Capture des ruptures de sites fragiles communes par γH2A natif. X ChIP

Résumé

Nous présentons une méthode rapide et efficace pour détecter les ruptures de sites fragiles courants grâce à l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) γH2A.X native. Cette approche réduit considérablement le temps et la main-d’œuvre associés aux tests traditionnels γH2A.X ChIP tout en maintenant une reproductibilité et une fiabilité élevées des résultats.

Résumé

Le stress de réplication induit par l’exposition à des agents extrinsèques peut entraîner des cassures de l’ADN au niveau de sites fragiles communs, qui sont des régions du génome connues pour être sujettes à l’instabilité structurelle. Le test d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) γH2A.X est un outil puissant dans les études de génotoxicité, car la phosphorylation de γH2A.X est un marqueur bien établi des cassures double brin de l’ADN. Cependant, les tests traditionnels de γH2A.X ChIP nécessitent souvent beaucoup de main-d’œuvre et impliquent plusieurs étapes chronophages. Dans cette étude, nous présentons une méthode simplifiée mais efficace qui combine le fractionnement subcellulaire avec la ChIP native pour isoler les complexes associés à γH2A.X. Cette approche est particulièrement adaptée à l’analyse des interactions γH2A.X-chromatine avec une spécificité et une efficacité accrues. En utilisant le fractionnement subcellulaire, les matériaux non liés à la chromatine sont efficacement éliminés, ce qui donne une fraction de chromatine purifiée. La digestion ultérieure des nucléases micrococciques (MNase) dans des conditions douces permet la fragmentation de la chromatine tout en préservant les interactions physiologiques entre γH2A.X et ses complexes protéiques associés. Cette préservation est essentielle pour l’étude des partenaires d’interaction indigènes impliqués dans les voies de réponse aux dommages de l’ADN. Ce protocole ChIP natif optimisé réduit considérablement le temps et la main-d’œuvre associés aux tests ChIP γH2A.X conventionnels. La procédure rationalisée simplifie non seulement le flux de travail, mais donne également des résultats hautement reproductibles, ce qui la rend particulièrement avantageuse dans les environnements où le traitement à haut débit de plusieurs échantillons est requis. Cette méthode a une large applicabilité dans les études axées sur la stabilité du génome, la réparation de l’ADN et la biologie de la chromatine, où une détection précise et efficace des sites de dommages à l’ADN est essentielle. En utilisant des protocoles optimisés et des étapes simplifiées, cette méthode permet de détecter les dommages à l’ADN sur les sites fragiles avec une sensibilité améliorée et une manipulation minimale des échantillons, ce qui en fait un outil précieux pour les études sur la stabilité du génome et la réponse aux dommages à l’ADN.

Introduction

Les sites fragiles communs (SFC) sont de grandes régions chromosomiques présentes sur chaque chromosome humain susceptibles de se rompre pendant la métaphase. En cas de stress de réplication, la réplication dans ces régions est considérablement retardée, ce qui empêche leur duplication complète avant l’entrée mitotique¹, ce qui entraîne finalement des lacunes et des ruptures spécifiques au site. Les SFC sont des points chauds d’instabilité chromosomique et sont une cause majeure de réarrangements chromosomiques au cours du développement précoce du cancer. Le stress de réplication, qui est souvent présent dans des conditions tumorigènes, peut entraîner la perte de gènes suppresseurs de tumeurs et l’amplification d’oncogènes, collectivement appelés variation du nombre de copies (CNV)2,3,4,5,6. De plus, les SFC sont très sujets à l’intégration virale, ce qui favorise davantage le développement du cancer 7,8,9,10. De multiples délétions homozygotes de gènes suppresseurs de tumeurs ont été détectées dans les régions du SFC lors d’analyses pancancéreuses de tumeurs primaires. Les SFC les plus fréquemment touchés par le cancer sont FRA2F, FRA3B, FRA4F, FRA5H et FRA16D¹¹. Les SFC sont particulièrement vulnérables à la casse en présence d’agents cancérigènes extrinsèques¹². Pour évaluer les effets cancérogènes néfastes des contaminants environnementaux, il est nécessaire de disposer d’une méthode rapide et fiable pour quantifier l’occurrence des ruptures de SFC.

Phosphorylation de H2A. X au niveau du résidu sérine 139 (γH2A.X) par l’ataxie télangiectasie et la protéine liée à Rad3 (ATR) ou l’ataxie télangiectasie mutée (ATM) est un événement clé dans la signalisation de la réplication du blocage de la fourche¹³. γH2A.X sert d’indicateur de fourches de réplication bloquées avant la formation de cassures double brin (DSB)¹³, créant un environnement chromatinien favorable pour faciliter le recrutement efficace des protéines de réparation vers les sites bloqués. De plus, γH2A.X peut être recruté pour briser des sites après l’effondrement de la fourche^14,15, conformément à son rôle principal dans la réparation des DSB. Étant donné que les cassures du SFC sont étroitement associées aux aberrations chromosomiques qui entraînent la progression du cancer, la détection de ces cassures peut être déterminante pour comprendre les premiers stades de la tumorigenèse. La présence de γH2A.X au niveau des SFC peut être utilisée comme biomarqueur pour détecter les événements précoces d’instabilité génomique. Cette information peut aider à identifier les cancérogènes potentiels et à évaluer le risque associé à l’exposition à divers agents extrinsèques. En mesurant les cassures de l’ADN au niveau des SFC induites par des agents extrinsèques, la chromatine IP γH2A.X (ChIP) peut donner un aperçu de la façon dont ces agents contribuent aux mécanismes sous-jacents à la tumorigenèse.

Dans la ChIP conventionnelle (c’est-à-dire la ChIP réticulée, X-ChIP), l’association de γH2A.X avec ses séquences d’ADN cibles est stabilisée par une réticulation réversible du formaldéhyde. La chromatine est ensuite cisaillée en fragments d’environ 500 paires de bases (pb) par sonication, et la solution résultante est débarrassée des débris par sédimentation 16,17,18. Un anticorps γH2A.X de qualité ChIP est ensuite ajouté à la fraction de chromatine éliminée, suivi de l’ajout de billes d’agarose de protéine A/G pour enrichir les régions^de chromatine liées à γH2A.X 16,17,18. Les complexes immuns (c’est-à-dire le complexe d’ADN ciblé par les billes-anticorps-γH2A.X) sont lavés plusieurs fois avec des tampons de lavage stricts pour éliminer les fragments d’ADN non spécifiquement liés 16,17,18. Après le lavage, l’ADN spécifiquement lié est élué des complexes immuns. Les réticulations du formaldéhyde sont ensuite inversées, suivies d’une digestion des protéines à l’aide de la protéinase K, après quoi l’ADN enrichi est purifié et concentré 16,17,18. Pour évaluer les régions associées à γH2A.X, la PCR, la PCR quantitative (qPCR) ou le séquençage direct sont utilisés 16,17,18. L’occupation de γH2A.X dans des régions spécifiques, telles que le SFC, est déterminée par l’intensité du signal PCR ou qPCR, qui est proportionnelle à la quantité de γH2A.X liée à cet endroit, ce qui donne un aperçu des dommages à l’ADN spécifiques au site et des événements de réparation 16,17,18.

Bien qu’il s’agisse d’une approche expérimentale puissante, la X-ChIP présente plusieurs limites importantes : (i) elle nécessite un grand nombre de cellules, généralement dans la gamme de 1 x 10⁷ à 5 x 10⁷, en raison de l’inefficacité de la précipitation des anticorps associée à la fixation, ce qui augmente le coût global de l’expérience¹⁹ ; (ii) le processus d’inversion des réticulations du formaldéhyde et de purification ultérieure de l’ADN prend du temps et exige beaucoup de main-d’œuvre, ce qui rend difficile le maintien de l’uniformité et de la fiabilité des résultats ; et (iii) les interactions γH2A.X-ADN ayant une signification fonctionnelle mineure ne peuvent pas être distinguées de celles ayant une signification plus grande, car l’étape de réticulation peut stabiliser les interactions transitoires, conduisant à la détection d’interactions qui peuvent ne pas être biologiquement pertinentes¹⁹.

L’immunoprécipitation de la chromatine native (Native ChIP ou N-ChIP) est une technique biochimique essentielle utilisée pour étudier les interactions protéine-ADN dans leur contexte de chromatine native dans des conditions physiologiques de sel. Il a joué un rôle déterminant dans l’élucidation de l’organisation spatiale et temporelle de la chromatine, de la liaison des facteurs de transcription et des modifications des histones. La ChIP native joue un rôle de longue date dans le domaine plus large de la biologie de la chromatine et de l’épigénétique, offrant des avantages et des limites uniques par rapport à la X-ChIP. Cette méthode, introduite à la fin des années 198020, implique l’isolement de la chromatine des cellules par des méthodes qui préservent sa structure native, comme la digestion avec des nucléases micrococciques (MNase)²¹. Cela préserve les contacts inhérents protéine-ADN et histone-ADN, ce qui rend la ChIP native particulièrement bien adaptée à l’étude des modifications des histones et du positionnement des nucléosomes dans leur cadre chromatien naturel²². Des études à haute résolution sur la ChIP native ont démontré l’utilisation de la digestion de la MNase pour réduire la chromatine en nucléosomes individuels, ce qui facilite la cartographie des modifications des histones avec une plus grande précision²³. De plus, comme il n’y a pas de réticulation chimique, le risque d’introduire des biais ou des artefacts qui pourraient dénaturer les interactions protéine-ADN est minimisé²⁴.

Contrairement à la X-ChIP, où le formaldéhyde ou d’autres agents de réticulation sont utilisés pour fixer les interactions protéine-ADN, la ChIP native fournit une vision plus réaliste de la chromatine en évitant les artefacts de réticulation potentiels. Cependant, alors que la X-ChIP est généralement mieux adaptée à la détection des interactions transitoires ou dynamiques entre l’ADN et les protéines régulatrices²⁵, la ChIP native est idéale pour les interactions protéine-ADN stables, telles que les histones ou d’autres protéines liées à la chromatine ^26,27. L’une des limitations notées pour le ChIP natif est l’incapacité à capturer les événements de liaison de faible affinité ou transitoires, qui sont souvent stabilisés par la réticulation dans X-ChIP²⁵.

Un nombre important de travaux en épigénétique a tiré parti de la ChIP native pour découvrir des modifications d’histones dans divers contextes biologiques²⁸. Ces efforts ont été cruciaux dans la définition du code des histones - le modèle de modifications des histones qui régulent l’expression des gènes et la dynamique de la chromatine²⁹. Bien que H2A. X est une histone de liaison moins fortement associée, la H2A native. La méthode X ChIP a été appliquée avec succès dans des cellules souches embryonnaires³⁰. Dans cette étude, nous avons optimisé une procédure d’extraction de la chromatine pour effectuer la ChIP native de γH2A.X dans les cellules 293T humaines (Figure 1). L’hydroxyurée et l’aphidicoline sont largement utilisées dans la recherche pour étudier le stress, les dommages et l’instabilité génomique de la réplication de l’ADN³¹. Dans cette étude, ces agents ont été appliqués aux cellules pour induire un stress de réplication et générer des cassures de l’ADN au niveau du SFC.

En utilisant du matériel de départ d’environ 1 x 10⁶ à 5 x 10⁶ cellules, cette méthode peut être divisée en quatre étapes principales : (i) le fractionnement subcellulaire pour isoler la chromatine, (ii) la digestion des nucléases micrococciques (MNase) pour fragmenter la chromatine, (iii) l’immunoprécipitation et l’élution, et (iv) l’analyse de l’ADN par PCR quantitative (qPCR). La réalisation de ChIP après le fractionnement subcellulaire offre plusieurs avantages et a été bien documentée dans de nombreuses études 32,33,34,35. Cette approche permet d’éliminer les protéines non liées à la chromatine et d’autres débris cellulaires, ce qui donne une fraction de chromatine hautement purifiée. En isolant la chromatine avant l’immunoprécipitation, le fractionnement subcellulaire aide à maintenir les interactions chromatiniennes natives et réduit le bruit de fond des protéines non associées à la chromatine, ce qui conduit à des résultats plus spécifiques et fiables, car seuls les complexes liés à la chromatine sont retenus pour l’analyse. De plus, le fractionnement subcellulaire permet des conditions plus douces pour la digestion de la chromatine, préservant ainsi les interactions physiologiques protéine-ADN et offrant une représentation plus précise de la dynamique de la chromatine dans l’environnement cellulaire natif.

L’utilisation de la ChIP native de γH2AX pour mesurer l’impact des agents extrinsèques sur la rupture des sites fragiles courants présente un potentiel important pour la recherche sur le cancer. Cette technique permet de détecter les dommages à l’ADN induits par l’exposition à des agents cancérigènes environnementaux, ce qui donne un aperçu des mécanismes moléculaires par lesquels les polluants contribuent à l’instabilité génomique et au développement du cancer. En préservant le contexte natif de la chromatine, cette méthode facilite l’évaluation précise des modèles de dommages à l’ADN associés à l’exposition cancérigène, ce qui facilite l’évaluation des risques environnementaux et l’étude de la tumorigenèse induite par la pollution.

Protocole

1. Prélèvement cellulaire

1. Ensemez environ 5 x 10^{cellules 5} HEK 293T dans chacune des quatre boîtes de 6 cm, chacune contenant 4 ml de milieu DMEM complet.
2. Après 24 h, traiter une boîte avec 2 μL de solution mère d’aphidicoline (voir le Tableau des matières) (concentration finale de 0,5 μM) et une autre boîte avec 20 μL de solution mère d’hydroxyurée 1 M (voir le Tableau des matières) (concentration finale de 5 mM) pour induire un stress de réplication. Ajoutez du DMSO aux deux plats restants pour servir de contrôles.
3. Après 24 h de traitement, jeter le milieu de culture. Une plaque de 6 cm produit généralement environ 2 x 10^cellules 6 à 60 % à 70 % de confluence.
4. Rincer chaque plat 2 fois avec 5 ml de PBS glacé. À l’aide de grattoirs à cellules, détachez les cellules et transférez la suspension cellulaire dans quatre tubes individuels de 1,5 ml. Pipetez doucement de haut en bas avec une pipette P1000 pour dissocier les amas de cellules.
5. Centrifugez les cellules à 500 x g pendant 5 min à 4 °C, puis jetez le surnageant. Placez les cellules sur de la glace.

2. Fractionnement subcellulaire

1. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 500 μL de tampon A froid fraîchement préparé (voir tableau 1), en assurant la dissociation complète des amas cellulaires par pipetage doux.
2. Incuber les lysats sur de la glace pendant 5 à 10 min. Vérifiez la progression de la lyse au microscope pour vous assurer que la lyse cellulaire est complète.
   1. Prenez une petite aliquote du lysat (environ 5 à 10 μL) et placez-la sur une lame de microscope propre. Couvrez-le d’une lamelle pour éviter toute contamination.
   2. Utilisez un microscope optique avec un grossissement approprié (p. ex., 20x - 40x) pour visualiser les cellules ou les débris. Comparer avec un échantillon de contrôle non lysé pour différencier les cellules intactes du matériel lysé.
      REMARQUE : Un échantillon correctement lysé n’aura pas de contours cellulaires distincts, seulement de la chromatine diffuse ou du matériel cellulaire. Ajustez la mise au point pour observer clairement le lysat. Si nécessaire, appliquez une force mécanique pendant l’étape de lyse, par exemple en utilisant un homogénéisateur Dounce, lorsque vous travaillez avec certains types de cellules.
3. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C, une fois les cellules complètement lysées. Jetez soigneusement le surnageant. Remettre en suspension la pastille de noyaux dans 500 μL de tampon A froid à l’aide d’embouts de pipette à large orifice.
   REMARQUE : Les pointes à large orifice aident à minimiser les forces de cisaillement et à protéger les échantillons délicats comme la chromatine. Fabriquez des pointes à alésage large en coupant l’extrémité des pointes standard avec une lame tranchante.
4. Centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez soigneusement le surnageant.
5. Préchauffez l’incubateur à 37 °C et préparez un tampon d’arrêt (100 mM d’EDTA, pH 8,0 ; Tableau 1).
6. Optimisez à l’avance les concentrations et les temps d’incubation des nucléases micrococciques (MNase, voir la Table des matières).
   1. Divisez 40 μL de l’échantillon de chromatine d’analyse en plusieurs aliquotes égales pour tester différentes concentrations de MNase et temps d’incubation.
   2. Utilisez une gamme de concentrations de MNase (p. ex., 0,0625 U, 0,125 U, 0,25 U, 0,5 U, 1 U, 2 U, 4 U, 8 U par réaction) et testez plusieurs temps d’incubation (p. ex., 2, 5, 10 et 15 min).
   3. Ajouter aux aliquotes de chromatine un tampon MNase (voir le tableau 1) contenant diverses concentrations de MNase et incuber les échantillons à 37 °C pendant les durées spécifiées.
   4. Terminez la réaction en ajoutant 1/4 de volume de tampon d’arrêt (concentration finale : 20 mM d’EDTA) immédiatement après le temps d’incubation souhaité.
   5. Isolez l’ADN des échantillons de chromatine digérés à l’aide d’une méthode d’extraction par phénol/chloroforme/alcool isoamylique.
   6. Analysez l’ADN extrait sur un gel d’agarose à 1,5 % pour visualiser les schémas de digestion : la sous-digestion montrera des bandes de poids moléculaire élevé (Figure 2, voies 1-4) ; une digestion excessive entraînera un frottis ou des fragments très courts (figure 2, couloirs 6-8), et une digestion optimale donnera un modèle d’échelle nucléosomique clair (figure 2, couloir 5, p. ex., mono-, di-, tri-nucléosomes).
   7. Identifiez les conditions qui produisent la résolution nucléosomique souhaitée sans surdigestion excessive.
      REMARQUE : CaCl₂ agit comme un cofacteur de l’activité MNase. Optimisez la digestion en ajustant la concentration en CaCl₂ entre 1 mM et 5 mM.
7. Remettez doucement en suspension les noyaux intacts avec 100 μL de tampon MNase en pipetant 5 à 10 fois avec des pointes à large orifice. Ajoutez immédiatement la quantité prédéterminée de MNase aux échantillons (1,25 U MNase/100 μL de tampon MNase).
   REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec plusieurs échantillons, digérez chacun d’eux individuellement pour éviter une digestion excessive.
8. Placez les tubes sur un rotateur et incubez pendant 5 min à 37 °C. Remettez immédiatement les tubes dans la glace et terminez la digestion de la MNase en ajoutant de l’EDTA à une concentration finale de 20 mM et mélangez par vortex.
9. Ajouter 500 μL de tampon B (voir le tableau 1) à chaque échantillon et bien mélanger en pipetant de haut en bas de 5 à 10 fois. Solubiliser les protéines en les incubant sur de la glace pendant 5 min.
   REMARQUE : Le sel et le détergent du tampon B aident à dissocier les protéines faibles liées à la chromatine et à exposer les épitopes pour l’immunoprécipitation.
10. Granuler la matière insoluble en la centrifugant à vitesse maximale pendant 5 min à 4 °C. Transférez le surnageant transparent dans de nouveaux tubes de 1,5 mL étiquetés comme fraction native de chromatine. Les échantillons peuvent être stockés à -80 °C ou utilisés pour valider l’efficacité de la fragmentation de la chromatine.
    REMARQUE : Évitez les cycles fréquents de gel-dégel, car ils peuvent perturber les interactions protéine-ADN d’intérêt. Minimisez les cycles de gel-dégel dans la mesure du possible.

3. Vérification de la fragmentation de la chromatine

1. Aliquote 10 μL du surnageant de chaque échantillon dans un nouveau tube de 1,5 mL. Mélanger avec 20 μL d’eau distillée et 30 μL d’alcool phénol/chloroforme/isoamylique (25:24:1).
2. Fermez bien les tubes et agitez vigoureusement pendant 15 à 30 s. Centrifugeuse à 20 000 x g (ou la vitesse maximale de la centrifugeuse) pendant 10 min à 4 °C. Après la centrifugation, trois couches distinctes seront observées : une couche supérieure claire, une couche intermédiaire blanche et une couche inférieure jaune.
3. Transférez avec précaution 20 μL de la phase aqueuse supérieure (contenant de l’ADN) dans un tube frais. Séparez l’ADN purifié dans un gel d’agarose à 1,5 % pendant 30 min à 100 V et visualisez les schémas de digestion. Assurez-vous que la taille des fragments de chromatine est principalement comprise entre 200 et 1000 paires de bases.
   REMARQUE : La taille appropriée des fragments de chromatine est cruciale pour le succès de la ChIP native et dépend des conditions de traitement de la MNase, y compris les unités enzymatiques, le temps d’incubation et la concentration de CaCl₂. L’efficacité de la digestion de la MNase peut également varier en fonction du type et du nombre de cellules. Le modèle de fragmentation de la chromatine illustré à la figure 2 (voie 5) est recommandé pour ce test ChIP.

4. Immunoprécipitation

1. Aliquote 20 μL de chromatine digérée de chaque échantillon dans un tube frais de 1,5 mL et mélanger avec 180 μL de tampon d’élution (voir le tableau 1). Étiquetez ces tubes comme échantillons d’entrée et conservez-les à -20 °C.
2. Transférez 400 μL d’échantillon de chromatine dans un autre tube de 1,5 mL pour la ChIP.
3. Ajouter l’anticorps γH2A.X (voir le tableau des matières) à un échantillon traité au DMSO, à un échantillon traité à l’aphidicoline et à un échantillon traité à l’hydroxyurée. Ajouter la même quantité d’IgG normales (voir le Tableau des matières) à un autre échantillon traité au DMSO comme témoin négatif pour le dosage de la ChIP.
   REMARQUE : Ici, 1 μg d’anticorps primaire est généralement utilisé pour 400 μL de chromatine (c’est-à-dire que la concentration finale de l’anticorps est de 2,5 μg/mL). Cependant, la quantité optimale doit être déterminée empiriquement pour différents anticorps γH2A.X.
4. Placez les tubes ChIP sur un rotateur à 4 °C et incubez pendant au moins 5 h, ou de préférence toute la nuit.
5. Pendant ce temps, aliquote 100 μL de billes magnétiques de protéine A/G de qualité ChIP (voir le tableau des matériaux) dans un nouveau tube de 1,5 mL. Utilisez des pointes à large orifice et pipetez lentement pour assurer une mesure précise des billes. Placez le tube sur un support magnétique pendant au moins 1 min, puis jetez soigneusement le liquide.
6. Remettre les billes en suspension dans 1 mL de 1x PBS contenant 0,5 % BSA. Tourner à 4 °C pendant environ 4 h. Placez le tube sur un support magnétique pendant au moins 1 min et jetez le surnageant.
7. Lavez à nouveau les perles avec 1 ml de 1x PBS contenant 0,5 % BSA. Placez le tube sur le support magnétique pendant 1 min pour granuler les billes magnétiques, puis jetez le surnageant.
   REMARQUE : Les étapes 4.5 à 4.7 consistent à pré-enrober les billes afin de réduire la liaison non spécifique des anticorps aux billes magnétiques.
8. Remettre en suspension les billes pré-enduites dans 100 μL de tampon B à l’aide d’embouts à large orifice. Ajoutez 25 μL de suspension à billes magnétiques pré-enrobées dans chaque tube d’échantillon ChIP. Tourner à 4 °C pendant 2 h.
9. Placez les tubes ChIP sur le support magnétique et attendez que les billes soient complètement fixées sur le côté du tube et que la solution devienne claire.
10. Jetez le surnageant transparent sans déranger les billes magnétiques. Remettre les billes en suspension avec 1 mL de tampon de lavage (voir le tableau 1) et les faire tourner à 4 °C pendant 10 min.
11. Replacez les tubes sur le support magnétique et attendez que la solution devienne claire. Jetez le tampon de lavage. Répétez le lavage pour un total de quatre lavages.
12. Jetez le tampon de lavage après le lavage final et centrifugez brièvement les tubes à 400 x g pendant 30 s à 4 °C pour faire essorer tout liquide résiduel. Replacez les tubes sur le support magnétique et retirez soigneusement tout liquide restant du fond du tube.

5. Élution et précipitation de l’ADN

REMARQUE : L’efficacité des anticorps peut varier entre les différents lots. Il est important de confirmer l’affinité de liaison d’un nouvel anticorps en vérifiant les échantillons immunoprécipités par transfert Western.

1. Vérifiez l’efficacité de l’extraction de l’anticorps ChIP à l’aide du Western blot (WB) comme décrit ci-dessous.
   1. Prélever une petite aliquote de l’échantillon de ChIP pour analyse (c.-à-d. généralement 10 % de l’échantillon de ChIP). Inclure la chromatine d’entrée (pré-immunoprécipitation) et le contrôle négatif (par exemple, pull-down IgG) à des fins de comparaison.
   2. Éluer les protéines des billes liées aux anticorps en chauffant dans 20 μL de 1 tampon de chargement SDS-PAGE (voir le tableau des matières) à 95 °C pendant 5 min.
   3. Chargez les échantillons, les entrées et les commandes IP sur un gel SDS-PAGE à 15 %. Faites couler le gel.
   4. Transférez les protéines sur une membrane de nitrocellulose de 0,2 μm (voir le tableau des matériaux) ou en PVDF à l’aide d’un système de transfert humide ou semi-sec.
   5. Bloquer la membrane avec du lait écrémé à 5 % ou de la BSA dans du TBST (voir tableau 1) pendant 1 h à température ambiante pour éviter une liaison non spécifique.
   6. Incuber la membrane avec l’anticorps primaire contre le γH2A.X (voir le tableau des matériaux) dilué dans un tampon bloquant pendant 1 à 2 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
   7. Lavez la membrane 3 fois avec du TBST pour éliminer les anticorps non liés. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP (voir le tableau des matières) pendant 1 h à température ambiante. Lavez à nouveau la membrane pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires.
   8. Développez la membrane à l’aide d’un substrat chimiluminescent et visualisez le signal avec un imageur. Comparez l’intensité du signal entre les voies IP, d’entrée et de contrôle pour évaluer l’efficacité et la spécificité du pull-down.
      REMARQUE : Une bande correspondant à la protéine cible dans la voie IP confirme la réussite de l’extraction de l’anticorps. Cette approche vous permet d’évaluer l’efficacité de l’anticorps à capturer la protéine cible pendant l’expérience ChIP.
2. Ajouter 50 μL de tampon d’élution (voir le tableau 1) à chacun des échantillons de ChIP restants. Placez les tubes sur un thermomixeur et agitez pendant 15 min à température ambiante.
3. Placez les tubes sur le support magnétique pendant au moins 1 min. Récupérez l’élu dans de nouveaux tubes. Répétez l’opération 1 fois et récupérez l’élu dans les mêmes tubes.
4. Ajoutez 100 μL supplémentaires de tampon d’élution à chaque échantillon d’élution ChIP et 180 μL de tampon d’élution à chaque échantillon d’entrée.
5. Ajouter 200 μL d’alcool phénol/chloroforme/isoamylique (25:24:1) à chaque échantillon et agiter vigoureusement. Centrifuger les échantillons à 20 000 x g (ou vitesse maximale) pendant 10 min à 4 °C.
6. Ajouter 19 μL d’acétate de sodium 3M (NaOAc, pH 5,2 ; voir le tableau 1) et 2 μL de solution de glycogène (20 mg/mL, voir le tableau des matières) dans chaque nouveau tube à centrifuger de 1,5 mL.
7. Après la centrifugation, transférez soigneusement la couche aqueuse supérieure (environ 190 μL) dans les tubes contenant du NaOAc et du glycogène et mélangez par vortex.
8. Ajouter 500 μL d’éthanol à 100 % et vortex. Faites précipiter l’ADN en incubant les échantillons à -20 °C pendant au moins 2 h ou toute la nuit.
9. Centrifuger les tubes à 20 000 x g (ou vitesse maximale) pendant 10 min à 4 °C. Jetez le surnageant en prenant soin de ne pas déranger la pastille blanche. Remettez la pastille en suspension dans 1 mL d’éthanol à 70 % et agitez abondamment.
10. Centrifuger les tubes à 20 000 x g (ou vitesse maximale) pendant 5 min à 4 °C. Retirez délicatement le surnageant. Centrifugez brièvement les tubes à nouveau pour faire tourner l’éthanol résiduel. Prélevez délicatement l’éthanol à l’aide d’une pipette P20. Faites sécher les granulés d’ADN à l’air libre pendant 2-3 min.
    REMARQUE : Évitez de trop sécher la pastille, car cela peut rendre l’ADN difficile à dissoudre.
11. Pour les échantillons ChIP, remettre l’ADN en suspension dans 400 μL de tampon TE (voir le tableau 1). Pour l’ADN d’entrée, remettre en suspension dans 1000 μL de tampon TE. Les échantillons élués peuvent désormais être conservés à -20°C.

6. Quantification de la qPCR

1. Effectuez une qPCR à l’aide d’un kit commercial (voir le tableau des matériaux) avec des triplets techniques pour chaque échantillon. Confirmer la présence d’un seul produit de PCR spécifique en effectuant une analyse de la courbe de fusion pour garantir la spécificité de l’amplification³⁶.
2. Analyse des données
   REMARQUE : Dans l’analyse de quantification relative, l’échantillon d’essai est exprimé en un changement de pli par rapport à un échantillon témoin (immunoprécipité à l’aide d’IgG purifiées normales ou d’IP fictives). Les locus d’ADN connus pour être inoccupés par la protéine immunoprécipitée (locus négatif) peuvent être utilisés de cette manière comme gène de référence par rapport aux locus d’ADN³⁶ de contrôle positif connus, occupés et positifs.
   1. Calculez le pourcentage d’entrée pour chaque ChIP à l’aide de la formule ci-dessous
      %Entrée = 2(-ΔCt [ChIP normalisé])
   2. Normalisez les valeurs ΔCt du locus positif en locus négatif (ΔΔCt) en soustrayant la valeur ΔCt obtenue pour le locus positif de la valeur ΔCt pour le locus négatif à l’aide de la formule ci-dessous
      (ΔΔCt = ΔCtpositif - ΔCtnégatif)
   3. Calculez l’enrichissement du pli de la séquence du locus positif dans l’ADN ChIP sur le locus négatif à l’aide de la formule ci-dessous
      Enrichissement du pli =2ΔΔCt
      Les séquences des amorces de qPCR utilisées pour l’analyse sont fournies dans le tableau 2. L’organisation génomique de FRA3B et FRA16D³⁷est illustrée à la figure 3A,B.
3. Analyse statistique
   1. Analysez les résultats statistiquement à l’aide du test t apparié de Student. Une valeur p de ≤0,05 est considérée comme statistiquement significative, ce qui indique qu’il est peu probable que les différences observées soient dues à une variation aléatoire³⁸.

Résultats

La taille des fragments de chromatine est cruciale pour le succès de la ChIP native, car elle a un impact direct sur l’accessibilité des régions de l’ADN pour la liaison aux anticorps. Pour déterminer la concentration optimale de MNase pour la fragmentation de la chromatine, nous avons préparé une série de tubes de microcentrifugation contenant des concentrations variables de MNase (c’est-à-dire 0,0625 U, 0,125 U, 0,25 U, 0,5 U, 1 U, 2 U, 4 U, 8 U par réaction) et 40 μL d...

Discussion

La pollution de l’environnement est un contributeur important aux cancers humains. De nombreux polluants sont cancérigènes, ce qui signifie qu’ils peuvent causer des dommages génétiques qui conduisent au développement d’un cancer^40,41. Cependant, déterminer si une substance particulière est tumorigène est une tâche difficile. Une méthode rapide, fiable et rentable pour identifier le potentiel cancérogène permett...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm nitrocellulose membrane	Amersham	10600011
Actin B	proteintech	20536-1-AP
Aphidicolin	MedChemExpress	HY-N6733
ChIP-grade magnetic Protein A/G beads	ThermoFisher	26162
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	#1705061
Glycogen, molecular biology grade	ThermoFisher	Cat. No.  R0561
HRP-conjugated secondary antibody	proteintech	SA00001-2
hydroxyurea	MedChemExpress	HY-B0313
Micrococcal Nuclease	NEB	M0247S
normal IgG	Santa Cruz	sc-2025
Taq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725120
γH2A.X antibody  (for ChIP)	Sigma-Aldrich	05-636
γH2A.X antibody (for WB)	Cell Signaling	#25955