Ce travail a été soutenu par le Département américain de la Défense (BC075554 à BG et BC061403 à DK), US National Institutes of Health (U54GM064346 d&#39;JvR; CA100324 à JC, JES et JW; CA77522 à JES, U54CA126511 à JC et BG). Nous remercions D. Entenberg de l&#39;aide pour la microscopie, M. Rottenkolber pour les aider dans la fabrication de la boîte de l&#39;imagerie et J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) pour l&#39;anticorps F4/80.

1. Génération des tumeurs fluorescentes à l&#39;aide d&#39;injection de cellules tumorales mammaires dans le pavé gras: <ol><li> Cultivez une lignée cellulaire exprimant Dendra2 protéines (comme un marqueur cytoplasmique) à 40 - 80% de confluence. </li><li> Rincer la vaisselle au moins 3 fois avec du PBS w / o Ca 2 + ou Mg 2 +. </li><li> Ajouter 3 ml de trypsine par 10 cm de plat et incuber à 37 ° C jusqu&#39;à ce que la plupart des cellules se détachent et ensuite frappé du plat contre une surface plane pour le secouer. </li><li> Rincer toutes les cellules hors du plat, et d&#39;utiliser un grattoir (spatule en caoutchouc) pour collecter la matrice ainsi. Ajouter les 5 ml de PBS. Prélever une partie aliquote de compter pendant la centrifugation. </li><li> Centrifuger à 800 g pendant 5 min. </li><li> Aspirer et remettre en suspension dans du PBS à une concentration de 5 - 10x 10 6 / ml. Magasin de la glace jusqu&#39;à injecté (injecter dans les 30 min). </li><li> Placez une cage contenant 4-5 semaines vieilles immunitaire féminin souris déficientes (par exemple SCID) à l&#39;intérieur d&#39;une hotte stérile. </li><li> Pulvériser la zone autour de la 4ème (abdominaux) mamelon avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Injecter 0,1 ml dans coussinet adipeux mammaire. Si un assistant peut être trouvé, une personne peut tenir la souris en place tandis que les autres insertions de l&#39;aiguille à l&#39;intérieur du pad mammaires graisse. Si vous vous injectez vous-même, mettre la souris sous anesthésie légère en utilisant l&#39;isoflurane. </li><li> Une fois la tumeur s&#39;est développée pour 5-7 mm, la fenêtre d&#39;imagerie mammaire (MIW) doit être inséré. Remarque: Vous pouvez également, pour certaines applications, la MIW peuvent être insérés sur le dessus du pavé saine graisse mammaire et les cellules peuvent être injectées par la suite. Cette approche permet l&#39;imagerie de cellules transfectées de façon transitoire dans un environnement physiologique. </li></ol> 2. La fabrication manuelle de la fenêtre d&#39;imagerie mammaire (MIW): <ol><li> MIWs (figure 1A) sont faits de plastique de qualité des tissus afin de garantir la biocompatibilité. Pour la construction manuelle, on utilise 5 ou 10 cm plats. </li><li> Mettez des gants en latex sur. </li><li> Faire chauffer un plat de culture de tissus et creat une surface incurvée en appuyant sur un arrondi, un objet dur contre le plat chaud (nous utilisons un peu de 1 pouce dremmel pour cela). </li><li> Découpez le centre du plat en utilisant une lame de rasoir chauffé. </li><li> Utilisez un petit peu en forme de cône dremmel de faire un trou dans le centre de la coupole en forme de base en plastique (6-7mm de diamètre). </li><li> Faire les bords de la base en plastique complètement lisse en la ponçant avec du dremmel et encore son dépôt. </li><li> Fichier en haut de la base en plastique faisant une surface plane pour la lamelle de verre. Le diamètre de l&#39;déposée, surface plane doit être 9-10mm. </li><li> Collez les circulaires en verre 8mm lamelle (numéro 1) sur la surface aplanie à l&#39;aide de la superglue (colle cyanoacrylate). </li><li> Attendez que la colle sèche (15 minutes). </li><li> Utilisez une aiguille chauffée 26G de faire huit trous suture perforation de l&#39;extérieur (où le verre est) à l&#39;intérieur de la base. Les trous devraient être réparties uniformément autour de la lamelle, 0,5-1mm du bord de la lamelle. </li><li> Élargir les trous à l&#39;aide d&#39;une aiguille 5-0 suture. </li><li> Perforant des trous dans la base en plastique feront la surface interne inégale. L&#39;utilisation de papier de sable, font de cette surface complètement lisse. </li><li> Changer les gants et une brosse de petites particules de plastique de la MIW utilisant une petite brosse. </li><li> Laver la MIW à l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Laver la MIW utilisant 70% d&#39;éthanol. Utilisez un coton-tige pour nettoyer le verre de sorte qu&#39;il est complètement transparent. S&#39;il ya des taches de brouillard présents de la vapeur de colle, bien utiliser de l&#39;acétone avec un Q-tip. </li><li> Stériliser le MIW par l&#39;exposition aux UV pendant 3 heures à chaque côté. </li></ol> Semi-manuel de fabrication de la fenêtre d&#39;imagerie mammaire (MIW): Pour fabriquer la base en plastique, nous sommes actuellement en utilisant des moules en silicone coulée créés à l&#39;aide faite à la main MIWs. Le moule est composé de deux parties de caoutchouc de silicone qui font une réplique exacte de l&#39;avant et l&#39;arrière de l&#39;original lorsqu&#39;il est rempli de résine de polyester et puis immédiatement réunis. La résine polyester liquide est mélangé 09h10 et les résultats dans une structure dure lorsqu&#39;il est complètement séché en 48h. Le plastique est protégé contre les UV et les archives sans se décomposer ou de devenir jaune au cours du temps. Après que la base est guéri, les étapes sont réalisées 02.08 à 02.16 de la même manière que pour MIWs manuellement fait. 3. Insertion de l&#39;MIW: <ol><li> La zone autour du mamelon 4 e doit avoir un petit (diamètre 5-7 mm) de tumeurs plusieurs jours / semaines après l&#39;injection des cellules tumorales en fonction du type cellulaire (figure 1B). Combien de temps s&#39;est écoulé après l&#39;injection de cellules exprimant la protéine Dendra2 photoswitchable ou d&#39;autres protéines fluorescentes dépend de la lignée cellulaire utilisée. La tumeur ne doit pas être visiblement nécrotiques, et devrait avoir une peau intacte avec des cheveux sur le dessus de la tumeur. Souris présentant des tumeurs nécrosées doivent être euthanasiés. </li><li> Préparez l&#39;espace stérile pour la chirurgie-fixer un morceau de tissu stériles à l&#39;intérieur d&#39;une hotte stérile. Placer un morceau de stériles gauze dans le milieu, et de jeter une MIWs quelques instruments stériles autour de lui: nous utilisons la norme petits ciseaux, les ciseaux à ressort, pinces microdissecting, forceps microdissecting, porte-aiguille. Gardez stériles Q-tips, une bouteille d&#39;éthanol à 70% et des gants stériles dans le coin de la hotte. </li><li> La souris est anesthésiée dans la hotte stérile à l&#39;aide d&#39;injection IP de 2,5% Avertin (20 pi / g) dans HBSS, ou encore 10 ug / kg de kétamine + 10 pg / g de xylazine (contactez votre Institut en soins des animaux pour les approbations et de la commande). Note: La solution doit être préparée Avertin bi-hebdomadaire, stérilisée par filtration en utilisant un filtre de 0,22 um et stocké que 500 aliquotes à 4 ° C (dans l&#39;obscurité). </li><li> Enlever les poils par le rasage de la zone au-dessus de la tumeur en utilisant un rasoir de petits animaux. </li><li> Retirer le reste de la chevelure à l&#39;aide de crème d&#39;épilation Nair (disponible en pharmacie). Nettoyer la peau à l&#39;aide d&#39;éthanol par immersion Q-tips. </li><li> Transfert de l&#39;animal sur la gaze stérile et appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux pour les empêcher de sécher et de l&#39;infection. </li><li> Stériliser la peau avec de la Bétadine et propre avec de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Transfert de l&#39;animal sur un chiffon chirurgical stérile intérieur de la hotte stérile. </li><li> Tirez la peau immédiatement en dedans du mamelon aide de pinces et couper ~ incision de 2mm dans la peau. </li><li> Séparez les sous-tendent pad mammaires graisse de la peau avec des ciseaux de dissection et une pince. La peau et étirer le trou lors de cette étape de séparation à une taille qui va accueillir l&#39;insertion de la MIW. </li><li> Si par hasard un navire est touché pendant l&#39;intervention chirurgicale, de façon stérile Q-tips pour enlever toute trace de sang qui est produit / d&#39;arrêter l&#39;hémorragie de devenir excessif. </li><li> Insérez la MIW telle qu&#39;il n&#39;y ait la peau sur le dessus de la base de MIW et la suture en place à l&#39;aide non-résorbables fil et inverser la coupe aiguille. </li><li> Utilisez le tissu adhésif ou cyanoacrylate pour combler les trous de suture et sécuriser le MIW à la peau. </li><li> Ajouter au TMP-SMX mélange d&#39;antibiotiques: (sulfaméthoxazole 0,6 mg / ml, 0,12 mg triméthoprime / ml) dans la bouteille d&#39;eau en cage pendant 3 jours avant et après la chirurgie. </li><li> L&#39;animal reste sous anesthésie pour 1-4h après injection IP Avertin. Depuis l&#39;opération prend généralement ~ 45min, il est important d&#39;aider l&#39;animal de récupérer par la suite: </li><li> Placez un coussin chauffant la main (37 ° C) (disponible en pharmacie) sur le fond de la cage et le couvrir avec de la gaze. </li><li> Gardez l&#39;animal sur le dessus du pavé jusqu&#39;à ce qu&#39;il tourne sur le ventre et commence à marcher. </li><li> Si l&#39;animal est inconscient depuis plus de 3h, injecter 0,3 ml de HBSS par voie intrapéritonéale pendant la réhydratation. </li><li> L&#39;animal est autorisé à récupérer au fil des jours 3-4 prochaines avant la session d&#39;imagerie première a lieu. </li></ol> 4. Construction Boîte Imaging La boîte d&#39;imagerie assure que la MIW est assis à plat, juste au-dessus de l&#39;objectif du microscope. Il facilite également la température et le contrôle anesthésie par flux d&#39;air constant de l&#39;isoflurane. La boîte est faite de plexiglas et collées ensemble en utilisant soudure plastique. Il est équipé de la platine du microscope spécifique et donc la forme de son fond varie selon le microscope utilisé (figure 2 montre le schéma de la boîte équipée d&#39;étape de Leica microscope SP5). Dimensions de la boîte en centimètres sont L = 11,4 cm, l = 7,6 cm, h = 4,4 cm (figure 2A). Le fond de la boîte se compose d&#39;une plaque creuse, 12.7x8.4 cm en taille, qui s&#39;inscrit à l&#39;intérieur du stade de Leica SP5 microscope, et deux coulissantes &quot;portes&quot;, 5,7 x 5,7 cm_each, qui forment une ouverture circulaire (d = 2,22 cm ) lorsqu&#39;il est fermé. Le MIW s&#39;inscrit dans cette ouverture. La pièce avant contient le trou d&#39;entrée pour la livraison d&#39;anesthésie alors l&#39;une des pièces latérales contient un trou de sortie qui mène à la dépression. Notez que le condenseur et le support de diapositives doivent être retirés avant le placement boîte d&#39;imagerie. 5. Boîte Imaging Utilisez <ol><li> Placez l&#39;animal sous anesthésie à l&#39;isoflurane et d&#39;appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux. </li><li> Fixez l&#39;échappement d&#39;isoflurane l&#39;appareil d&#39;anesthésie à l&#39;avant boîte de l&#39;imagerie, à l&#39;extérieur de l&#39;orifice d&#39;entrée (figure 2B). </li><li> Fixez un second tube à l&#39;orifice de sortie de la boîte de l&#39;imagerie. Ce tube doit être fixé sur le filtre à gaz, puis à la dépression. </li><li> Ouvrez le couvercle de la boîte et ouvrez les portes boîte et placer l&#39;animal, côté face MIW le fond, et les portes coulissantes dans la boîte. </li><li> Tenez la boîte et d&#39;ajuster les portes du bas pour que la base MIW est détenu et immobilisé entre eux. La base de MIW devrait être au même niveau que les portes boîte d&#39;imagerie, tandis que la lamelle MIW devrait être de quelques millimètres en dessous de ce niveau. Assurez-vous que le positionnement de la MIW entre le bas des portes coulissantes assure que la lamelle (partie vitrée de la MIW) repose à plat, parallèle à la porte en bas de la boîte. Cela permettra d&#39;assurer concentrant appropriée. </li><li> Basse l&#39;objectif du microscope, pour permettre à l&#39;espace pour le placement de la boîte surhaut de la platine du microscope. </li><li> Placez la boîte sur la platine du microscope, et d&#39;ajuster la scène de telle sorte que la lamelle MIW est au-dessus de l&#39;objectif. </li><li> Concentrer l&#39;objectif et de commencer l&#39;imagerie. </li><li> Tout en utilisant l&#39;isoflurane, l&#39;animal doit être surveillé par une inspection visuelle de la fréquence de la respiration. Cela peut être fait visuellement, ou par la surveillance de la fréquence des artefacts respiratoires apparaissant lors de l&#39;imagerie de collecte (qui peuvent interférer avec l&#39;acquisition de données). Le système MouseOx oxymétrie de pouls (Starr Sciences de la vie Corp) a été utilisé avec succès. De cette façon, les données peuvent être collectées en continu, sans éteindre les lumières allumées dans la pièce à vérifier sur l&#39;animal. Remarque: Après chaque séance d&#39;imagerie, la récupération des animaux devrait être facilitée par un tampon d&#39;emballage petite main de chauffage dans une gaze ou Kimwipes et le mettre sous l&#39;animal dans la cage. Remarque: Si un objectif à immersion est utilisé pour l&#39;image à travers la MIW, le milieu d&#39;immersion (glycérol, eau, huile) doit être nettoyé de la fenêtre d&#39;imagerie. Le MIW devrait être inspecté pour déceler toute fissure ou autre dommage qui pourrait survenir lors de l&#39;imagerie. Cela est essentiel pour la collecte des données lors des séances d&#39;imagerie multiples. </li></ol> 6. Photocommutation et l&#39;imagerie de cellules marquées Dendra2 La procédure est décrite pour le microscope confocal Leica SP5, la puissance du laser dans le plan focal, les objectifs et les options disponibles lorsque vous utilisez le logiciel varient d&#39;autres microscopes confocaux ou l&#39;imagerie multiphotonique mis en place, et donc le protocole décrit ci-dessous doit être utilisée comme un guide afin d&#39;optimiser l&#39;expérience sur votre microscope. <ol><li> En observant la tumeur à travers l&#39;oculaire (10x) avec le filtre de fluorescence verte, de localiser les principaux vaisseaux sanguins qui sont visiblement fluide et à plat dans le même plan focal. </li><li> Position un des navires dans le centre du terrain et passer à la détection PMT. </li><li> Mettre en place la collecte d&#39;imagerie séquentielle pour deux canaux. Un des canaux utilise 488nm ligne laser (10% de puissance), et recueille la diffusion de la matrice extracellulaire (480-495nm) et d&#39;émission de la forme verte de Dendra2 (505-540nm). Le deuxième canal utilise la ligne du laser 543nm (90% de puissance) et recueille les émissions de la forme rouge de Dendra2 (555-600nm). Collecter des images en 3D pré-photocommutation. </li><li> Utilisez l&#39;option de numérisation vers le ROI PHOTOSWITCH une population choisie de cellules en utilisant la ligne du laser 405nm (30% de puissance, les scans 20-40). Recueillir des émissions de la forme rouge de la protéine pour contrôler la commutation. </li><li> En utilisant la même routine séquentielle comme dans 6.3, recueillir l&#39;après-commutation des images en 3D. </li><li> Si photocommutation plus d&#39;une région dans la tumeur, il est conseillé de prendre des photos à travers les oculaires à l&#39;aide d&#39;une caméra numérique, dans les canaux à la fois vert et rouge (figure 3A, B). Cela aidera à l&#39;orientation au cours des séances d&#39;imagerie ultérieurs. Remarque: En outre, les vaisseaux sanguins peuvent être temporairement marqués en utilisant la queue-veineuse injection de dextran fluorescent (Cascade Blue ou Alexa Fluor 647, à la fois 10kDa). Quelques heures après l&#39;injection, les dextranes laissera les vaisseaux sanguins et de façon permanente l&#39;étiquette les macrophages. </li></ol> Les résultats représentatifs: La figure 3C montre une zone rectangulaire photoswitched (rouge) orienté orthogonalement par rapport à la cuve de sang (pas de fluorescence). Non-photoswitched cellules sont vertes, tandis que la dispersion de la matrice extracellulaire est le violet. L&#39;image est une projection d&#39;intensité maximale de quatre images le long de l&#39;axe Z. (20-50 um de profondeur).

<ol>
	<li>Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+of+tumor+cells+visualized+in+living+intact+primary+tumors+using+green+fluorescent+protein.">Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein.</a> Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).</li><li>Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. 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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PBS w/o Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190-144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM media (MDA-MB-231 cells)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11965</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane(Aerrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td># NDC 10019-773-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SCID mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NCI</td>
<td>N/A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353003</td>
<td>Custom Order</td>
</tr>
<tr>
<td>Circular coverslip 8 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific, Inc.</td>
<td>8CIR-1-FIS</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dendra2 photoswitching through the mammary imaging window

Dans la dernière décennie, la microscopie intravitale des tumeurs mammaires chez la souris et le rat à une seule cellule de résolution<sup&gt; 1-4</sup&gt; A abouti à des informations importantes sur les mécanismes du comportement métastatique telles que la migration, l&#39;invasion et intravasation des cellules tumorales<sup&gt; 5, 6</sup&gt;, L&#39;angiogenèse<sup&gt; 3</sup&gt; Et la réponse immunitaire des cellules<sup&gt; 7-9</sup&gt;. Nous avons récemment rapporté une technique à l&#39;image orthotopique carcinomes mammaires sur plusieurs séances d&#39;imagerie intravitale chez la souris vivante<sup&gt; 10</sup&gt;. Pour cela, nous avons développé une fenêtre d&#39;imagerie mammaire (MIW) et des paramètres optimisés pour l&#39;imagerie Dendra2<sup&gt; 11</supPhotocommutation&gt; et l&#39;imagerie<em&gt; In vivo</em&gt;. Ici, nous décrivons le protocole pour la fabrication de MIW, l&#39;insertion de la MIW sur le dessus d&#39;une tumeur et l&#39;imagerie des cellules tumorales Dendra2 marqué à l&#39;aide d&#39;une boîte d&#39;imagerie sur mesure. Ce protocole peut être utilisé pour l&#39;image du comportement métastatique des cellules tumorales dans des microenvironnements distincts dans les tumeurs et permet à l&#39;imagerie à long terme des vaisseaux sanguins, les cellules tumorales et les cellules hôtes.

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Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

Photocommutation intravitale et de suivi des Dendra2 marqué les cellules tumorales à travers la fenêtre d&#39;imagerie mammaire est une technique qui permet d&#39;imager le comportement métastatique des cellules tumorales dans des microenvironnements tumoraux choisis sur une échelle de temps de jour.

Dendra2 photocommutation travers la fenêtre d&#39;imagerie mammaire

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

dendra2-photoswitching-through-the-mammary-imaging-window

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K vues.  Albert Einstein College of Medicine - Yeshiva University. Photocommutation intravitale et de suivi des Dendra2 marqué les cellules tumorales à travers la fenêtre d'imagerie mammaire est une technique qui permet d'imager le comportement métastatique des cellules tumorales dans des microenvironnements tumoraux choisis sur une échelle de temps de jour.

Vidéo: Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

Une méthode pour le 2-Photon Imaging du flux sanguin dans le néocortex travers une fenêtre crânienne

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

Recherche

Biologie

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Bioluminescent imagerie des tumeurs mammaires qui utilisent des fréquences IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Souris cellules épithéliales mammaires forme Mammospheres cours de la différenciation lactogène

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Mammaires épithéliales procédure de greffe

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Injection intra-canalaire pour localisée Drug Delivery de la glande mammaire de souris

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imagerie à travers le cas de la nymphe<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.

Techniques de biopsie des glandes mammaires bovine

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, ...

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is key to understanding not only its life cycle, but also to uncover imbalances in the proteostasis network. This method shows how to track the degradation of the disease-causing protein huntingtin. Two versions of huntingtin fused to Dendra2 are expressed in the C. elegans nervous system: a physiological version or one with an expanded and pathogenic stretch of glutamines. Dendra2 is a photoconvertible fluorescent protein; upon a short ultraviolet (UV) irradiation pulse, Dendra2 switches its excitation/emission spectra from green to red. Similar to a pulse-chase experiment, the turnover of the converted red-Dendra2 can be monitored and quantified, regardless of the interference from newly synthesized green-Dendra2. Using confocal-based microscopy and due to the optical transparency of C. elegans, it is possible to monitor and quantify the degradation of huntingtin-Dendra2 in a living, aging organism. Neuronal huntingtin-Dendra2 is partially degraded soon after conversion and cleared further over time. The systems controlling degradation are deficient in the presence of mutant huntingtin and are further impaired with aging. Neuronal subtypes within the same nervous system exhibit different turnover capacities for huntingtin-Dendra2. Overall, monitoring any protein of interest fused to Dendra2 can provide important information not only on its degradation and the players of the proteostasis network involved, but also on its location, trafficking, and transport.

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Presented here is a protocol to monitor degradation of the protein huntingtin fused to the photoconvertible fluorophore Dendra2.

In Vivo Quantification du chiffre d’affaires des protéines dans le vieillissement C. Elegans à l’aide de Photoconvertible Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in combination with skin flap surgery or implantation of imaging windows has been used to study the dynamics of the healthy mammary gland at different developmental stages. Most mammary imaging technologies are limited to a time frame of hours to days, whereas the majority of mammary gland remodeling processes occur in time frames of days to weeks. To study mammary gland remodeling, methods that allow optical access to the tissue of interest for extended time frames are required. Here, an improved version of the titanium mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW) is described that allows high-resolution imaging of the mammary gland with a cellular resolution for up to several weeks. Importantly, the R.MIW provides tissue access over the entire duration of the intravital imaging experiment and could therefore be used for local tissue manipulation, labeling, drug administration, or image-guided microdissection. Taken together, the R.MIW enables high-resolution characterization of the cellular dynamics during mammary gland development, homeostasis, and disease.

This protocol describes a novel mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW). Intravital microscopy after implantation of the R.MIW allows for longitudinal and multi-day imaging of the healthy and diseased mammary gland with a cellular resolution during the different developmental stages.

Microscopie intravitale longitudinale à l’aide d’une fenêtre d’imagerie mammaire avec couvercle remplaçable

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>Microscopie subcellulaire intravitale de la glande mammaire

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

Microscopie subcellulaire intravitale de la glande mammaire

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...