Modèle de mise en charge sans tension de l’ostéonécrose de la tête fémorale induite par les stéroïdes chez le rat

Résumé

Le protocole montre la construction d’un modèle d’entraînement simple et rentable pour l’ostéonécrose de la tête fémorale induite par les stéroïdes à l’aide d’un ruban thérapeutique élastique.

Résumé

Contrairement aux humains, les rats sont des animaux qui marchent à quatre pattes, tandis que les humains sont des animaux bipèdes qui se tiennent debout et les hanches sont soumises à une pression énorme lorsqu’ils marchent et se tiennent debout. Dans les modèles de nécrose de la tête fémorale induite par les stéroïdes chez le rat, les caractéristiques biomécaniques de la hanche humaine sous une pression plus élevée doivent souvent être simulées. Certains érudits tentent d’imiter l’état de la pression de la hanche humaine en faisant porter un certain poids aux rats, mais il est difficile de fixer l’objet porteur sur le rat. Les rats peuvent facilement se libérer de l’immobilisation, et coller le poids sur les rats avec du ruban adhésif les fera suffoquer ou mourir d’une occlusion intestinale. Notre groupe de recherche a utilisé du ruban thérapeutique élastique pour effectuer une immobilisation sans tension d’objets porteurs chez des rats afin que les rats puissent respirer librement et ne pas se détacher de l’immobilisation dans des conditions de mise en charge. Par rapport au modèle habituel de nécrose de la tête fémorale induite par les stéroïdes, nous avons constaté que cette intervention de mise en charge peut aggraver la progression de la nécrose de la tête fémorale chez le rat.

Introduction

L’administration de glucocorticoïdes est le facteur de risque le plus fréquent d’ostéonécrose non traumatique de la tête fémorale (ONFH)¹. De nombreuses preuves suggèrent qu’en plus des glucocorticoïdes, la charge de pression sur l’articulation de la hanche chez les patients est également associée à la survenue d’ONFH. Des facteurs tels que le poids corporel et l’intensité physique du travail sont reconnus comme des facteurs de risque pour l’ONFH². De nombreuses études cliniques ont démontré une relation étroite entre les conditions de charge de l’articulation de la hanche et le moment et l’incidence du remplacement articulaire 3,4,5,6. Par conséquent, il est important d’établir un modèle qui reflète la relation entre la portance et l’ostéonécrose de la tête fémorale induite par les stéroïdes (SONFH) pour une enquête complète de cette maladie.

Les grands oiseaux bipèdes, tels que les autruches et les émeus, servent de bons modèles pour simuler le stress de l’articulation de la hanche, ressemblant aux charges de la jambe humaine ^7,8. Cependant, le maintien des grandes espèces d’oiseaux est un défi, et les coûts de recherche associés sont élevés. Les modèles^{de rats spontanément} hypertendus ^9,10 peuvent présenter des taux plus élevés d’ONFH, mais la charge de pression du compartiment dans la moelle générée par l’hypertension spontanée diffère significativement de la pression mécanique et ne convient pas à l’étude de l’impact de la pression mécanique sur la SONFH.

Les modèles de petits animaux sont couramment utilisés dans la recherche sur la SONFH. Cependant, les reptiles quadrupèdes ont un stress plus faible de l’articulation de la hanche et leurs modèles de hanche ne peuvent pas simuler l’environnement biomécanique des articulations de la hanche humaine pendant la marche bipède. Les modèles d’immobilisation d’un membre¹¹ et les modèles de décharge partielle¹² sont courants, mais les deux réduisent la charge des membres. Comme les humains sont des organismes bipèdes avec des charges substantielles des membres inférieurs en position debout et en marchant, la réduction de la charge dans ces modèles diminue le lien entre les modèles animaux et les maladies humaines.

Cette étude vise à établir un modèle simple et rentable pour l’entraînement avec mise en charge afin d’étudier l’impact de l’entraînement avec mise en charge sur l’ostéonécrose de la tête fémorale induite par les stéroïdes chez le rat. Actuellement, des modèles de rats ont été utilisés pour étudier l’ostéonécrose de la tête fémorale induite par les stéroïdes^13,14, mais il n’existe toujours pas de modèle capable de fournir une fixation sûre à long terme avec une perturbation minimale du mouvement, ce qui est également relativement simple et peu coûteux. Dans cette étude, un matériau de fixation hautement adhésif est appliqué, adoptant une fixation sans tension, qui maintient la mobilité des rats et réduit la souffrance et même la mort causées par une mauvaise fixation.

Protocole

Le protocole respecte les directives éthiques établies par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de médecine chinoise de Pékin, numéro de protocole BUCM-4-2022062001-2109. Le protocole utilise des rats Sprague Dawley (SD) (SCXK(Jing)2019-0008), âgés de 8 à 10 semaines et pesant de 200 g à 250 g.

1. Formation à l’adaptation

1. Les rats albinos ont généralement une portée visuelle inférieure à 60^cm15. Pendant le processus de modélisation, placez les rats dans des cages opaques et gardez-les aussi loin que possible des rats non modélisés (au moins, les autres rats doivent être en dehors de la portée visuelle maximale des rats modélisés) pour éviter qu’ils ne subissent un stress traumatique.
2. Allumez l’alimentation et réglez le tapis de course à 10 m/min avec une inclinaison de 0°. Placez les rats sur le tapis roulant et assurez-vous que les mouvements sont aussi doux que possible pour éviter le stress. N’utilisez pas de stimulation supplémentaire ; Les rats rampent naturellement vers l’avant parce qu’ils ne connaissent pas l’environnement.
3. La formation dure 15 min. Après l’entraînement, nettoyez les excréments et l’urine laissés par les rats et vaporisez de l’alcool pour éliminer l’odeur des animaux. Ensuite, préparez le prochain rat pour l’entraînement.
   REMARQUE : Si un rat refuse de marcher sur le tapis roulant pendant 5 minutes, excluez-le de l’étude.
4. Poursuivez l’entraînement adaptatif jusqu’à la fin de la 1ère^semaine.

2. Mesure de la capacité de charge maximale chez le rat

1. Préparez deux tubes à essai, un crochet et une boucle d’environ 80 cm de long. Placez des billes d’acier dans les tubes à essai, en veillant à ce que le poids initial combiné des tubes à essai, du crochet et de la boucle soit de 150 g. Préparez des tubes à essai de différents poids totaux par incréments de 10 g, le poids maximum étant de 350 g.
2. À l’aide de ses deux mains, un chercheur attache des rats à l’aide de gants (figure 1). Un autre chercheur place l’éprouvette sur le dos du rat, à environ 1 cm de la ligne médiane du dos. Étant donné que cette étape ne nécessite pas de mouvement du rat, effectuez la fixation en enroulant simplement la fermeture auto-agrippante autour du rat sans utiliser de mesures supplémentaires pour sécuriser le tube.
3. Changez le tube jusqu’à ce que le poids maximum du rat soit atteint. Lorsque le rat atteint son poids maximum, il ne peut pas se tenir debout lorsqu’on le pousse ou que l’expérimentateur s’en va. Réduisez le poids de 10 g pour permettre au rat de se tenir debout. Ce poids représente la capacité de charge maximale du rat.

3. Préparation de la charge de poids

1. Étant donné qu’une fixation sûre est nécessaire pendant l’entraînement, fixez les objets à l’aide d’un ruban thérapeutique élastique de 1 à 1,5 m basé sur la taille d’un rat, qui a une forte adhérence. Utilisez de l’argile pour ajuster le poids des tubes à essai afin de réduire le balancement de la charge.
2. Après avoir pesé le poids des tubes à essai et des objets de fixation, ajoutez une quantité appropriée d’argile dans les tubes à essai pour les ajuster au poids cible. Utilisez une tige d’agitation en verre pour répartir uniformément l’argile à l’intérieur des tubes à essai. L’argile concentrée à une extrémité du tube à essai peut le faire se détacher facilement pendant l’entraînement.
3. Ajustez le poids total des tubes à essai et de l’argile ajustés à 50 % de la capacité de charge maximale du rat (figure 1A). En dépassant ce poids, il sera difficile pour le rat de terminer l’entraînement. N’ajustez pas à nouveau le poids de la charge jusqu’à la fin de l’expérience.

4. Etablissement de l’ostéonécrose induite par les stéroïdes du modèle de la tête fémorale

1. Utiliser la méthode méthylprednisolone associée à un lipopolysaccharide (LPS+MPS) pour l’établissement du modèle SONFH^16,17. Effectuer l’injection intrapéritonéale de LPS (20 μg/kg) à l’aide d’une aiguille standard située au milieu de l’abdomen du rat une fois toutes les 24 h, pour un total de 2 injections.
2. Après la dernière injection de LPS, injecter de la MPS (40 mg/kg) dans le muscle fessier unilatéral 24 h après une alimentation régulière et poursuivre les injections toutes les 24 h, en alternance entre les deux zones fessières, pour un total de trois injections.

5. Immobilisation en charge sans tension à l’aide d’un ruban thérapeutique élastique et d’un entraînement sur tapis roulant

1. Marquez la ligne médiane du dos du rat à 1-2 cm des deux côtés ; Il s’agit du point de référence pour la charge de poids. Assurez-vous que les marques sont correctement positionnées pour empêcher le rat de basculer ou d’entraver le mouvement pendant l’entraînement sur tapis roulant.
2. Avec un enquêteur fixant le rat à l’aide de gants, placez une main sous l’aisselle du rat pour sécuriser le membre antérieur et la mâchoire tandis que l’autre main sécurise les membres postérieurs et la queue. Évitez de forcer excessivement pour éviter le stress ou la suffocation (Figure 1B).
3. Collez le ruban thérapeutique élastique sur le tube à essai sans appliquer de tension pour fixer la charge sur le dos du rat. En cours d’enroulement, n’étirez pas le ruban thérapeutique élastique pour obtenir une fixation sans tension.
   REMARQUE : Le ruban thérapeutique élastique utilisé dans ce modèle est conçu pour le bandage pendant les activités physiques intenses, offrant une adhérence et une élasticité élevées¹⁸. En raison de sa grande élasticité, il réduit considérablement l’impact sur le mouvement du rat lorsqu’il rampe.
4. Demandez au deuxième enquêteur de fixer l’éprouvette sur le dos du rat, parallèlement à la colonne vertébrale du rat, avec la position de fixation basée sur les marques faites, c’est-à-dire à 1-2 cm de la ligne médiane des deux côtés du dos du rat.
5. Pour minimiser la souffrance du rat, réduire l’impact sur le mouvement du rat et diminuer la mortalité causée par la fixation, effectuez la fixation sans appliquer de tension. Collez le tube à essai avec le poids ajusté sur le ruban thérapeutique élastique, puis enroulez le tube à essai autour du corps du rat en utilisant une technique sans tension.
6. Assurez-vous d’une immobilisation sans tension et maintenez la longueur d’origine de la bande thérapeutique élastique sans l’étirer afin d’éviter tout effet néfaste sur la respiration et le mouvement du rat (Figure 1C).
7. Après avoir enroulé l’éprouvette autour du corps du rat, placez le rat dans un espace ouvert ou dans une seule cage, en surveillant sa respiration et sa direction. Si des signes de respiration rapide ou d’ouverture de la bouche apparaissent, relâchez rapidement le rat pour éviter la suffocation.
   1. L’immobilisation idéale permet au rat de se déplacer librement et d’effectuer des activités comme boire, soulever les membres antérieurs et se nourrir (Figure 1D). Si l’immobilisation n’est pas satisfaisante, relâchez temporairement et immobilisez à nouveau après 20 minutes pour minimiser le stress sur le rat dû aux stimuli d’immobilisation répétés.
8. Allumez la puissance et réglez le tapis de course sur 1 m/min avec une inclinaison de 0°. Le temps d’entraînement sur tapis roulant est de 30 min. Transférez doucement le rat sur le tapis roulant et démarrez le chronomètre.
9. Ne fournissez pas de stimulation supplémentaire au rat. Si le rat ne peut pas terminer l’entraînement de 30 minutes, placez-le dans une cage pour un repos de 10 minutes sans retirer la fixation.
   REMARQUE : Le ruban thérapeutique élastique utilisé dans cette étude a une excellente extensibilité et adhérence. Lorsqu’elle est correctement fixée sans tension, la fixation à long terme ne provoquera pas le détachement de l’éprouvette ou n’entraînera pas l’étouffement et la mort du rat.
10. Après l’entraînement, nettoyez les excréments et l’urine laissés par les rats et vaporisez de l’alcool pour éliminer l’odeur des animaux.
11. Évitez que les étapes ci-dessus ne soient vues par d’autres rats et manipulez les animaux aussi doucement que possible pour éviter que les animaux ne vocalisent, causant ainsi un stress traumatique aux autres rats.
12. Relâchez immédiatement le rat de sa fixation après avoir terminé l’entraînement (Figure 1E). Pendant la remise en liberté, utilisez les doigts pour appuyer sur la fourrure du rat afin de la protéger, minimisant ainsi la perte de fourrure pendant la remise en liberté (figure 1F).

6. Groupement des animaux

1. Pour étudier l’impact de l’entraînement à la mise en charge sur la SONFH, divisez au hasard 60 rats en quatre groupes.
2. Dans le groupe témoin, n’établissez pas le modèle commun d’ostéonécrose de la tête fémorale induite par les stéroïdes (SONFH) et n’effectuez pas d’entraînement à la mise en charge. Dans le groupe Contrôle+Charge, effectuez uniquement un entraînement de mise en charge, sans établir l’ostéonécrose induite par les stéroïdes du modèle de tête fémorale. Dans le groupe Modèle, établissez l’ostéonécrose induite par les stéroïdes du modèle de la tête fémorale uniquement. Dans le groupe Modèle+Charge, effectuez un entraînement de mise en charge après avoir établi l’ostéonécrose induite par les stéroïdes du modèle de tête fémorale.

7. Euthanasie et prélèvement d’échantillons

1. Placez les rats dans une chambre d’euthanasie pour petits animaux et injectez suffisamment de dioxyde de carbone pour atteindre une concentration supérieure à 5 %. Une fois que les rats ont perdu connaissance, administrer une dose de 0,3 mL/kg de poids corporel d’une solution de chlorure de potassium à 20 %, soit un total de 20 mL, par injection intracardiaque.
2. Surveillez la respiration et le rythme cardiaque des rats pour vous assurer qu’ils ne ressentent aucune douleur ou inconfort pendant l’euthanasie. Confirmez le décès en vérifiant l’absence de respiration et de rythme cardiaque. Vaporisez de l’alcool pour éliminer toute odeur.
3. Après l’euthanasie, disséquez la région de la hanche du rat et extrayez la tête fémorale tout en gardant le fémur intact. Effectuez un balayage microCT après le prétraitement, suivi d’une coloration à l’hématoxyline-éosine (HE).

8. Coloration à l’hématoxyline-éosine

1. Une fois la modélisation terminée, euthanasiez les rats. Retirez les fémurs pour la coloration HE.
2. Faites tremper les fémurs de rat dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h pour préserver les tissus biologiques sous forme de spécimens. Faites tremper les échantillons de fémur de rat dans de l’acide formique à 5% pour le détartrage pendant 5 jours.
3. Sectionner les échantillons en tranches de 5 μm pour la coloration HE.
   REMARQUE : Les lacunes vides font référence à la situation dans le tissu osseux¹⁹ où les lacunes, qui devraient normalement contenir des ostéocytes, sont dépourvues de ces cellules. Il s’agit d’un indicateur important pour évaluer la santé du tissu osseux. Dans le processus pathologique de nécrose osseuse, un apport sanguin insuffisant peut entraîner la mort des ostéocytes, entraînant des lacunes vides. Dans le diagnostic et l’évaluation de la nécrose osseuse, le nombre et la distribution des lacunes vides sont des paramètres importants pour mesurer la gravité de la maladie^20,21.
   1. Placez les échantillons fémoraux de rat dans de la paraffine fondue (56-60 °C), en les trempant d’abord dans de la paraffine à point de fusion bas, si nécessaire, puis transférez-les progressivement à de la paraffine à point de fusion plus élevé, chaque fois pendant environ 1 h, pour assurer une infiltration complète du tissu avec de la paraffine.
   2. Préparez les moules d’enrobage et versez la paraffine fondue dans les moules à la profondeur appropriée. Récupérez les échantillons de tissus de la paraffine à l’aide d’une pince après le trempage, retirez l’excès de paraffine et placez-les dans des moules. Refroidir à température ambiante pour solidifier la paraffine et former des blocs de paraffine.
   3. À l’aide d’un microtome de paraffine, coupez les blocs de paraffine encastrés en sections de 5 μm d’épaisseur.
4. Faites cuire les échantillons fémoraux de rat avec les tranches attachées dans un chauffe-lames pendant 1 h pour améliorer l’adhérence entre les tranches et la lamelle et réduire le flottement lors des processus de coloration ultérieurs.
5. Plongez les tranches cuites séquentiellement dans du xylène pur pour éliminer la paraffine, suivie d’une série de déshydratation à l’éthanol absolu, à l’éthanol dégradé (100 %, 95 %, 80 %, 70 %) et à l’eau, pendant 2 minutes chacune, complétant ainsi le processus de déparaffinisation et de réhydratation.
6. Plongez les tranches déparaffinisées dans une solution de coloration à l’hématoxyline et colorez-les pendant 10 min. Rincer à l’eau courante pour éliminer l’hématoxyline non liée.
7. Immergez les sections colorées à l’hématoxyline dans une solution de coloration à l’éosine et colorez pendant 2 minutes pour colorer le cytoplasme et le tissu conjonctif. Rincé avec une solution d’acide acétique à 1% pour fixer l’effet tachant.
8. Immergez les tranches d’échantillon d’os fémoral de rat séquentiellement dans de l’éthanol à 70 %, 80 %, 90 %, 95 % et 100 %, avec chaque gradient pendant 2 min, en éliminant progressivement l’humidité.
9. Immergez les tranches d’échantillon d’os fémoral de rat dans du xylène pur pour plus de transparence, puis rincez-les à l’eau courante pour éliminer le xylène. Appliquez de la résine de montage neutre, en recouvrant les lames, en tapotant doucement pour éliminer les bulles d’air et en laissant le support de montage se solidifier pour terminer le processus de montage.
10. À l’aide du package randomizr dans R, sélectionnez 30 lames colorées à l’HE pour chaque groupe et attribuez 15 lames à deux chercheurs. Sans les informer des regroupements, demandez aux chercheurs de calculer le taux de lacunes vides des lames et de recueillir les résultats pour une analyse statistique.

9. Analyse MicroCT

1. Une fois la modélisation terminée, euthanasiez les rats. Retirez les fémurs pour la coloration à l’hématoxyline-éosine.
2. Faites tremper les fémurs de rat dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h pour préserver les tissus biologiques sous forme de spécimens. Placez les fémurs de rat dans le petit appareil microCT spécifique à l’animal.
3. Réglez les conditions de balayage microCT comme suit : Tension des rayons X : 80 kV, Courant : 100 μA, Temps d’exposition unique : 50 ms, Résolution de balayage : 25 μm. Effectuez des scanners à des intervalles de 0,5°, en vous concentrant sur l’os trabéculaire du dessous du cartilage vers la partie supérieure de l’épiphyse comme région d’intérêt.
4. Définissez la zone au-dessus du col fémoral du rat comme la région d’intérêt.
5. Effectuez une reconstruction du plan coronal des résultats de balayage à l’aide d’un appareil microCT et collectez des mesures morphométriques osseuses générées par le logiciel intégré de l’appareil microCT. Enregistrez les indices observés suivants : volume total (TV), pourcentage de volume osseux (BV/TV), rapport surface/volume osseux (BS/BV), épaisseur de la structure (Tb.Th), séparation de la structure (Tb.Sp), nombre d’os (Tb.N), densité osseuse (BD).

10. Analyse statistique

1. Présentez les données sous forme de moyenne ± d’écart-type (ET). Effectuer des analyses statistiques pour des évaluations micro-CT et histologiques quantitatives à l’aide du test t de l’échantillon indépendant. Considérons qu’une valeur p < 0,05 est statistiquement significative.

Résultats

Analyse histopathologique
La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine a révélé que dans le groupe témoin et le groupe témoin + charge, les trabécules osseuses étaient intactes et disposées régulièrement. Les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins étaient présentes dans les fossettes osseuses et la morphologie cellulaire semblait dodue. En revanche, le groupe modèle et le groupe modèle+charge présentaient des trabécules osseuses fractur...

Discussion

Actuellement, divers animaux, tels que les lapins²⁵, les rats²⁶, les souris²⁷, les porcs²⁸, les poulets de chair²⁹, les autruches⁸ et les émeus³⁰ peuvent être utilisés pour établir des modèles de nécrose de la tête fémorale. Parmi eux, les rats, les souris et les lapins sont les espèces les plus couramment utilis?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
15ml centrifuge tube	Corning,USA	430791
5mm stainless steel bead	Gelisen,China	5mm
Acetic acid	Merck KGaA, Germany	64-19-7
Anhydrous alcohol	Merck KGaA, Germany	64-17-5
clay	Mincai stationery,China	102
Coverslip	Servicebio,China	WMWD-1818
Flat pressure bottle 10ml	BEHNCKE,China	MD10ml
Formic acid	Macklin Biochemical ,China	64-18-6
HE staining kit	Solarbio,China	G1120
HistoCore AUTOCUT	Leica, Germany	149AUTO00C1
Kinesio tape (elastic therapeutic tape)	Fuluo medicine,China	CL1819
Lipopolysaccharide	Solarbio,China	L8880
Lipopolysaccharides (LPS)	Selleck,USA	S7850
Manual carbon dioxide euthanasia box	Yuyan,China	LC-500-S1
Methylprednisolone sodium succinate,MPS	AbMole,China	M25573
MicroCT	Hiscan,China	Hiscan VM Pro
Neutral resin	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology l ,China	ZLI-9555
Paraffin	Servicebio,China	WGHB-319213129
Paraformaldehyde	Servicebio,China	G1101-500ML
Potassium chloride	Macklin Biochemical ,China	7447-40-7
Slide	Servicebio,China	WG6012
Treadmill for Rats and  mice	Litc Life Science,USA	801
Xylene	Macklin Biochemical ,China	1330-20-7