Мониторинг пексофагии, опосредованной Stub1

Резюме

Этот протокол содержит инструкции по запуску и мониторингу Stub1-опосредованной пексофагии в живых клетках.

Аннотация

Клетки млекопитающих могут переворачивать пероксисомы через Stub1-опосредованную пексофагию. Этот путь потенциально позволяет клеточному контролю количества и качества пероксисом. Во время этого процесса белок 70 теплового шока и убиквитин-лигаза E3, Stub1, перемещаются на пероксисомы, чтобы перевернуться, чтобы инициировать пексофагию. Активность лигазы Stub1 позволяет накапливать убиквитин и другие модули, связанные с аутофагией, на целевых пероксисомах. Повышение уровня активных форм кислорода (АФК) в пероксисомальном просвете может активировать пексофагию, опосредованную Stub1. Таким образом, можно использовать генерацию АФК с помощью красителя для запуска и мониторинга этого пути. В этой статье описываются процедуры использования двух классов красителей, флуоресцентных белков и синтетических флуорофоров, для инициирования пексофагии в культурах клеток млекопитающих. Эти протоколы, основанные на генерации АФК с помощью красителей, могут не только использоваться для нацеливания на все пероксисомы в популяции клеток во всем мире, но также могут позволять манипулировать отдельными пероксисомами в отдельных клетках. Мы также описываем, как можно отслеживать пексофагию, опосредованную Stub1, с помощью микроскопии живых клеток.

Введение

Пероксисомы представляют собой органеллы, связанные с одной мембраной, присутствующие в большинстве эукариотических клеток. Пероксисомы представляют собой метаболический компартмент, необходимый для осуществления бета-окисления очень длинноцепочечных жирных кислот, катаболизма пуринов и синтеза эфирфосфолипидов и желчных кислот¹. Ацетил-КоА, полученный из пероксисом, контролирует гомеостаз липидов, регулируя центральную передачу сигналов в метаболизме². Поэтому неудивительно, что нарушенные пероксисомальные функции подразумеваются при различных заболеваниях, включая нейродегенеративные расстройства,....

протокол

1. Подготовка клеток, экспрессирующих diKillerRed или самомечеющиеся белки (SLP) в просвете пероксисом

1. Высевают нужные клетки на чашки для клеточных культур со стеклянным дном. Для проведения эксперимента поместите 2 x 10⁵ клеток SHSY5Y человека в 840 мкл питательной среды (DMEM/F-12 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина) или 6 x 10⁴ клеток NIH3T3 мыши в 840 мкл питательной среды (DMEM с добавлением 10% бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина) на культуральную чашку диаметром 35 мм со стеклянной микролункой диаметром 20 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество засеянных ячеек должн....

Результаты

Показанная здесь схема индукции пексофагии, опосредованная Stub1, использует преимущества генерации АФК с помощью красителя в просвете пероксисом. Эта операция требует минимальной интенсивности света. Таким образом, пероксисомы, содержащие флуоресцентные белки или красители, могут быт.......

Обсуждение

В этом протоколе подробно описано, как запустить Stub1-опосредованную пексофагию в клеточных культурах путем повышения уровня пероксисомальных АФК с помощью света. Поскольку протокол основан на генерации АФК с помощью красителя, необходимо обеспечить достаточную экспрессию окрашивани.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell	MatTek	P35G-1.5-20-C	20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)	Sigma Aldrich	A8056
bovine serum	ThermoFisher Scientific	16170060
Cell culture incubator	Nuaire	NU-4750
diKillerRed-PTS1	Academia Sinica		made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher Scientific	11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)	ThermoFisher Scientific	11330032
EGFP-C1	Clontech	pEGFP-C1	The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70	Academia Sinica		Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3B	Addgene	11546
EGFP-p62	Academia Sinica		generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1	Academia Sinica		generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Ub	Addgene	11928
fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10437028
HaloTag TMR ligand	Promega	G8252
HaloTag-PTS1	Academia Sinica		PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
Inverted Confocal Microscope	Olympus	FV3000RS	405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand	Promega	GA1120
LED	VitaStar	PAR64	80 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668	transfection reagent
NIH3T3 cell	ATCC	CRL-1658	adherent
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	319850	reduced serum media
penicillin/streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140
PMP34-TagBFP	Academia Sinica		PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1	Academia Sinica		generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cell	ATCC	CRL-2266	adherent