22. Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
  23. Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

195Hsc70Stub1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены