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Résumé

Un protocole pour la production et la culture de tranches de foie coupées avec précision (PCLS) pour l’étude des foies de souris. L’article se concentre sur les aspects clés du protocole, qui ne nécessite qu’un équipement de laboratoire standard avec accès à un vibratome et permet la survie du PCLS pendant un minimum de 4 jours.

Résumé

Ce protocole présente un système simple pour la création et la culture de tranches de foie coupées avec précision (PCLS). Le PCLS contient toutes les cellules dans un environnement intact et, par conséquent, ressemble à un mini-modèle de l’organe entier. Ils permettent d’étudier les tissus vivants tout en reproduisant leurs phénotypes complexes. Ce protocole permet la préparation de coupes à partir de foies de souris à l’aide d’un vibratome et d’un équipement de laboratoire standard. Les protocoles de production et de culture du PCLS manquent de standardisation et peuvent varier considérablement en fonction du tissu d’intérêt, du type de vibratome utilisé et du besoin d’oxygène. Ceux-ci peuvent être difficiles à reproduire dans certains laboratoires qui n’ont accès qu’à un vibratome de base et à des installations de culture de tissus communes. Nous avons mis au point un protocole axé sur l’importance de certaines étapes clés au sein des différents protocoles déjà disponibles. Ce protocole met donc l’accent sur l’importance de la méthode d’encastrement, de l’orientation de la coupe, d’un système dynamique versus statique, et de la pertinence d’un volume minimum de culture. Ce protocole peut être établi et reproduit de manière simple dans la plupart des laboratoires qui ont accès à un slicer tissulaire de base. Dans l’ensemble et en suivant ce protocole, le PCLS peut rester en vie pendant au moins 4 jours. Le PCLS est un modèle simple, économique et reproductible pour étudier le dépistage physiopathologique et thérapeutique d’organes tels que le foie.

Introduction

Les coupes de tissu découpées avec précision (PCTS) sont de fines sections d’organes. Ils permettent de préserver l’architecture de l’organe en répliquant un mini-organe tout en préservant l’aspect tridimensionnel des cellules voisines et de la matrice extracellulaire. Il s’agit d’un modèle attrayant en raison de sa facilité d’accès, de ses économies et de ses caractéristiques moins exigeantes en main-d’œuvre tout en préservant l’architecture tissulaire.

Les PCTS comblent un vide entre les études cellulaires in vitro et la recherche animale in vivo, en surmontant la plupart des inconvénients des deux modèles. La PCTS a été générée à partir de divers organes, tels que le foie1, les intestins 2,3, le côlon2, le cerveau 4,5, le poumon 6,7,8, le rein 9,10, la rate11,12, le cœur 13,14 mais aussi les tumeurs15,16. Ils peuvent également provenir de divers animaux, tels que la souris1, le rat17,18 mais aussi le porc19 et les déchets chirurgicaux humains 15,20,21. Bien que les PCTS nécessitent l’utilisation d’animaux, ce qui implique des problèmes éthiques, l’organe d’un animal peut générer plusieurs PCTS, réduisant ainsi le nombre d’animaux en accord avec les directives NC3R (Réduction, Remplacement, Raffinement)22 tout en limitant les variations interindividuelles.

La mise au point de trancheurs tissulaires améliorés, par exemple les vibratomes23, a permis de passer de tranches coupées manuellement caractérisées par une épaisseur hétérogène et un faible taux de survie à des tranches plus minces reproductibles avec une intégrité structurelle mieux préservée.

Cependant, les protocoles pour la préparation et la culture des PCTS et, plus précisément, des tranches de foie coupées avec précision (PCLS) varient considérablement dans la littérature et manquent de normalisation, en particulier pour des paramètres essentiels tels que l’équipement de tranchage, le contenu du milieu et les conditions de culture. Les protocoles peuvent également varier sensiblement en fonction du tissu d’origine. Certains des protocoles nécessiteront l’oxygénation du tampon ou de la culture avec des systèmes de bioréacteur compliqués24. Ils se concentrent généralement individuellement sur différents aspects techniques ou sont conçus pour différents tissus et peuvent souvent être coûteux et plus difficiles à reproduire dans un laboratoire moyen de manière rentable.

Ici, ce protocole rassemble quelques points clés tels que la méthode d’encastrement, le sens de coupe, l’utilisation de transwells25, un système de culture dynamique26 et l’importance d’un volume minimal de culture. Certaines de ces étapes ont déjà été optimisées indépendamment ou dans un contexte différent, comme la fibrose27 ou la réponse tumorale28. Ce protocole met également l’accent sur l’importance de l’enrobage à l’aide de certains types de slicers et de l’orientation de la coupe, deux paramètres difficiles à maîtriser et souvent négligés dans la littérature. Cette méthode simple génère des PCLS maintenus en culture pendant au moins 4 jours avec une installation facile et à l’aide d’un équipement de laboratoire standard avec accès à une trancheuse de tissus rudimentaire.

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Protocole

Des souris CD57Bl/6J de type sauvage ont été achetées aux Laboratoires Charles River. Les souris avaient un accès libre à la nourriture et à l’eau, logées dans des cages ventilées individuellement avec des conditions de température et d’humidité contrôlées et avec un cycle de lumière de 12 heures. Les animaux âgés de 3 semaines ont été sacrifiés, et les foies ont été rapidement récoltés sans perfusion. Tous les travaux sur les animaux ont été approuvés à la suite d’un examen éthique local par le Conseil d’examen et de bien-être des animaux de l’University College London et effectués dans le cadre d’une licence de projet du ministère de l’Intérieur PP9223137 et conformément à la loi sur les procédures scientifiques du ministère de l’Intérieur (animaux) (1986) et aux directives ARRIVE. Tous les efforts ont été déployés pour limiter les dommages causés aux animaux, conformément à la pratique courante de l’unité des services biologiques de l’University College London.

1. Préparez-vous à l’expérience

  1. La veille de la récolte, effectuez les étapes suivantes.
    1. Préparez 1 L de tampon Krebs-Henseleit (KREBS) en dissolvant un flacon de poudre Krebs dans 1 L d’eau stérile. Refroidissez-le à 4 °C et conservez-le sur de la glace humide.
    2. Désinfectez le plateau avec de l’éthanol à 70 % et rincez avec du PBS stérile. Conservez le plateau enveloppé dans du papier d’aluminium au réfrigérateur pendant la nuit pour aider à maintenir un environnement froid pendant la coupe.
    3. Vaporisez toutes les autres pièces amovibles avec de l’éthanol, rincez avec du PBS stérile, laissez sécher et maintenez-les stériles. Autoclavez les lames et maintenez-les stériles jusqu’à utilisation.
    4. Préparez de l’agarose à bas point de fusion à 4 % p/v dans de l’eau stérile. Une fois remis en suspension et fondu, conservez l’agarose au réfrigérateur à 4 °C.
  2. Le jour de la récolte et avant la récolte du foie, effectuez les étapes suivantes.
    1. Faites fondre l’agarose à bas point de fusion à 4 % et conservez-la dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à utilisation. Assurez-vous que l’agarose a refroidi à 37 °C et que toutes les bulles se sont dissipées avant utilisation.
    2. Préparez les plaques de culture en ajoutant respectivement 2,6 ml, 1,5 ml et 0,7 ml par puits dans des plaques de 6, 12 et 24 puits. Ajoutez des inserts poreux de 8 μm dans chaque puits. Placez les plaques dans un incubateur humidifié réglé à 37 °C, 5 % de CO2 et 21 % de niveau O2 . Cela aidera à ajuster le pH tout en réchauffant le substrat, afin qu’il soit prêt pour la culture.
    3. Cultivez les tranches avec des inserts poreux de 8 μm pour permettre l’accès aux deux faces de la tranche. Préparez le milieu comme suit : Ajoutez-le au milieu E de William’s (WME), à 2 mM de supplément de L-glutamine, à 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), à 100 μg/mL de pénicilline, à 100 μg/mL de streptomycine, à 10 μg/mL de gentamycine, à 25 mM de solution de D-glucose et à 15 mM de solution d’HEPES.

2. Prélèvement du foie et préparation (15 min)

  1. Stérilisez tous les instruments avant la récolte.
  2. Anesthésier la souris selon les procédures locales pour le soin des animaux à des fins scientifiques à l’aide d’un masque isoflurane. Avant d’ouvrir la cavité abdominale, pincez entre les orteils pour vous assurer que l’animal est correctement anesthésié. Si le foie peut être retiré rapidement, la souris peut être euthanasiée par asphyxie au CO2 ou luxation cervicale. Comme il s’agit d’une procédure terminale, n’utilisez pas de pommade oculaire car cela n’affecterait pas l’animal.
  3. Vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Facultatif : Rasez la souris pour éviter la contamination par les poils.
  4. Ouvrez la cavité abdominale à l’aide d’une pince stérile et de ciseaux en coupant la peau et le péritoine à partir du milieu de l’abdomen. Disséquez doucement le foie des autres organes ou vaisseaux et évitez d’endommager les lobes.
  5. Conservez immédiatement le foie entier dans un tampon Krebs glacé. Effectuez toutes les étapes suivantes sur la glace à 4 °C et procédez à la préparation du foie le plus rapidement possible pour éviter une nouvelle mort cellulaire.

3. Enrobage des lobes hépatiques (25 min pour chaque lobe hépatique)

  1. Transférez le foie dans une boîte de Pétri sur de la glace contenant un tampon Krebs glacé, en vous assurant que tout le foie est complètement immergé.
  2. Séparez chaque lobe individuellement à l’aide d’une pince émoussée et d’un couteau tranchant et stérile pour éviter d’endommager les lobes.
  3. Choisissez le premier lobe pour la section et conservez les lobes restants dans un tampon Krebs glacé jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’enrobage et le tranchage.
  4. Coupez tous les bords pour obtenir un lobe plus facile à gérer avec des bords droits prêts à être intégrés. Cela aidera également à retirer une partie de la capsule fibreuse de Glisson pour faciliter davantage la section. Faites-le tout en gardant les surfaces du foie humides dans un tampon Krebs glacé.
  5. Placez une boîte de Pétri de 3 cm (ou similaire) sur de la glace humide et versez-y l’agarose à bas point de fusion à 4 % (déjà dans un bain-marie à 37 °C). Conservez bien sur de la glace pour permettre à l’agarose de refroidir vers le haut tout en empêchant le lobe de s’enfoncer au fond et en l’incrustant uniformément.
  6. Laissez l’agarose refroidir pendant 30 secondes et placez-y le lobe taillé. Le lobe va se déposer au milieu du bloc d’agarose. Le processus d’intégration nécessite de la pratique et de l’optimisation pour s’adapter à chaque condition de laboratoire et à chaque expérience personnelle.
  7. Placez le lobe encastré, toujours sur de la glace, au réfrigérateur pendant 5 min. L’agarose doit alors être clairement pris.
  8. Coupez l’extérieur du bloc d’agarose. Délogez le bloc d’agarose du plat.
  9. Coupez l’agarose à une taille plus gérable, en veillant à ce que la face supérieure et la face collée à la plate-forme du vibratome soient parallèles au bord supérieur du lobe.
  10. Commencez le processus de tranchage le plus rapidement possible, mais assurez-vous que le bloc d’agarose est conservé dans un tampon Krebs glacé et sur de la glace.

4. Production de tranches de foie (40 min par lobe)

  1. Réglez le vibratome pour la coupe à une épaisseur de 250 μm, avec une vitesse de 5 et une fréquence de 7 Hz. Ce sont des paramètres directeurs ; Selon le type de vibratome utilisé, cela peut nécessiter une optimisation.
  2. Vaporisez le vibratome et la paillasse avec de l’éthanol à 70 % avant la coupe pour garder l’environnement aussi stérile que possible.
  3. Placez le plateau sur le vibratome et versez de la glace tout autour. Placez les lames sur le vibratome à un angle de 10° vers le bas et en dessous de l’horizontale.
  4. Remplissez le réservoir du vibratome avec un tampon Krebs glacé. Placez une fine couche de colle cyanoacrylate sur la plate-forme.
  5. Séchez le bord du bloc d’agarose qui sera collé sur la plate-forme à l’aide d’un tissu absorbant stérile.
  6. Placez le bloc d’agarose sur la plate-forme amovible. Positionnez le lobe à la verticale pour lui permettre d’être coupé transversalement. Bien que la taille des tranches soit réduite, cela facilite considérablement le processus de coupe en limitant la pression contre le lobe pendant la coupe.
  7. Attendez 1 min que la colle prenne et immergez la plate-forme amovible dans le réservoir et assurez-vous que le bloc d’agarose est complètement recouvert d’un tampon Krebs.
  8. Programmez le vibratome pour la coupe en réglant les positions de démarrage et d’arrêt. Commencez par couper des tranches plus épaisses jusqu’à ce que le lobe du foie soit atteint.
  9. Jetez la première tranche, car elle pourrait ne pas être coupée à la bonne épaisseur. Pour éviter d’endommager les tranches, utilisez une spatule pour recueillir les tranches de foie au lieu de pinces ou de brosses.
    REMARQUE : Une petite brosse désinfectée à 70 % d’éthanol et rincée avec du PBS stérile peut également être utilisée pour guider doucement le tissu pendant le processus de coupe.
  10. Répétez le processus jusqu’à ce que le nombre requis de tranches soit atteint. Le lobe peut parfois se déloger de l’agarose, empêchant toute utilisation ultérieure. Recueillir les tranches dans un tampon Krebs glacé jusqu’à la culture.

5. Incubation de tranches de foie

  1. Transférez les tranches, à l’aide d’une spatule, dans les puits préparés contenant le milieu et les inserts.
  2. Placez les plaques sur un agitateur orbital, réglez la vitesse à 130 tr/min et incubez à l’aide d’un incubateur de culture cellulaire conventionnel avec 5 % de CO2 et 21 % d’O2 à 37 °C. Le volume final de culture est de 2,6 ml, 1,5 ml et 0,7 ml par puits dans des plaques de 6, 12 et 24 puits, respectivement.
  3. Placez une plaque vide sous la plaque de culture contenant les tranches en culture pour permettre à toute chaleur excessive provenant de la plate-forme de l’agitateur de se dissiper. Changez de milieu toutes les 48 h.

6. Essai de survie cellulaire

  1. Transférez les tranches dans une plaque à 48 puits contenant 400 μL de média complet Williams’s Medium E préchauffé et ajoutez 80 μL de réactif de tétrazolium MTS (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxyméthoxyphényl)-2-(4-sulfophényl)-2H-tétrazolium).
  2. Après une incubation de 1 h à 37 °C, 5 % de CO2 dans un agitateur, transvaser 200 μL de milieu dans une plaque à 96 puits et mesurer l’absorbance à 490 nm à l’aide d’un lecteur de plaques multipuits. Utilisez des tranches laissées sur la paillasse dans du PBS et à température ambiante pendant 24 h comme témoins négatifs.

7. Coloration histologique

  1. Déparaffiniser et réhydrater les sections à l’aide de xylène et d’éthanol, puis d’eau déminéralisée. Colorer les sections avec une solution d’hématoxyline pendant 3 min.
  2. Rincer à l’eau déminéralisée pendant 5 min. Trempez rapidement 10 fois dans de l’éthanol acide (1 mL de HCL concentré et 400 mL d’éthanol à 70 %).
  3. Rincez 2 fois à l’eau déminéralisée et épongez l’excès d’eau. Trempez les tronçons dans Eosin pendant 30 s.
  4. Déshydrater en éthanol à 95 %, puis à 100 % d’éthanol pendant 5 min, 3 fois chacun. Tremper les sections dans le xylène 3x pendant 15 minutes chacune. Placez les lamelles sur les diapositives.

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Résultats

Lors de la récolte, la perfusion de l’animal est délibérément omise pour assurer un traitement rapide de l’organe et éviter les lésions organiques. Le foie est extrait rapidement après l’incision et immédiatement placé dans un tampon protecteur d’organe glacé, par exemple le tampon Krebs24,29. Bien que le tranchage de tissu hépatique frais sans enrobage aitété décrit précédemment1, ...

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Discussion

Nous démontrons que la production et la culture de PCLS peuvent être facilement réalisées tout en assurant une demi-vie d’au moins 4 jours. Ce protocole récapitule cinq étapes critiques : la méthode d’encastrement si ce type de vibratome est utilisé, l’orientation de la coupe, un système dynamique de culture, un volume minimal de culture et l’utilisation d’inserts.

Des protocoles pour la production et la culture du PCLS sont couramment dispo...

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Déclarations de divulgation

Il n’y a aucun intérêt concurrent à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Mirabela Bandol, Samantha Richards, Louise Fisher, Rebecca Towns et le personnel des services biologiques de l’UCL pour leur aide dans la reproduction et l’entretien des colonies animales. Ce travail a été soutenu par le financement de la bourse MR/T008024/1 (JB) du Medical Research Council du Royaume-Uni et du Centre de recherche biomédicale (JB) du NIHR Great Ormond Street Hospital. Les opinions exprimées sont celles de l’auteur ou des auteurs et ne sont pas nécessairement celles du NHS ou du NIHR.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
3 cm petri dishAnyany suitable for cell culture
6, 12, 24 well culture plateAnyany suitable for cell culture
Cyanoacrylate super glueAny
D-GlucoseGibcoA24940
EosinMerckHT110316
EthanolAny
Fetal Bovine serumThermoFisher26400044
Gentamycin Gibco15750060
HematoxylinMerck51275
HEPESGibcoH0887
inserts 8um, for 12 well platesStrastedt83.3931.800
inserts 8um, for 24 well platesStrastedt83.3932.800
inserts 8um, for 6 well platesStrastedt83.3930.800
KREBSMerckK3753
Laminar Flow HoodHepa air filtration
Low melting agarose ThermoFisher16520050
MTS tetrazolium reagent Abcamab197010
multi-well plate reader Any
PBS tabletsThermoFisherP4417
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122
Scalpel bladeAny
Surgical forcepsAnywith a flat square-tip 
Surgical scissorsAny
VibratomeLeicaVT1000 S
William’s Medium E with GlutaMAX (WME)ThermoFisherW4125

Références

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