Pour commencer, placez la souris rasée et anesthésiée sur un coussin chauffant. Pincez la peau avec une pince à épiler près du quatrième mamelon et coupez la peau en relief avec des ciseaux pointus pour faire une incision médiane d’environ un centimètre. Faites des incisions circulaires autour de la glande dans les directions crânienne et caudale, et retirez soigneusement la peau de l’abdomen.
Retirez rapidement tout sang exogène avec une solution saline physiologique pour éviter une perte ultérieure de résolution optique. Pour minimiser la perte de sang, scellez tous les vaisseaux sanguins proéminents avec un cautériseur portable. Ensuite, taquinez doucement la couche superficielle à l’aide d’une pince fine pour éliminer le tissu conjonctif et adipeux superficiel.
Gardez la glande exposée humide avec une solution saline physiologique. Si nécessaire, traitez la glande avec des agents exogènes, par exemple des agents pharmacologiques ou des colorants spécifiques aux organites en baignant les glandes exposées pendant l’opération. Protégez la paroi abdominale avec un film thermoplastique semi-transparent et flexible.
Positionnez soigneusement la souris avec le côté abdominal vers le bas sur une platine de microscope inversée de sorte que le rabat cutané s’étende sur le verre de couverture central. Protégez les zones exposées avec une fine couche de gel. Collez la patte arrière et la queue à la scène.
Ensuite, placez une entretoise crantée sur mesure préparée à partir de trois bâtons de coton collés entre le rabat de peau et la paroi du corps pour amortir la glande des artefacts de mouvement causés par la respiration et le rythme cardiaque. Collez solidement un couvercle en plastique à chaque extrémité de l’ouverture de la platine pour empêcher le rabat cutané de glisser pendant l’imagerie. Insérez un cathéter à demeure sous-cutané sous la peau dorsale attaché à un tube, une seringue et une pompe.
À l’aide de la microscopie à fluorescence conventionnelle, confirmez que le lambeau de peau est stable avec un flux sanguin adéquat. Effectuer la microscopie confocale conventionnelle de la souris EGFP cyto ou EGFP membrane marquée avec BODIPY 665676 et la microscopie à deux photons de la souris membrane EGFP marquée au monodansylpentane et la souris à membrane tdTomato marquée au monodansylpentane. Chez les souris cyto EGFP, le cytoplasme des cellules épithéliales sécrétoires a été nettement marqué par EGFP.
Dans le même temps, les gouttelettes lipidiques colorées au BODIPY 665676 apparues sous forme de corps fluorescents ronds, en particulier vers la surface apicale. L’analyse en accéléré a montré que les gouttelettes lipidiques colorées à la 665676 BODIPY se déplaçaient des régions basale vers les régions apicales à des vitesses variables et fusionnaient les unes avec les autres en transit. Chez les souris à membrane EGFP, EGFP a mis en évidence les membranes plasmiques des cellules épithéliales capillaires et sécrétoires et les gouttelettes lipidiques colorées par BODIPY étaient visibles dans tout le cytoplasme.
La microscopie à deux photons des glandes mammaires de souris à membrane EGFP ou à membrane tdTomato a permis une étude plus complète de la morphologie des glandes. Les fibres de collagène à la surface sont visualisées dans le canal monodansylpentane par génération de seconde harmonique. Plus loin dans le parenchyme, l’épithélium sécrétoire est révélé par des membranes plasmiques basales, latérales et apicales et des gouttelettes lipidiques colorées au monodansylpentane.
La lumière centrale devient évidente plus loin dans l’alvéole. Le fluorophore rouge tdTomato a été particulièrement utile pour le marquage de l’endothélium capillaire, contrairement à l’EGFP chez les souris cyto EGFP.
