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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Un protocollo per la produzione e la coltura di fette di fegato tagliate con precisione (PCLS) per lo studio dei fegati di topo. L'articolo si concentra sugli aspetti chiave del protocollo, che richiede solo attrezzature di laboratorio standard con accesso a un vibratomo e consente la sopravvivenza del PCLS per un minimo di 4 giorni.

Abstract

Questo protocollo presenta un sistema semplice per la creazione e la coltura di fette di fegato tagliate con precisione (PCLS). La PCLS contiene tutte le cellule in un ambiente intatto e, quindi, assomiglia a un mini modello dell'intero organo. Consentono lo studio di tessuti vivi replicando i loro fenotipi complessi. Questo protocollo consente la preparazione di fette di fegati di topo utilizzando un vibratomo e attrezzature di laboratorio standard. I protocolli per la produzione e la coltura di PCLS mancano di standardizzazione e possono variare drasticamente a seconda del tessuto di interesse, del tipo di vibratomo utilizzato e della necessità di ossigeno. Questi possono essere difficili da riprodurre in alcuni laboratori che hanno accesso solo a un vibratomo di base e a comuni strutture di coltura tissutale. Abbiamo messo insieme un protocollo incentrato sull'importanza di alcuni passaggi chiave all'interno dei vari protocolli già disponibili. Questo protocollo, quindi, sottolinea l'importanza del metodo di inclusione, l'orientamento del taglio, un sistema dinamico rispetto a uno statico e l'importanza di un volume minimo di coltura. Questo protocollo può essere stabilito e riprodotto in modo semplice nella maggior parte dei laboratori che hanno accesso a un'affettatrice di tessuti di base. Nel suo insieme e seguendo questo protocollo, la PCLS può rimanere in vita per un minimo di 4 giorni. La PCLS è un modello semplice, economico e riproducibile per studiare lo screening fisiopatologico e terapeutico di organi come il fegato.

Introduzione

Le fette di tessuto tagliate con precisione (PCTS) sono sezioni sottili di organi. Consentono la conservazione dell'architettura dell'organo replicando un mini-organo preservando l'aspetto tridimensionale delle cellule vicine e della matrice extracellulare. Si tratta di un modello interessante grazie alla sua facile accessibilità, al risparmio sui costi e alle caratteristiche meno laboriose, preservando al contempo l'architettura dei tessuti.

I PCTS colmano una lacuna tra gli studi su cellule in vitro e la ricerca in vivo sugli animali, superando la maggior parte degli svantaggi di entrambi i modelli. La PCTS è stata generata da vari organi, come il fegato1, l'intestino 2,3, il colon2, il cervello 4,5, il polmone 6,7,8, il rene 9,10, la milza11,12, il cuore13,14 ma anche i tumori15,16. Possono anche provenire da vari animali, come il topo1, il ratto17,18 ma anche il maiale19 e i rifiuti chirurgici umani 15,20,21. Sebbene la PCTS richieda l'uso di animali, il che implica problemi etici correlati, l'organo di un animale può generare più PCTS, riducendo così il numero di animali in accordo con le linee guida NC3Rs (Reduction, Replacement, Refinement)22 limitando al contempo le variazioni interindividuali.

Lo sviluppo di affettatrici tissutali migliorate, ad esempio i vibratomi23, ha permesso una transizione da fette tagliate manualmente caratterizzate da spessore eterogeneo e scarso tasso di sopravvivenza a fette più sottili riproducibili con un'integrità strutturale meglio conservata.

Tuttavia, i protocolli per la PCTS e, più specificamente, la preparazione e la coltura di fette di fegato tagliate con precisione (PCLS) variano in modo significativo in letteratura e mancano di standardizzazione, soprattutto per parametri essenziali come l'attrezzatura per l'affettatura, il contenuto medio e le condizioni di coltura. I protocolli possono anche variare notevolmente a seconda del tessuto di origine. Alcuni dei protocolli richiederanno l'ossigenazione del tampone o della coltura con alcuni complicati sistemi di bioreattori24. Di solito si concentrano individualmente su diversi aspetti tecnici o sono progettati per tessuti diversi e spesso possono essere costosi e più difficili da riprodurre in un laboratorio medio in modo economico.

Qui, questo protocollo mette insieme alcuni punti chiave come il metodo di inclusione, la direzione di taglio, l'uso di transwells25, un sistema di coltura dinamico26 e l'importanza di un volume minimo di coltura. Alcuni di questi passaggi sono stati precedentemente ottimizzati in modo indipendente o in un contesto diverso, come la fibrosi27 o la risposta tumorale28. Questo protocollo sottolinea anche l'importanza dell'incorporamento utilizzando determinati tipi di affettatrici e l'orientamento del taglio, entrambi parametri difficili da padroneggiare e spesso trascurati in letteratura. Questo semplice metodo genera PCLS mantenuti in coltura per un minimo di 4 giorni con una facile configurazione e utilizzando attrezzature di laboratorio standard con accesso a un'affettatrice rudimentale per tessuti.

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Protocollo

I topi CD57Bl/6J wild-type sono stati acquistati dai Charles River Laboratories. I topi avevano libero accesso a cibo e acqua, alloggiati in gabbie ventilate individualmente con condizioni di temperatura e umidità controllate e con un ciclo di luce di 12 ore. Gli animali di 3 settimane venivano sacrificati e i fegati venivano prontamente raccolti senza perfusione. Tutti i lavori sugli animali sono stati approvati a seguito di una revisione etica locale da parte dell'University College London Animal Welfare and Ethical Review Board ed eseguiti sotto licenza del Ministero degli Interni PP9223137 e in conformità con l'Home Office (Animals) Scientific Procedures Act (1986) e le linee guida ARRIVE. Sono stati compiuti tutti gli sforzi per limitare i danni agli animali in conformità con la pratica standard presso l'Unità dei servizi biologici dell'University College di Londra.

1. Preparati per l'esperimento

  1. Il giorno prima della raccolta, eseguire i seguenti passaggi.
    1. Preparare 1 L di tampone Krebs-Henseleit (KREBS) sciogliendo un flaconcino di polvere di Krebs in 1 L di acqua sterile. Raffreddarlo a 4 °C e tenerlo su ghiaccio bagnato.
    2. Disinfettare la vaschetta con etanolo al 70% e risciacquare con PBS sterile. Conservare la teglia avvolta nella carta stagnola in frigorifero per una notte per mantenere un ambiente freddo durante il taglio.
    3. Spruzzare tutte le altre parti rimovibili con etanolo, risciacquare con PBS sterile, lasciare asciugare e mantenerle sterili. Autoclavare le lame in autoclave e mantenerle sterili fino al momento dell'uso.
    4. Preparare l'agarosio a basso punto di fusione al 4% p/v in acqua sterile. Una volta risospeso e sciolto, conservare l'agarosio in frigorifero a 4 °C.
  2. Il giorno della raccolta e prima della raccolta del fegato, eseguire i seguenti passaggi.
    1. Sciogliere l'agarosio al 4% a basso punto di fusione e tenerlo a bagnomaria a 37 °C fino al momento dell'utilizzo. Assicurarsi che l'agarosio si sia raffreddato a 37 °C e che tutte le bolle si siano dissipate prima dell'uso.
    2. Preparare le piastre di coltura aggiungendo rispettivamente 2,6 mL, 1,5 mL e 0,7 mL per pozzetto in piastre da 6, 12 e 24 pozzetti. Aggiungere inserti porosi da 8 μm a ciascun pozzetto. Posizionare le piastre in un incubatore umidificato impostato a 37 °C, 5% di CO2 e 21% di O2 . Questo aiuterà a regolare il pH mentre si riscalda il terreno, in modo che sia pronto per la coltura.
    3. Coltiva le fette con inserti porosi da 8 μm per consentire l'accesso a entrambe le facce della fetta. Preparare il terreno come segue: aggiungere al William's Medium E (WME), 2 mM di integratore di L-glutammina, 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina, 10 μg/mL di gentamicina, 25 mM di soluzione di D-glucosio e 15 mM di soluzione HEPES.

2. Raccolta del fegato e preparazione (15 min)

  1. Sterilizzare tutti gli strumenti prima del raccolto.
  2. Anestetizzare il topo secondo le procedure locali per la cura degli animali per scopi scientifici utilizzando una maschera di isoflurano. Prima di aprire la cavità addominale, pizzicare tra le dita dei piedi per assicurarsi che l'animale sia adeguatamente anestetizzato. Se il fegato può essere rimosso rapidamente, il topo può essere soppresso mediante asfissia da CO2 o lussazione cervicale. Poiché la procedura è una procedura terminale, non usare unguento per gli occhi in quanto ciò non influenzerebbe l'animale.
  3. Spruzzare l'addome con etanolo al 70%. Opzionale: radere il mouse per evitare la contaminazione con i peli.
  4. Aprire la cavità addominale con pinze sterili e forbici tagliando la pelle e il peritoneo dal centro dell'addome. Sezionare delicatamente il fegato da altri organi o vasi sanguigni ed evitare di danneggiare i lobi.
  5. Conservare immediatamente l'intero fegato in Krebs Buffer ghiacciato. Eseguire tutti i passaggi successivi sul ghiaccio a 4 °C e procedere alla preparazione del fegato il più rapidamente possibile per prevenire un'ulteriore morte cellulare.

3. Incorporazione dei lobi epatici (25 minuti per ogni lobo epatico)

  1. Trasferire il fegato in una capsula di Petri con ghiaccio contenente tampone Krebs ghiacciato, assicurandosi che l'intero fegato sia completamente sommerso.
  2. Separa ogni lobo individualmente usando una pinza smussata e un coltello affilato e sterile per evitare di danneggiare i lobi.
  3. Scegli il primo lobo per il sezionamento e conserva i lobi rimanenti in un tampone Krebs ghiacciato fino a quando non sono pronti per l'inclusione e l'affettatura.
  4. Taglia tutti i bordi per ottenere un lobo più maneggevole con bordi dritti pronti per l'incorporamento. Questo aiuterà anche a rimuovere parte della capsula fibrosa di Glisson per facilitare ulteriormente il sezionamento. Fallo mantenendo le superfici del fegato bagnate in un tampone Krebs ghiacciato.
  5. Posizionare una capsula di Petri da 3 cm (o simile) su ghiaccio umido e versarvi l'agarosio a basso punto di fusione al 4% (già a bagnomaria a 37 °C). Tenere bene in ghiaccio per consentire all'agarosio di raffreddarsi verso l'alto, evitando che il lobo affondi sul fondo e lo incastri uniformemente.
  6. Lasciare raffreddare ulteriormente l'agarosio per 30 secondi e inserirvi il lobo tagliato. Il lobo si sistemerà al centro del blocco di agarosio. Il processo di incorporamento richiede pratica e ottimizzazione per adattarsi a ogni condizione di laboratorio ed esperienza personale.
  7. Mettere il lobo incorporato, ancora sul ghiaccio, in frigorifero per 5 minuti. L'agarosio dovrebbe quindi essere chiaramente fissato.
  8. Taglia l'esterno del blocco di agarosio. Staccare il blocco di agarosio dal piatto.
  9. Tagliare l'agarosio in una dimensione più maneggevole, assicurandosi che il lato superiore e il lato incollato alla piattaforma del vibratomo siano paralleli al bordo superiore del lobo.
  10. Iniziare il processo di affettatura il più rapidamente possibile, ma assicurarsi che il blocco di agarosio sia conservato in un tampone Krebs ghiacciato e sul ghiaccio.

4. Produzione di fette di fegato (40 minuti per lobo)

  1. Impostare il vibratomo per il taglio a uno spessore di 250 μm, con una velocità di 5 e una frequenza di 7 Hz. Questi sono parametri guida; A seconda del tipo di vibratomo utilizzato, questo potrebbe richiedere un'ottimizzazione.
  2. Spruzzare il vibratomo e le aree del banco con etanolo al 70% prima del taglio per mantenere l'ambiente il più sterile possibile.
  3. Posiziona la teglia sul vibratomo e versa del ghiaccio tutto intorno. Posizionare le lame sul vibratomo con un angolo di 10° verso il basso e al di sotto dell'orizzontale.
  4. Riempire il serbatoio del vibratomo con il tampone Krebs ghiacciato. Posizionare uno strato sottile di colla cianoacrilica sulla piattaforma.
  5. Asciugare il bordo del blocco di agarosio che verrà incollato sulla piattaforma utilizzando un fazzoletto assorbente sterile.
  6. Posizionare il blocco di agarosio sulla piattaforma rimovibile. Posizionare il lobo in posizione verticale per consentirne il taglio trasversale. Sebbene la dimensione delle fette sia ridotta, questo facilita drasticamente il processo di taglio limitando la pressione contro il lobo durante il taglio.
  7. Attendere 1 minuto affinché la colla si solidifichi e immergere la piattaforma rimovibile nel serbatoio e assicurarsi che il blocco di agarosio sia completamente coperto con tampone Krebs.
  8. Programmare il vibratomo per il taglio impostando le posizioni di avvio e di arresto. Inizia a tagliare inizialmente le fette più spesse fino a raggiungere il lobo del fegato.
  9. Scartare la prima fetta, poiché potrebbe non essere tagliata allo spessore corretto. Per evitare di danneggiare le fette, usa una spatola per raccogliere le fette di fegato invece di pinze o spazzole.
    NOTA: Una piccola spazzola disinfettata con etanolo al 70% e risciacquata con PBS sterile può essere utilizzata anche per guidare delicatamente il tessuto durante il processo di taglio.
  10. Ripetere il processo fino a raggiungere il numero di fette richiesto. Il lobo potrebbe occasionalmente staccarsi dall'agarosio, impedendone un ulteriore utilizzo. Raccogli le fette nel tampone Krebs ghiacciato fino alla cottura.

5. Incubazione di fette di fegato

  1. Trasferire le fette, con l'aiuto di una spatola, nei pozzetti preparati contenenti il terreno e gli inserti.
  2. Posizionare le piastre su un agitatore orbitale, impostare la velocità a 130 giri/min e incubare utilizzando un incubatore per colture cellulari convenzionale con il 5% di CO2 e il 21% di O2 a 37 °C. Il volume finale di coltura è di 2,6 mL, 1,5 mL e 0,7 mL per pozzetto in piastre da 6, 12 e 24 pozzetti, rispettivamente.
  3. Posizionare una piastra vuota sotto la piastra di coltura contenente le fette di coltura per consentire la dissipazione del calore eccessivo proveniente dalla piattaforma dell'agitatore. Cambiare il supporto ogni 48 ore.

6. Saggio di sopravvivenza cellulare

  1. Trasferire le fette in una piastra a 48 pozzetti contenente 400 μl di terreno completo Williams' Medium E preriscaldato e aggiungere 80 μl di reagente MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carbossimetossifenil)-2-(4-solfofenil)-2H-tetrazolio) tetrazolio.
  2. Dopo l'incubazione per 1 ora a 37 °C, il 5% di CO2 su un agitatore, trasferire 200 μL di terreno in una piastra a 96 pozzetti e misurare l'assorbanza a 490 nm utilizzando un lettore di piastre a più pozzetti. Utilizzare le fette lasciate sul banco in PBS e a temperatura ambiente per 24 h come controlli negativi.

7. Colorazione istologica

  1. Deparaffinare e reidratare le sezioni utilizzando xilene ed etanolo, seguiti da acqua deionizzata. Colorare le sezioni con la soluzione di ematossilina per 3 minuti.
  2. Risciacquare con acqua deionizzata per 5 min. Immergere rapidamente 10 volte in etanolo acido (1 mL di HCL concentrato e 400 mL di etanolo al 70%).
  3. Sciacquare 2 volte in acqua deionizzata e asciugare l'acqua in eccesso. Immergere le sezioni in Eosin per 30 s.
  4. Disidratare in etanolo al 95%, quindi in etanolo al 100% per 5 minuti, 3 volte ciascuno. Immergere le sezioni nello xilene 3 volte per 15 minuti ciascuna. Posizionare i vetrini coprioggetti sui vetrini.

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Risultati

Al momento del prelievo, la perfusione dell'animale viene volutamente omessa per garantire una rapida elaborazione dell'organo e prevenire danni agli organi. Il fegato viene estratto rapidamente dopo l'incisione e immediatamente posto in un tampone protettivo per organi ghiacciato, ad esempio il tampone Krebs24,29. Sebbene l'affettatura del tessuto epatico fresco senza inclusione sia stata precedentemente descritta

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Discussione

Dimostriamo che la produzione e la coltura di PCLS possono essere facilmente ottenute garantendo un'emivita di almeno 4 giorni. Questo protocollo ricapitola cinque passaggi critici: il metodo di inclusione se si utilizza questo tipo di vibratomo, l'orientamento del taglio, un sistema dinamico di coltura, un volume minimo di coltura e l'uso di inserti.

I protocolli per la produzione e la coltura di PCLS sono comunemente disponibili. Tuttavia, mancano di standar...

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Divulgazioni

Non vi è alcun interesse concorrente da divulgare.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Mirabela Bandol, Samantha Richards, Louise Fisher, Rebecca Towns e lo staff dell'UCL Biological Services per il loro aiuto nell'allevamento e nel mantenimento delle colonie animali. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Medical Research Council del Regno Unito Clinician Scientist Fellowship MR/T008024/1 (JB) e del NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre (JB). Le opinioni espresse sono quelle dell'autore o degli autori e non necessariamente quelle del NHS o del NIHR.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
3 cm petri dishAnyany suitable for cell culture
6, 12, 24 well culture plateAnyany suitable for cell culture
Cyanoacrylate super glueAny
D-GlucoseGibcoA24940
EosinMerckHT110316
EthanolAny
Fetal Bovine serumThermoFisher26400044
Gentamycin Gibco15750060
HematoxylinMerck51275
HEPESGibcoH0887
inserts 8um, for 12 well platesStrastedt83.3931.800
inserts 8um, for 24 well platesStrastedt83.3932.800
inserts 8um, for 6 well platesStrastedt83.3930.800
KREBSMerckK3753
Laminar Flow HoodHepa air filtration
Low melting agarose ThermoFisher16520050
MTS tetrazolium reagent Abcamab197010
multi-well plate reader Any
PBS tabletsThermoFisherP4417
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122
Scalpel bladeAny
Surgical forcepsAnywith a flat square-tip 
Surgical scissorsAny
VibratomeLeicaVT1000 S
William’s Medium E with GlutaMAX (WME)ThermoFisherW4125

Riferimenti

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