1. Préparation de l&#39;épithélium Transplant Tissu du donneur frais ou congelés épithéliales peuvent être transplantées dans le coussin effacé la graisse, mais une préparation préalable de l&#39;épithélium des bailleurs de fonds gelés est plus pratique avec une diminution minimale de l&#39;efficacité de la transplantation (efficacité&gt; 85%). Le protocole pour la préparation de l&#39;épithélium des bailleurs de fonds gelés est comme suit: Avant de préparer l&#39;épithélium greffe des donateurs, des médias congeler pour préparer l&#39;épithélium et aliquot environ 1 ml dans des cryotubes. Cela peut être conservé à 4 ° C pour un maximum de 6 mois jusqu&#39;à ce que nécessaire. Gel des médias contient DMEM/F12 médias tamponnée avec HEPES et NaHCO 3, 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO). Récolte épithélium mammaire d&#39;une souris récemment euthanasiés femelle. <ol><li> Laver la souris avec de l&#39;EtOH 70%. </li><li> Faites une coupe mi-sagittale à travers la paroi du corps s&#39;étendant du pubis au sternum sans percer la membrane séreuse de la cavité ventrale du corps. Faire une coupe oblique de l&#39;incision initiale au niveau du pubis vers chaque patte postérieure (Figure 1). </li><li> Peler la paroi du corps loin de la membranes séreuses pour exposer le 5 ème glandes mammaires inguinales attaché à la planche de bord sur le dessous de la paroi du corps. La meilleure façon d&#39;y parvenir est en saisissant les membranes séreuses avec soin la partie incurvée d&#39;une paire de pinces courbes, en faisant attention à ne pas percer la cavité ventrale du corps. Simultanément, saisissez le bord coupé du tégument avec une pince dentée droite et tirez la paroi du corps loin de la membranes séreuses. </li><li> Identifier les ganglions lymphatiques dans la glande mammaire. Le ganglion est situé à l&#39;intersection de trois vaisseaux sanguins de premier plan dans la glande mammaire et peut être ressenti comme un nodule dense dans le coussinet adipeux (figure 2). Avec la pointe d&#39;une paire de ciseaux des yeux, étouffer le tissu adipeux entourant le nœud. Avec un doigt avant sur le côté épidermique de la peau, appliquer une pression pour élever le noeud hors du coussinet adipeux et pincez avec une paire de pinces courbes. Jeter les ganglions lymphatiques. </li><li> Tout en maintenant les marges de la peau, saisir le pad mammaires graisse avec le bord incurvé d&#39;une paire de pinces courbes et progressivement éplucher les coussinet adipeux loin de la paroi du corps. Suivre la direction du coussinet adipeux vers la surface dorsale de la souris comme vous enlever la glande mammaire de toute une pièce. </li><li> Mettez la glande mammaire sur un bloc de coupe en plastique stérile. Ajouter une petite quantité de médias, à environ 200 pi, à la surface de la glande pour le garder humide. Hacher la glande en morceaux 1mm avec une lame de rasoir propre. Divisez la glande hachée en quatre portions et distribuer entre quatre cryotubes des médias gel avec une pince. Mettez les cryotubes dans un Nalgene &quot;congélateur M. cellules Frosty qui a 250ml d&#39;alcool isopropylique dans le compartiment externe. Mettez au congélateur Nalgene dans un congélateur à -70 ° C pendant 24 heures. Conserver les flacons congelés de fragments mammaires dans l&#39;azote liquide jusqu&#39;à requis pour transplantation. Chaque cryovial va contenir des fragments de glande mammaire de suffisamment de transplanter dans les coussinets effacé la graisse de 4 à 8 souris hôte. </li></ol> 2. Préparation des cellules Transplant Notre laboratoire a transplanté différents types de cellules, y compris immortalisé lignées de cellules épithéliales mammaires, des lignées cellulaires tumorales mammaires ou des cellules primaires mammaires de souris dans un coussinet adipeux effacé. Le protocole pour la préparation des virgules D cellules pour la transplantation est la suivante: <ol><li> Comma-D cellules sont cultivées dans les médias réguliers MECL contenant du DMEM: F12 supplémenté avec 2% de sérum bovin adulte (ABS), mEGF, insuline, antibiotique / antimycotique (AB / AM). </li><li> Récolte Comma-D cellules lorsque les cellules sont confluentes à 85% -90%. </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire à 1200rpm pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules. Resuspendre les cellules dans l&#39;eau douce des médias MECL et ajuster la concentration de cellules de 5 x 10 6 / ml. </li></ol> Pour la transplantation de cellules primaires mammaires, les cellules épithéliales mammaires primaires sont isolés de souris 5 ème glandes mammaires par dissociation mécanique et enzymatique. Les cellules sont remises en suspension dans du DMEM: F12 et des médias ajusté à la concentration désirée, généralement de 5 x 10 6 / ml. 3. Procédure standard pour la compensation de la glande mammaire de souris Fat <ol><li> Anesthésier la souris trois semaines vieil hôte. Sélectionnez les souris qui sont &lt;12 g pour s&#39;assurer que la croissance mammaires canalaires n&#39;a pas été initié. Nous utilisons 200mg/kg de poids corporel de 2,2,2-tribromoéthanol. </li><li> Après la souris est anesthésiée, fermement empêcher la souris, la face ventrale avec des membres tendus, sur une scène chirurgicale afin que l&#39;abdomen est narguer. Avant la chirurgie, d&#39;administrer des analgésiques; soit bupivacaïne (1mg/kg &lt;) ou buprénorphine (0.05mg/kg), sous-cutanée. </li><li> Saisir la peau avec une pince de quelques millimètres au-dessus du bassin et le soulever de l&#39;abdomen<html> . Nip la peau avec des ciseaux et de faire une coupe mi-sagittale à travers la paroi du corps s&#39;étendant du pubis au sternum. Ne pas percer les membranes séreuses de la cavité ventrale du corps. Ne faites pas votre incision initiale trop proche de l&#39;urètre afin que les clips blessure ne sera pas interférer avec la capacité de la souris pour uriner. </li><li> De l&#39;incision initiale, faire des coupes obliques à travers la peau de la mi-ligne à travers le bassin vers chaque patte postérieure. </li><li> Utilisez la zone incurvée de la pince incurvée pour saisir délicatement les membranes séreuses. Utilisez une pince pour saisir les tissus de la marge de coupe de la peau et tirez la paroi du corps loin de la membranes séreuses et d&#39;exposer la 5 ème glandes mammaires inguinales situées sur la façade sur le dessous de la paroi du corps. </li><li> Cautériser le mamelon, noeud et deux artères menant au nœud (figure 2) </li><li> Séparer les glandes quatrième et cinquième. Cautériser la marge de la glande cinquième à éviter interposition de la glande 6 ème. </li><li> Divisez le coussinet adipeux de la glande mammaire par quatrième coupant le coussinet adipeux avec des ciseaux juste ventrale (côté vers mamelon) du noeud. Utilisez une pince incurvée de saisir fermement la partie ventrale du coussinet adipeux et il se détache de la paroi du corps en un seul morceau. Appuyez sur la partie ventrale du coussinet adipeux entre deux diapositives et mettre dans un plat en verre coloration histologique contenant fixateur de Carnoy. Ce tissu sera fixé et coloré plus tard avec solution d&#39;alun de carmin pour vérifier les marges effacé (figure 3). Nettoyez le fascia autour de la région de la partie enlevée du coussinet adipeux pour éliminer toute trace de la glande mammaire avec la pince courbe. </li></ol> 4. Alternative &quot;Procédure Sparing pour la compensation du coussinet adipeux Après une est devenue compétente avec la procédure standard pour la compensation du tapis de souris mammaires graisses, ils peuvent préférer tenter la procédure en épargnant moins invasif développé par Brill et al. (2008) 2. <ol><li> Préparer la souris comme pour la procédure standard. </li><li> Saisir le mamelon de la glande mammaire de quatrième inguinale et découpez un cercle 3-5 mm circonférence autour du mamelon avec la pointe de ciseaux. </li><li> Tirez la tétine loin du corps pour détacher la partie découpée de la peau et tirer le quatrième glande mammaires inguinales par le trou. </li><li> Identifier le nœud. Utilisez la cautérisation cautériser le noeud et la glande mammaire de 6 ème à travers le trou. </li><li> Couper et détacher la partie la plus superficielle de la glande mammaire de 5 ème, juste avant le nœud. Le mamelon, zone circulaire de la peau et une partie de l&#39;épithélium coussinet adipeux mammaires contenant sont retirés en une seule pièce. </li></ol> 5. Tissu / transplantation de cellules <ol><li> Pour les fragments épithélium transplantation, décongeler un cryovial de l&#39;épithélium et le transfert des fragments épithéliaux d&#39;une boîte de Petri contenant un milieu frais pour diluer le DMSO. Faire un petit trou ou une poche dans le pad effacé la graisse avec la pointe de ciseaux pour le nouvel épithélium. Mettre un morceau de 1 mm de l&#39;épithélium des bailleurs de fonds dans la poche avec une pince aiguille. Tenir la poche fermée avec une pince le tissu que vous retirer l&#39;aiguille de sorte pince le tissu reste en place. </li><li> Pour les cellules du repiquage, d&#39;injecter 50 000 cellules dans 10 ul de médias dans chaque coussinet adipeux aide d&#39;une seringue 50 pl Hamilton avec une aiguille de calibre 22s. </li></ol> 6. Fermeture / Relance de la souris <ol><li> Disposer de la peau pour la fermeture. Saisir opposés marges de la peau, les maintenir ensemble avec des pinces, les soulever loin de la membranes séreuses de la cavité ventrale du corps et fermer avec des clips plaie. Typiquement, il est nécessaire d&#39;utiliser deux clips pour fermer l&#39;incision sagittal et un clip pour chaque incision oblique pour la procédure standard. Evitez d&#39;obstruer l&#39;urètre. Il peut être nécessaire pour combler les lacunes dans la peau à l&#39;intersection des incisions mi-sagittal et oblique, avec une suture. La procédure en épargnant ne nécessiteront un clip blessure pour chaque côté. </li><li> . Placez la souris dans sa cage et garder la cage sous une lampe chauffante jusqu&#39;à ce que la souris a relancé. </li><li> Les clips plaie doit être retiré après 2 semaines. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Démonstration du modèle de l&#39;incision. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Situation des ganglions lymphatiques, les vaisseaux sanguins, le mamelon et l&#39;épithélium endogène. Cauterize aux endroits indiqués. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Montez la figure 3. Entier démontre que l&#39;épithélium endogène est limité à la zone dans le cercle et donc les marges sont &quot;clairs&quot;. 7. Les résultats représentatifs _r.jpg &quot;alt =&quot; Figure 4 &quot;/&gt; Figure 4. Monter entiers de coussinet adipeux retirés de souris à 3 semaines anciennes montrant des marges effacés. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2_r.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Monture entier d&#39;une souris 10 semaines anciennes montrant coussinet adipeux débarrassé de l&#39;épithélium mammaire endogène. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3_r.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6. Hématoxyline et l&#39;éosine la section teinté d&#39;un tampon effacé la graisse d&#39;une souris 10 semaines vieux. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig4_r.jpg" alt="Figure 7" /> Figure 7. Mont entier d&#39;une souris 10 semaines anciennes montrant normale arbres mammaires canalaires développé à partir de l&#39;épithélium transplanté. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig5_r.jpg" alt="Figure 8" /> Figure 8. Hématoxyline et l&#39;éosine la section des conduits mammaires teinté développé à partir de l&#39;épithélium transplanté. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig6_r.jpg" alt="Figure 9" /> La section Figure 9. Hématoxyline et l&#39;éosine teinté d&#39;une tumeur mammaire développé à partir de l&#39;épithélium transplanté.

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	<li>DeOme, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice.">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li><li>Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sparing+procedure+to+clear+the+mouse+mammary+fat+pad+of+epithelial+components+for+transplantation+analysis.">A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis.</a> Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).</li><li>Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammary-specific+model+demonstrates+the+role+of+the+p53+tumor+suppressor+gene+in+tumor+development.">A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development.</a> Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).</li><li>Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -. L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439, 993-997 (2006).</li><li>Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preneoplastic+Lesions+in+Murine+Mammary+Cancer.">Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer.</a> Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).</li><li>Wagner, K. -. U., Boulanger, C. A., Henry, S. g. a. g. i. a. s., Hennighausen, M., Smith, G. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adjunct+mammary+epithelial+cell+population+in+parous+females:+its+role+in+functional+adaptation+and+tissue+renewal.">An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal.</a> Development. 129, 1377-1386 (2002).</li><li>Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+and+progesterone+induce+persistent+increases+in+p53-dependent+apoptosis+and+suppress+mammary+tumors+in+BALB/c-Trp53+/-+mice.">Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).</li></ol>

Dans ce rapport, nous présentons deux méthodes alternatives pour dégager le tapis de souris mammaires de graisse dans la préparation de greffes mammaires épithéliales. La procédure standard a été en usage depuis son élaboration en 1959 par RomanDing et al. 1 Bien plus invasives, la méthode standard est la méthode préférée pour la formation des novices, car la structure et l&#39;orientation de la glande mammaire sont facilement visualisés. Toutefois, la procédure en épargnant peut ê...

mammary epithelial transplant procedure

Cet article décrit et compare la procédure de dédouanement coussinet adipeux développé par RomanDing Ko et al. 1 et la procédure en épargnant développé par Brill B et al. 2, suivie par la procédure de greffe épithéliales mammaires. La procédure de greffe mammaire est largement utilisée par les biologistes mammaires car il faut profiter du fait que le développement significatif de l&#39;épithélium mammaire ne se produisent qu&#39;après la puberté. A 3 semaines d&#39;âge, la croissance de l&#39;arbre épithéliales mammaires est confinée à la proximité de la tétine et le coussinet adipeux est largement dépourvue d&#39;épithélium mammaire, mais par sept semaines d&#39;âge de l&#39;arbre canalaire s&#39;étend à travers l&#39;épithélium du pavé toute la graisse. Par conséquent, si cette petite portion du coussinet adipeux contenant l&#39;épithélium, la région entre le mamelon et le ganglion lymphatique, est enlevé à 3 semaines d&#39;âge, l&#39;épithélium endogènes ne sera jamais remplir le pad mammaires graisse et le coussinet adipeux est décrit comme «effacé ». A cette époque, l&#39;épithélium mammaire d&#39;une autre source peut être transplantées dans le coussin effacé graisse où il a le potentiel pour étendre mammaires canalaires arbres à travers le coussinet adipeux. Cette procédure a été utilisée dans de nombreux modèles expérimentaux, y compris l&#39;examen de phénotype tumoral dans le tissu épithélial mammaire transgéniques sans effets confondants du génotype sur l&#39;animal entier 3, dans l&#39;identification des cellules souches mammaires en transplantant des cellules à une dilution limitée de 4,5, la détermination Si nodules hyperplasiques procéder à des tumeurs mammaires 6, et d&#39;évaluer l&#39;effet de l&#39;exposition aux hormones sur le comportement antérieur de l&#39;épithélium mammaire 7,8. Trois souris semaine ancien hôte sont anesthésiés, nettoyés et sobre sur un stade chirurgical. Une incision médiane sagittale est faite à travers la peau, mais pas le péritoine, qui s&#39;étend du pubis au sternum. Coupes obliques sont faites à travers la peau de l&#39;incision médiane sagittale à travers le bassin vers chaque jambe. La peau est arrachée de le péritoine pour exposer la 4e glandes mammaires inguinales. Le coussinet adipeux est effacé en supprimant la partie antérieure du coussinet adipeux du tissu à l&#39;envahissement ganglionnaire. Fragments épithélium ou des cellules épithéliales sont transplantées dans le coussin reste graisses effacé et la souris est fermé.

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Mammary Epithelial Transplant Procedure

Cet article montre la procédure développée par RomanDing KB<em&gt; Et al.</em&gt; (1959) et la procédure en épargnant développé par Brill B<em&gt; Et al.</em&gt; (2008) pour la compensation du 4e inguinale pad mammaires graisse de souris pubère en préparation pour la greffe de fragments de glande mammaire, les cellules épithéliales mammaires ou les cellules tumorales mammaires.

Mammaires épithéliales procédure de greffe

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Research

JoVE Journal

Biology

30.9K vues.  University of Massachussetts. Cet article montre la procédure développée par RomanDing KB Et al. (1959) et la procédure en épargnant développé par Brill B Et al. (2008) pour la compensation du 4e inguinale pad mammaires graisse de souris pubère en préparation pour la greffe de fragments de glande mammaire, les cellules épithéliales mammaires ou les cellules tumorales mammaires.

Vidéo: Mammary Epithelial Transplant Procedure

Investigating the Immunological Mechanisms Underlying Organ Transplant Rejection

Étudier les mécanismes de rejet immunologique sous-jacente de transplantation d&#39;organes

Recherche

Biologie

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Souris cellules épithéliales mammaires forme Mammospheres cours de la différenciation lactogène

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4 has resulted in important insights into mechanisms of metastatic behavior such as migration, invasion and intravasation of tumor cells5, 6, angiogenesis3 and immune cells response7-9. We have recently reported a technique to image orthotopic mammary carcinomas over multiple intravital imaging sessions in living mice10. For this, we have developed a Mammary Imaging Window (MIW) and optimized imaging parameters for Dendra211 photoswitching and imaging in vivo. Here, we describe the protocol for the manufacturing of MIW, insertion of the MIW on top of a tumor and imaging of the Dendra2- labeled tumor cells using a custom built imaging box. This protocol can be used to image the metastatic behavior of tumor cells in distinct microenvironments in tumors and allows for long term imaging of blood vessels, tumor cells and host cells.

Intravital photoswitching and tracking of Dendra2-labeled tumor cells through the Mammary Imaging Window is a technique which allows us to image the metastatic behavior of tumor cells in chosen tumor microenvironments over a timescale of days.

Dendra2 photocommutation travers la fenêtre d&#39;imagerie mammaire

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

Right Hemihepatectomy by Suprahilar Intrahepatic Transection of the Right Hemipedicle using a Vascular Stapler

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after preparing the extrahepatic hilar structures within the hepatoduodenal ligament, even in benign tumours or liver metastasis.1-5. Regional extrahepatic lymphadenectomy is an oncological standard in hilar cholangiocarcinoma, intrahepatic cholangio-cellular carcinoma and hepatocellular carcinoma, whereas lymph node metastases in the hepatic hilus in patients with liver metastasis are rarely occult. Major disadvantages of these procedures are the complex preparation of the hilus with the risk of injuring contralateral structures and the possibility of bleeding from portal vein side-branches or impaired perfusion of bile ducts. We developed a technique of right hemihepatectomy or resection of the left lateral segments with intrahepatic transection of the pedicle that leaves the hepatoduodenal ligament completely untouched. 6 However, if intraoperative visualization or palpation of the ligament is suspicious for tumor infiltration or lymph node metastasis, the hilus should be explored and a lymphadenectomy performed.

This video describes a right hemihepatectomy with intrahepatic transection of the right hemipedicle leaving the hepatoduodenal ligament completely untouched.

Hémihépatectomie droite par Transection intrahépatique Suprahilar de l&#39;Hemipedicle droit à l&#39;aide d&#39;une agrafeuse vasculaire

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Détermination des tissus Utilisation de la transplantation Cap animale (ACT) Dosage dans<em&gt; Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

Isolement des cellules épithéliales mammaires à partir de trois dimensions de cellules mixtes Sphéroïde Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolement de la chromatine par purification d&#39;ARN (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Analyse rapide de la génétique des épithélio-mésenchymateuse signalisation lors de la régénération des cheveux

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Cryosectioning Méthode de microdissection de murin côlon Muqueuse

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.