Erfassung häufiger fragiler Stellenbrüche durch natives γH2A. X ChIP

Zusammenfassung

Wir stellen eine schnelle und effiziente Methode vor, um häufige Brüche an fragilen Stellen durch native γH2A.X-Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) zu detektieren. Dieser Ansatz reduziert sowohl den Zeit- als auch den Arbeitsaufwand, der mit herkömmlichen γH2A.X ChIP-Assays verbunden ist, erheblich und behält gleichzeitig eine hohe Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse bei.

Zusammenfassung

Replikationsstress, der durch die Exposition gegenüber extrinsischen Wirkstoffen induziert wird, kann zu DNA-Brüchen an häufigen fragilen Stellen führen, bei denen es sich um Regionen im Genom handelt, die bekanntermaßen anfällig für strukturelle Instabilität sind. Der γH2A.X-Chromatin-Immunpräzipitationsassay (ChIP) dient als leistungsstarkes Werkzeug in Genotoxizitätsstudien, da die γH2A.X-Phosphorylierung ein gut etablierter Marker für DNA-Doppelstrangbrüche ist. Herkömmliche γH2A.X ChIP-Assays sind jedoch oft arbeitsintensiv und umfassen mehrere, zeitaufwändige Schritte. In dieser Studie stellen wir eine vereinfachte, aber effektive Methode vor, die subzelluläre Fraktionierung mit nativem ChIP kombiniert, um γH2A.X-assoziierte Komplexe zu isolieren. Dieser Ansatz eignet sich besonders für die Analyse von γH2A.X-Chromatin-Wechselwirkungen mit erhöhter Spezifität und Effizienz. Durch die subzelluläre Fraktionierung werden ungebundene Chromatinmaterialien effektiv entfernt, was zu einer gereinigten Chromatinfraktion führt. Der anschließende Verdau der Mikrokokken-Nuklease (MNase) unter milden Bedingungen ermöglicht die Chromatinfragmentierung unter Beibehaltung der physiologischen Wechselwirkungen zwischen γH2A.X und den zugehörigen Proteinkomplexen. Diese Konservierung ist wichtig für die Untersuchung nativer Interaktionspartner, die an DNA-Schadensreaktionswegen beteiligt sind. Dieses optimierte native ChIP-Protokoll reduziert den Zeit- und Arbeitsaufwand, der mit herkömmlichen γH2A.X-ChIP-Assays verbunden ist, erheblich. Das optimierte Verfahren vereinfacht nicht nur den Arbeitsablauf, sondern führt auch zu hochgradig reproduzierbaren Ergebnissen, was es besonders vorteilhaft in Umgebungen macht, in denen eine Hochdurchsatzverarbeitung mehrerer Proben erforderlich ist. Diese Methode ist in Studien anwendbar, die sich auf Genomstabilität, DNA-Reparatur und Chromatinbiologie konzentrieren, wo eine genaue und effiziente Detektion von DNA-Schadensstellen von entscheidender Bedeutung ist. Durch den Einsatz optimierter Protokolle und optimierter Schritte ermöglicht diese Methode den Nachweis von DNA-Schäden an fragilen Stellen mit verbesserter Empfindlichkeit und minimaler Probenhandhabung, was sie zu einem wertvollen Werkzeug für Studien zur Genomstabilität und DNA-Schadensreaktion macht.

Einleitung

Common Fragile Sites (CFSs) sind große chromosomale Regionen, die auf jedem menschlichen Chromosom zu finden sind und während der Metaphase zum Bruch neigen. Unter Replikationsstress wird die Replikation in diesen Regionen deutlich verzögert, wodurch eine vollständige Duplikation vor dem mitotischen Eintritt¹ verhindert wird, was letztendlich zu ortsspezifischen Lücken und Brüchen führt. CFS sind Hotspots für chromosomale Instabilität und eine der Hauptursachen für chromosomale Umlagerungen während der frühen Krebsentwicklung. Replikationsstress, der häufig unter tumorigenen Bedingungen vorhanden ist, kann zum Verlust von Tumorsuppressorgenen und zur Amplifikation von Onkogenen führen – zusammenfassend als Kopienzahlvariation (CNV) bezeichnet2,3,4,5,6. Darüber hinaus sind CFS sehr anfällig für die virale Integration, was die Krebsentwicklung weiter fördert 7,8,9,10. Mehrere homozygote Deletionen von Tumorsuppressorgenen wurden in CFS-Regionen bei Pan-Krebs-Analysen von Primärtumoren nachgewiesen. Zu den am häufigsten betroffenen CFS bei Krebs gehören FRA2F, FRA3B, FRA4F, FRA5H und FRA16D¹¹. CFS sind besonders anfällig für Brüche in Gegenwart von extrinsischen karzinogenen Stoffen¹². Um die schädlichen krebserzeugenden Wirkungen von Umweltschadstoffen zu bewerten, ist eine schnelle und zuverlässige Methode zur Quantifizierung des Auftretens von CFS-Brüchen erforderlich.

Phosphorylierung von H2A. X am Serinrest 139 (γH2A.X) durch Ataxia Telangiectasia and Rad3-Related Protein (ATR) oder Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) ist ein Schlüsselereignis bei der Signalreplikation Fork Stalling¹³. γH2A.X dient als Indikator für blockierte Replikationsgabeln vor der Bildung eines Doppelstrangbruchs (DSB)¹³ und schafft eine günstige Chromatinumgebung, um die effiziente Rekrutierung von Reparaturproteinen an blockierten Stellen zu erleichtern. Zusätzlich kann γH2A.X rekrutiert werden, um Bruchstellen nach einem Gabelkollaps^14,15 zu brechen, was mit seiner primären Rolle bei der DSB-Reparatur übereinstimmt. Da CFS-Brüche eng mit Chromosomenaberrationen verbunden sind, die das Fortschreiten der Krebserkrankung vorantreiben, kann die Erkennung dieser Brüche für das Verständnis der frühen Stadien der Tumorentstehung von entscheidender Bedeutung sein. Das Vorhandensein von γH2A.X bei CFS kann als Biomarker verwendet werden, um frühe Ereignisse genomischer Instabilität zu erkennen. Diese Informationen können dazu beitragen, potenzielle Karzinogene zu identifizieren und das mit der Exposition gegenüber verschiedenen extrinsischen Stoffen verbundene Risiko zu bewerten. Durch die Messung von DNA-Brüchen an CFSs, die durch extrinsische Wirkstoffe induziert werden, kann γH2A.X-Chromatin-IP (ChIP) Aufschluss darüber geben, wie solche Wirkstoffe zu den Mechanismen beitragen, die der Tumorentstehung zugrunde liegen.

Im konventionellen ChIP (d.h. vernetztes ChIP, X-ChIP) wird die Assoziation von γH2A.X mit seinen Ziel-DNA-Sequenzen durch reversible Formaldehydvernetzung stabilisiert. Anschließend wird das Chromatin durch Beschallung in Fragmente von etwa 500 Basenpaaren (bp) geschert, und die resultierende Lösung wird durch Sedimentation von Trümmern befreit 16,17,18. Ein γH2A.X-Antikörper der ChIP-Qualität wird dann zur geklärten Chromatinfraktion hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von Protein A/G-Agarosekügelchen zur Anreicherung für die γH2A.X-gebundenen Chromatinregionen^{16, 17, 18}. Die Immunkomplexe (d. h. der auf Kügelchen und Antikörper ausgerichtete DNA-Komplex mit γH2A.X) werden mehrfach mit stringenten Waschpuffern gewaschen, um unspezifisch gebundene DNA-Fragmente zu entfernen 16,17,18. Nach dem Waschen wird die spezifisch gebundene DNA aus den Immunkomplexen eluiert. Die Formaldehyd-Vernetzungen werden dann umgekehrt, gefolgt von einem Proteinverdau mit Proteinase K, wonach die angereicherte DNA gereinigt und konzentriert wird 16,17,18. Zur Beurteilung der γH2A.X-assoziierten Regionen wird PCR, quantitative PCR (qPCR) oder direkte Sequenzierung verwendet 16,17,18. Die Belegung von γH2A.X in bestimmten Regionen, wie z. B. CFS, wird durch die Intensität des PCR- oder qPCR-Signals bestimmt, das proportional zur Menge an γH2A.X ist, die an dieser Stelle gebunden ist, was Einblicke in ortsspezifische DNA-Schäden und Reparaturereignisse gibt 16,17,18.

Obwohl es sich um einen leistungsfähigen experimentellen Ansatz handelt, weist das X-ChIP mehrere signifikante Einschränkungen auf: (i) Es erfordert eine große Anzahl von Zellen, typischerweise im Bereich von 1 x 10⁷ bis 5 x 10⁷, aufgrund der Ineffizienz der Antikörperfällung in Verbindung mit der Fixierung, was die Gesamtkosten des Experiments^{erhöht 19}; (ii) Der Prozess der Umkehrung von Formaldehyd-Vernetzungen und der anschließenden DNA-Aufreinigung ist zeitaufwändig und arbeitsintensiv, was es schwierig macht, die Konsistenz und Zuverlässigkeit der Ergebnisse aufrechtzuerhalten; und (iii) γH2A.X-DNA-Wechselwirkungen mit geringer funktioneller Signifikanz können nicht von solchen mit größerer Signifikanz unterschieden werden, da der Vernetzungsschritt transiente Wechselwirkungen stabilisieren kann, was zum Nachweis von Wechselwirkungen führt, die möglicherweise nicht biologisch relevant sind¹⁹.

Die native Chromatin-Immunpräzipitation (Native ChIP oder N-ChIP) ist eine essentielle biochemische Technik, die zur Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen innerhalb ihres nativen Chromatinkontexts unter physiologischen Salzbedingungen verwendet wird. Es war maßgeblich an der Aufklärung der räumlichen und zeitlichen Organisation von Chromatin, der Bindung von Transkriptionsfaktoren und der Histonmodifikationen beteiligt. Natives ChIP spielt seit langem eine Rolle auf dem breiteren Gebiet der Chromatinbiologie und Epigenetik und bietet einzigartige Vorteile und Einschränkungen im Vergleich zu X-ChIP. Bei dieser Methode, die in den späten 1980er Jahren eingeführt wurde²⁰, wird Chromatin aus Zellen durch Methoden isoliert, die seine native Struktur erhalten, wie z. B. den Verdau mit Mikrokokken-Nuklease (MNase)²¹. Dadurch bleiben die inhärenten Protein-DNA- und Histon-DNA-Kontakte erhalten, was Native ChIP besonders gut für die Untersuchung von Histonmodifikationen und Nukleosomenpositionierung in ihrer natürlichen Chromatineinstellung geeignet macht²². Hochauflösende native ChIP-Studien haben gezeigt, dass der MNase-Verdau zur Reduzierung des Chromatins auf einzelne Nukleosomen verwendet wird, was die Kartierung von Histonmodifikationen mit größerer Genauigkeit erleichtert²³. Da keine chemische Vernetzung beteiligt ist, wird außerdem das Risiko von Verzerrungen oder Artefakten minimiert, die die Protein-DNA-Wechselwirkungen falsch darstellen könnten²⁴.

Im Gegensatz zu X-ChIP, bei dem Formaldehyd oder andere Vernetzungsmittel verwendet werden, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu fixieren, bietet Native ChIP eine realistischere Sicht auf das Chromatin, indem potenzielle Vernetzungsartefakte vermieden werden. Während X-ChIP jedoch im Allgemeinen besser für den Nachweis transienter oder dynamischer Wechselwirkungen zwischen DNA und regulatorischen Proteinen geeignet ist²⁵, ist natives ChIP ideal für stabile Protein-DNA-Interaktionen, wie z. B. Histone oder andere Chromatin-gebundene Proteine^26,27. Eine der Einschränkungen von Native ChIP ist die Unfähigkeit, Bindungsereignisse mit geringer Affinität oder vorübergehenden Bindungen zu erfassen, die häufig durch Vernetzung in X-ChIP²⁵ stabilisiert werden.

Eine bedeutende Reihe von Arbeiten in der Epigenetik hat Native ChIP genutzt, um Histonmodifikationen in verschiedenen biologischen Umgebungen aufzudecken²⁸. Diese Bemühungen waren entscheidend für die Definition des Histon-Codes - des Musters von Histonmodifikationen, die die Genexpression und die Chromatindynamik regulieren²⁹. Obwohl H2A. X ist ein weniger stark assoziiertes Linker-Histon, das native H2A. Die X-ChIP-Methode wurde erfolgreich bei embryonalen Stammzellen^{angewendet 30}. In dieser Studie haben wir ein Chromatin-Extraktionsverfahren optimiert, um eine native ChIP von γH2A.X in humanen 293T-Zellen durchzuführen (Abbildung 1). Hydroxyharnstoff und Aphidicolin werden in der Forschung häufig verwendet, um Stress, Schädigung und genomische Instabilität der DNA-Replikation zu untersuchen³¹. In dieser Studie wurden diese Wirkstoffe auf Zellen angewendet, um Replikationsstress zu induzieren und DNA-Brüche bei CFS zu erzeugen.

Unter Verwendung von Ausgangsmaterial von etwa 1 x 10⁶ bis 5 x 10⁶ Zellen kann dieses Verfahren in vier Hauptstufen unterteilt werden: (i) subzelluläre Fraktionierung zur Isolierung des Chromatins, (ii) Mikrokokken-Nuklease (MNase)-Verdau zur Fragmentierung des Chromatins, (iii) Immunpräzipitation und -elution und (iv) DNA-Analyse durch quantitative PCR (qPCR). Die Durchführung von ChIP nach subzellulärer Fraktionierung bietet mehrere Vorteile und wurde in zahlreichen Studien gut dokumentiert 32,33,34,35. Dieser Ansatz ermöglicht die Entfernung von ungebundenen Chromatinproteinen und anderen zellulären Trümmern, was zu einer hochreinen Chromatinfraktion führt. Durch die Isolierung von Chromatin vor der Immunpräzipitation trägt die subzelluläre Fraktionierung dazu bei, native Chromatin-Wechselwirkungen aufrechtzuerhalten und das Hintergrundrauschen von nicht-Chromatin-assoziierten Proteinen zu reduzieren, was zu spezifischeren und zuverlässigeren Ergebnissen führt, da nur Chromatin-gebundene Komplexe für die Analyse zurückgehalten werden. Darüber hinaus ermöglicht die subzelluläre Fraktionierung mildere Bedingungen für den Chromatinverdau, wodurch physiologische Protein-DNA-Wechselwirkungen erhalten bleiben und eine genauere Darstellung der Chromatindynamik in der nativen zellulären Umgebung ermöglicht wird.

Die Verwendung von nativem ChIP von γH2AX zur Messung des Einflusses von extrinsischen Wirkstoffen auf den häufigen Bruch an fragilen Stellen birgt ein erhebliches Potenzial für die Krebsforschung. Diese Technik ermöglicht den Nachweis von DNA-Schäden, die durch die Exposition gegenüber Umweltkarzinogenen induziert werden, und gibt Einblicke in die molekularen Mechanismen, durch die Schadstoffe zur genomischen Instabilität und Krebsentwicklung beitragen. Durch die Beibehaltung des nativen Chromatinkontexts erleichtert diese Methode die genaue Bewertung von DNA-Schadensmustern, die mit der Exposition gegenüber krebserregenden Stoffen verbunden sind, und hilft bei der Bewertung von Umweltrisiken und der Untersuchung der durch Umweltverschmutzung verursachten Tumorgenese.

Protokoll

1. Zellernte

1. Säen Sie etwa 5 x 10^{5 HEK} 293T-Zellen in jede der vier 6-cm-Schalen, die jeweils 4 ml vollständiges DMEM-Medium enthalten.
2. Nach 24 Stunden ist eine Schale mit 2 μl 1 mM Aphidicolin (siehe Materialtabelle) Stammlösung (Endkonzentration von 0,5 μM) und eine andere Schale mit 20 μl 1 M Hydroxyharnstoff (siehe Materialtabelle) Stammlösung (Endkonzentration von 5 mM) zu behandeln, um Replikationsstress zu induzieren. Geben Sie DMSO zu den verbleibenden zwei Gerichten, die als Kontrollen dienen.
3. Nach 24 Stunden Behandlung ist der Nährboden zu entsorgen. Eine 6-cm-Platte ergibt typischerweise etwa 2 x 10⁶ Zellen bei 60%-70% Konfluenz.
4. Spülen Sie jede Schale 2x mit 5 mL eiskaltem 1x PBS aus. Verwenden Sie Zellschaber, um die Zellen zu lösen, und übertragen Sie die Zellsuspension auf vier einzelne 1,5-ml-Röhrchen. Pipettieren Sie vorsichtig mit einer P1000-Pipette auf und ab, um Zellklumpen zu dissoziieren.
5. Die Zellen werden bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert, dann wird der Überstand verworfen. Lege die Zellen auf Eis.

2. Subzelluläre Fraktionierung

1. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl frisch zubereitetem kaltem Puffer A (siehe Tabelle 1) und stellen Sie durch schonendes Pipettieren die vollständige Dissoziation der Zellklumpen sicher.
2. Inkubieren Sie die Lysate 5-10 Minuten lang auf Eis. Überprüfen Sie den Lyseverlauf unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zelllyse vollständig ist.
   1. Nehmen Sie ein kleines Aliquot des Lysats (ca. 5 - 10 μL) und legen Sie es auf einen sauberen Objektträger. Decken Sie es mit einem Deckglas ab, um eine Kontamination zu vermeiden.
   2. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop mit einer geeigneten Vergrößerung (z. B. 20x - 40x), um Zellen oder Ablagerungen sichtbar zu machen. Vergleichen Sie mit einer nicht lysierten Kontrollprobe, um zwischen intakten Zellen und lysiertem Material zu unterscheiden.
      HINWEIS: Eine ordnungsgemäß lysierte Probe hat keine deutlichen Zellumrisse, sondern nur diffuses Chromatin oder zelluläres Material. Passen Sie den Fokus an, um das Lysat deutlich zu beobachten. Wenden Sie bei Bedarf während des Lyseschritts mechanische Kraft an, z. B. bei Verwendung eines Dounce-Homogenisators, wenn Sie mit bestimmten Zelltypen arbeiten.
3. Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei 4 °C, sobald die Zellen vollständig lysiert sind. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig. Resuspendieren Sie das Kernpellet in 500 μl kaltem Puffer A mit Pipettenspitzen mit breiter Öffnung.
   HINWEIS: Spitzen mit breiter Öffnung tragen dazu bei, Scherkräfte zu minimieren und empfindliche Proben wie Chromatin zu schützen. Stellen Sie Spitzen mit breiter Bohrung her, indem Sie das Ende von Standardspitzen mit einer scharfen Klinge abschneiden.
4. Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
5. Einen Inkubator auf 37 °C vorwärmen und einen Stopppuffer (100 mM EDTA, pH 8,0; Tabelle 1).
6. Optimieren Sie die Konzentrationen und Inkubationszeiten der Mikrokokken-Nuklease (MNase, siehe Materialtabelle) im Voraus.
   1. Teilen Sie 40 μl der Testchromatinprobe in mehrere gleiche Aliquots auf, um unterschiedliche MNase-Konzentrationen und Inkubationszeiten zu testen.
   2. Verwenden Sie einen Bereich von MNase-Konzentrationen (z. B. 0,0625 U, 0,125 U, 0,25 U, 0,5 U, 1 U, 2 U, 4 U, 8 U pro Reaktion) und testen Sie mehrere Inkubationszeiten (z. B. 2, 5, 10 und 15 Minuten).
   3. Geben Sie MNase Puffer (siehe Tabelle 1), der verschiedene Konzentrationen von MNase enthält, zu den Chromatin-Aliquoten und inkubieren Sie die Proben bei 37 °C für die angegebenen Zeiten.
   4. Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 1/4 Volumen Stopppuffer (Endkonzentration: 20 mM EDTA) unmittelbar nach der gewünschten Inkubationszeit.
   5. Isolierung der DNA aus den verdauten Chromatinproben unter Verwendung einer Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktionsmethode.
   6. Führen Sie die extrahierte DNA auf einem 1,5%igen Agarosegel aus, um Verdauungsmuster zu visualisieren: Eine Unterverdauung zeigt Banden mit hohem Molekulargewicht (Abbildung 2, Spur 1-4); Ein Überverdau führt zu einem Abstrich oder sehr kurzen Fragmenten (Abbildung 2, Spur 6-8), und ein optimaler Verdau führt zu einem klaren nukleosomalen Leitermuster (Abbildung 2, Spur 5, z. B. Mono-, Di-, Trinukleosomen).
   7. Identifizieren Sie die Bedingungen, die die gewünschte nukleosomale Auflösung ohne übermäßige Überverdauung erzeugen.
      HINWEIS: CaCl₂ fungiert als Cofaktor für die MNase-Aktivität. Optimieren Sie den Aufschluss, indem Sie die CaCl_{2-Konzentration} zwischen 1 mM und 5 mM einstellen.
7. Resuspendieren Sie die intakten Zellkerne vorsichtig mit 100 μl MNase-Puffer, indem Sie 5 bis 10 Mal mit Spitzen mit breiter Öffnung pipettieren. Geben Sie sofort die vorbestimmte Menge MNase zu den Proben (1,25 U MNase/100 μl MNase Puffer).
   HINWEIS: Wenn Sie mit mehreren Proben arbeiten, verdauen Sie jede Probe einzeln, um eine Überverdauung zu vermeiden.
8. Die Röhrchen auf einen Rotator stellen und 5 min bei 37 °C inkubieren. Die Röhrchen werden sofort wieder auf Eis gestellt und der MNase-Aufschluss durch Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 20 mM und Mischen durch Vortexen beendet.
9. Geben Sie 500 μl Puffer B (siehe Tabelle 1) zu jeder Probe und mischen Sie gründlich, indem Sie 5x - 10x auf und ab pipettieren. Solubilisieren Sie Proteine, indem Sie 5 Minuten lang auf Eis inkubieren.
   HINWEIS: Das Salz und das Detergens in Puffer B helfen, schwach chromatingebundene Proteine zu dissoziieren und die Epitope für die Immunpräzipitation freizulegen.
10. Das unlösliche Material wird durch Zentrifugieren bei maximaler Drehzahl für 5 min bei 4 °C pelletiert. Übertragen Sie den klaren Überstand in neue 1,5-ml-Röhrchen, die als native Chromatinfraktion gekennzeichnet sind. Die Proben können entweder bei -80 °C gelagert oder zur Validierung der Effizienz der Chromatinfragmentierung verwendet werden.
    HINWEIS: Vermeiden Sie häufige Gefrier-Tau-Zyklen, da diese interessante Protein-DNA-Wechselwirkungen stören können. Minimieren Sie nach Möglichkeit Frost-Tau-Zyklen.

3. Nachweis der Chromatinfragmentierung

1. Aliquotieren Sie 10 μl des Überstands aus jeder Probe in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Mit 20 μl destilliertem Wasser und 30 μl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) mischen.
2. Verschließen Sie die Schläuche fest und wirbeln Sie sie 15-30 s lang kräftig ein. Zentrifugieren Sie bei 20.000 x g (oder der maximalen Drehzahl der Zentrifuge) für 10 min bei 4 °C. Nach der Zentrifugation werden drei verschiedene Schichten beobachtet: eine klare obere Schicht, eine weiße mittlere Schicht und eine gelbe untere Schicht.
3. Übertragen Sie vorsichtig 20 μl der oberen wässrigen Phase (die DNA enthält) in ein frisches Röhrchen. Trennen Sie die gereinigte DNA 30 Minuten lang bei 100 V in 1,5 % Agarosegel und visualisieren Sie die Verdauungsmuster. Stellen Sie sicher, dass die Größe der Chromatinfragmente hauptsächlich zwischen 200 und 1000 Basenpaaren liegt.
   HINWEIS: Die richtige Größe der Chromatinfragmente ist entscheidend für den Erfolg von nativem ChIP und hängt von den MNase-Behandlungsbedingungen ab, einschließlich der Enzymeinheiten, der Inkubationszeit und der CaCl_{2-Konzentration}. Die Effizienz der MNase-Verdauung kann auch je nach Zelltyp und -anzahl variieren. Das in Abbildung 2 (Spur 5) gezeigte Chromatinfragmentierungsmuster wird für diesen ChIP-Assay empfohlen.

4. Immunpräzipitation

1. Aliquotieren Sie 20 μl verdautes Chromatin aus jeder Probe in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen und mischen Sie es mit 180 μl Elutionspuffer (siehe Tabelle 1). Diese Röhrchen als Eingangsproben kennzeichnen und bei -20 °C lagern.
2. Übertragen Sie 400 μl Chromatinprobe in ein weiteres 1,5-ml-Röhrchen für ChIP.
3. Geben Sie einen γH2A.X-Antikörper (siehe Materialtabelle) zu einer DMSO-behandelten, einer mit Aphidicolin behandelten Probe und einer mit Hydroxyharnstoff behandelten Probe. Geben Sie die gleiche Menge normales IgG (siehe Materialtabelle) zu einer anderen DMSO-behandelten Probe als Negativkontrolle für den ChIP-Assay.
   HINWEIS: Hier wird typischerweise 1 μg Primärantikörper für 400 μl Chromatin verwendet (d. h. die Endkonzentration des Antikörpers beträgt 2,5 μg/ml). Die optimale Menge sollte jedoch empirisch für verschiedene γH2A.X-Antikörper bestimmt werden.
4. Stellen Sie die ChIP-Röhrchen bei 4 °C auf einen Rotator und inkubieren Sie sie mindestens 5 Stunden oder vorzugsweise über Nacht.
5. In der Zwischenzeit aliquotieren Sie 100 μl magnetische Protein A/G-Kügelchen in ChIP-Qualität (siehe Materialtabelle) in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Verwenden Sie Spitzen mit breiter Öffnung und pipettieren Sie langsam, um eine genaue Messung der Kügelchen zu gewährleisten. Stellen Sie das Röhrchen für mindestens 1 Minute auf einen Magnetständer und entsorgen Sie dann vorsichtig die Flüssigkeit.
6. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 1 ml 1x PBS mit 0,5 % BSA. Bei 4 °C für ca. 4 h drehen. Stellen Sie das Röhrchen für mindestens 1 Minute auf einen Magnetständer und entsorgen Sie den Überstand.
7. Waschen Sie die Kügelchen erneut mit 1 mL 1x PBS mit 0,5% BSA. Legen Sie das Röhrchen 1 Minute lang auf den Magnetständer, um die Magnetperlen zu pelletieren, und entsorgen Sie dann den Überstand.
   HINWEIS: Die Schritte 4.5 bis 4.7 sind die Vorbeschichtung von Kügelchen, um die unspezifische Bindung von Antikörpern an magnetische Beads zu reduzieren.
8. Resuspendieren Sie die vorbeschichteten Kügelchen in 100 μl Puffer B mit Spitzen mit breiter Öffnung. Geben Sie 25 μl der vorbeschichteten magnetischen Bead-Suspension in jedes ChIP-Probenröhrchen. 2 h lang bei 4 °C drehen.
9. Legen Sie die ChIP-Röhrchen auf den Magnetständer und warten Sie, bis die Kügelchen vollständig an der Seite des Röhrchens befestigt sind und die Lösung klar wird.
10. Entsorgen Sie den durchsichtigen Überstand, ohne die magnetischen Kügelchen zu stören. Resuspendieren Sie die Kügelchen mit 1 mL Waschpuffer (siehe Tabelle 1) und drehen Sie sie 10 Minuten lang bei 4 °C.
11. Legen Sie die Röhrchen wieder auf den Magnetständer und warten Sie, bis die Lösung klar wird. Entsorgen Sie den Waschpuffer. Wiederholen Sie das Waschen für insgesamt vier Wäschen.
12. Entsorgen Sie den Waschpuffer nach dem letzten Waschen und zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz bei 400 x g für 30 s bei 4 °C, um die Restflüssigkeit herunterzuschleudern. Legen Sie die Röhrchen wieder auf den Magnetständer und entfernen Sie vorsichtig die restliche Flüssigkeit vom Boden des Röhrchens.

5. Elution und DNA-Präzipitation

HINWEIS: Die Wirksamkeit von Antikörpern kann je nach Charge variieren. Es ist wichtig, die Bindungsaffinität eines neuen Antikörpers zu bestätigen, indem die immunpräzipitierten Proben durch Western-Blot-Analyse überprüft werden.

1. Überprüfen Sie die Pulldown-Effizienz von ChIP-Antikörpern mit Western Blot (WB) wie unten beschrieben.
   1. Entnehmen Sie ein kleines Aliquot der ChIP-Probe für die Analyse (d. h. normalerweise 10 % der ChIP-Probe). Beziehen Sie das Eingangschromatin (Präimmunpräzipitation) und die Negativkontrolle (z. B. IgG-Pulldown) zum Vergleich ein.
   2. Eluieren Sie Proteine aus den Antikörper-gebundenen Kügelchen durch Erhitzen in 20 μl 1x SDS-PAGE-Ladepuffer (siehe Materialtabelle) bei 95 °C für 5 min.
   3. Laden Sie die IP-Samples, den Eingang und die Steuerelemente auf ein 15 % SDS-PAGE-Gel. Lassen Sie das Gel laufen.
   4. Übertragen Sie die Proteine auf eine 0,2 μm Nitrozellulose (siehe Materialtabelle) oder PVDF-Membran mit einem Nass- oder Halbtrockentransfersystem.
   5. Blockieren Sie die Membran mit 5 % fettfreier Milch oder BSA in TBST (siehe Tabelle 1) für 1 h bei Raumtemperatur, um eine unspezifische Bindung zu verhindern.
   6. Inkubieren Sie die Membran mit dem primären Antikörper gegen das γH2A.X (siehe Materialtabelle), verdünnt in Blockierungspuffer für 1-2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
   7. Waschen Sie die Membran 3x mit TBST, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Inkubieren Sie die Membran mit einem HRP-konjugierten Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle) für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membran erneut, um überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen.
   8. Entwickeln Sie die Membran mit einem chemilumineszierenden Substrat und visualisieren Sie das Signal mit einem Imager. Vergleichen Sie die Signalintensität zwischen den IP-, Eingangs- und Steuerspuren, um die Effizienz und Spezifität des Pulldowns zu bewerten.
      HINWEIS: Eine Bande, die dem Zielprotein in der IP-Lane entspricht, bestätigt den erfolgreichen Antikörper-Pulldown. Dieser Ansatz stellt sicher, dass Sie die Wirksamkeit des Antikörpers beim Einfangen des Zielproteins während des ChIP-Experiments bewerten können.
2. Geben Sie 50 μl Elutionspuffer (siehe Tabelle 1) zu jeder der verbleibenden ChIP-Proben. Legen Sie die Röhrchen auf einen Thermomixer und schütteln Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
3. Legen Sie die Röhren für mindestens 1 Minute auf die Magnethalterung. Sammle die Elue in neue Röhrchen. Wiederholen Sie dies 1x und sammeln Sie die Elue in denselben Röhrchen.
4. Fügen Sie jeder ChIP-Elutionsprobe zusätzlich 100 μl Elutionspuffer und jeder Eingangsprobe 180 μl Elutionspuffer hinzu.
5. 200 μl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) zu jeder Probe geben und kräftig vortexen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x g (oder maximaler Geschwindigkeit) für 10 min bei 4 °C.
6. 19 μl 3M-Natriumacetat (NaOAc, pH 5,2; siehe Tabelle 1) und 2 μl Glykogenlösung (20 mg/ml, siehe Materialtabelle) in jedes neue 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen geben.
7. Nach der Zentrifugation wird die obere wässrige Schicht (ca. 190 μl) vorsichtig auf die Röhrchen mit NaOAc und Glykogen übertragen und durch Vortexen gemischt.
8. 500 μl 100% Ethanol hinzufügen und vortexen. Die DNA ausfällen, indem die Proben mindestens 2 h oder über Nacht bei -20 °C inkubiert werden.
9. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 20.000 x g (oder maximaler Drehzahl) für 10 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und achten Sie darauf, das weiße Pellet nicht zu stören. Das Pellet in 1 mL 70%igem Ethanol resuspendieren und gründlich vortexen.
10. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 20.000 x g (oder maximaler Drehzahl) für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Zentrifugieren Sie die Röhrchen erneut kurz, um das restliche Ethanol abzuschleudern. Entfernen Sie das Ethanol vorsichtig mit einer P20-Pipette. Trocknen Sie die DNA-Pellets 2-3 Minuten lang an der Luft.
    HINWEIS: Vermeiden Sie ein Übertrocknen des Pellets, da dies dazu führen kann, dass sich die DNA nur schwer wieder auflöst.
11. Bei ChIP-Proben ist die DNA in 400 μl TE-Puffer zu resuspendieren (siehe Tabelle 1). Für die Eingangs-DNA in 1000 μl TE-Puffer resuspendieren. Die eluierten Proben können nun bei -20°C gelagert werden.

6. qPCR-Quantifizierung

1. Führen Sie die qPCR mit einem handelsüblichen Kit (siehe Materialtabelle) mit technischen Triplikaten für jede Probe durch. Bestätigen Sie das Vorhandensein eines einzelnen spezifischen PCR-Produkts durch Durchführung einer Schmelzkurvenanalyse, um die Spezifität der Amplifikation^{sicherzustellen 36}.
2. Datenanalyse
   HINWEIS: Bei der relativen Quantifizierungsanalyse wird die Testprobe als Faltenänderung relativ zu einer Kontrollprobe ausgedrückt (immunpräzipitiert mit normalem gereinigtem IgG oder Mock-IP). DNA-Locus, von denen bekannt ist, dass sie nicht von dem immunpräzipitierten Protein besetzt sind (negativer Locus), können auf diese Weise als Referenzgen im Vergleich zu bekannten, besetzten, positiven Kontroll-DNA-Loci^{verwendet werden 36}.
   1. Berechnen Sie den Prozentsatz der Eingabe für jedes ChIP mit der folgenden Formel
      %Eingang = 2(-ΔCt [normalisiertes ChIP])
   2. Normalisieren Sie die ΔCt-Werte des positiven Locus auf den negativen Locus (ΔΔCt), indem Sie den für den positiven Locus erhaltenen ΔCt-Wert vom ΔCt-Wert für den negativen Locus mit der folgenden Formel subtrahieren
      (ΔΔCt = ΔCtpositiv - ΔCtnegativ)
   3. Berechnen Sie die Faltenanreicherung der positiven Locus-Sequenz in der ChIP-DNA gegenüber dem negativen Locus mit der folgenden Formel
      Faltenanreicherung = 2ΔΔCt
      Die Sequenzen der für die Analyse verwendeten qPCR-Primer sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die genomische Organisation von FRA3B und FRA16D³⁷ist in Abbildung 3A,B dargestellt.
3. Statistische Analyse
   1. Analysieren Sie die Ergebnisse statistisch mit dem gepaarten t-Test von Student. Ein p-Wert von ≤0,05 gilt als statistisch signifikant, was darauf hindeutet, dass die beobachteten Unterschiede wahrscheinlich nicht auf zufällige Variation zurückzuführen sind³⁸.

Ergebnisse

Die Größe der Chromatinfragmente ist entscheidend für den Erfolg von nativem ChIP, da sie sich direkt auf die Zugänglichkeit von DNA-Regionen für die Antikörperbindung auswirkt. Um die optimale MNase-Konzentration für die Chromatinfragmentierung zu bestimmen, haben wir eine Reihe von Mikrozentrifugenröhrchen mit unterschiedlichen Konzentrationen von MNase (d.h. 0,0625 U, 0,125 U, 0,25 U, 0,5 U, 1 U, 2 U, 4 U, 8 U pro Reaktion) und 40 μL isolierter Zellkerne hergestellt. Jede Rea...

Diskussion

Umweltverschmutzung trägt wesentlich zu Krebserkrankungen beim Menschen bei. Viele Schadstoffe sind krebserregend, was bedeutet, dass sie genetische Schäden verursachen können, die zur Entstehung von Krebs führen^40,41. Die Bestimmung, ob eine bestimmte Substanz tumorogen ist, ist jedoch eine schwierige Aufgabe. Eine schnelle, zuverlässige und kosteneffiziente Methode zur Identifizierung des krebserzeugenden Potenzials würde...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm nitrocellulose membrane	Amersham	10600011
Actin B	proteintech	20536-1-AP
Aphidicolin	MedChemExpress	HY-N6733
ChIP-grade magnetic Protein A/G beads	ThermoFisher	26162
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	#1705061
Glycogen, molecular biology grade	ThermoFisher	Cat. No.  R0561
HRP-conjugated secondary antibody	proteintech	SA00001-2
hydroxyurea	MedChemExpress	HY-B0313
Micrococcal Nuclease	NEB	M0247S
normal IgG	Santa Cruz	sc-2025
Taq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725120
γH2A.X antibody  (for ChIP)	Sigma-Aldrich	05-636
γH2A.X antibody (for WB)	Cell Signaling	#25955