Les auteurs remercient Chris Chartrand, HT (ASCP) pour démontrer la section de coupe du bloc de cellules avec un marqueur AV.

Introduction: Ceci est une vidéo décrivant la méthode pour la préparation Shidham bloc cellulaire du liquide à base de cytologie (LBC) spécimen à l&#39;aide HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). Par rapport à d&#39;autres approches aléatoires, les suivantes sont les deux caractéristiques essentielles de ce protocole pour la préparation de blocs de cellules à partir de spécimens relativement aux seules hypocellulaires dispersés cellules perdent (1-5). <ol><li> Ce protocole comporte des mesures pour concentrer les cellules le long du plan parallèle à la surface de coupe du bloc cellulaire. </li><li> Il inclut également une intégration comme une balise sombre de AV-marqueur (figure 1b), qui sert à deux fins suivantes: <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Pour visualiser le niveau auquel les cellules sont concentrées. La zone du bloc de cellules avec les cellules d&#39;intérêt aujourd&#39;hui pourrait être visualisé par l&#39;histotechnologist lorsque la balise de couleur foncée est exposé pendant la coupe. Cette capacité à surveiller les empêche de couper à travers le niveau avec la plupart des cellules, ou ne pas couper trop superficielle dans le niveau avec la plus forte concentration de cellules de l&#39;échantillon. </li><li> Pour servir comme point de référence de localisation dans la section du bloc cellulaire de série sur les différentes diapositives. Ce point de référence agit comme un phare pour aider à localiser les cellules ou groupes de cellules pour l&#39;évaluation d&#39;un modèle immunoréactivité coordonner avec l&#39;approche SCIP (6,7). </li></ol></li></ol> PROTOCOLE (figure 2) Préparation de l&#39;échantillon. <ol><li> Transférer le spécimen résiduelle LBC cytologie cervicale à un tube de verre à fond plat (15mm de diamètre x 45mm) (figure 2.1 à 2.4). Placez le tube de verre dans un tube en plastique plus grand transporteur (28 x 85mm) et centrifugeuse. Retirer le tube à fond de verre du tube transporteur et éliminer le surnageant. </li><li> Le tube de verre est alors plafonné (pour éviter les déversements d&#39;eau de chauffage dans l&#39;étape suivante) et replacé dans un grand tube à fond plat en plastique porteuse </li><li> Le tube en plastique support contenant le tube de verre est alors plafonné, placé dans une centrifugeuse (avec des tasses et non orientable coupes à angle fixe de sorte que les cellules tomber perpendiculairement au fond plat du tube de verre), et tournant à 1805 G (3000 RPM, Rayon-17cm de rotor) pendant cinq minutes (figure 2.5). </li><li> Les tubes sont ensuite retirés à la verticale de la centrifugeuse et le tube de verre plus petit est retiré avec une pince à partir du tube en plastique plus grand transporteur, sans perturber le culot de cellules sédimentées. </li><li> Le tube en verre avec spécimen est non plafonnés et le surnageant est vidé en prenant soin de ne pas perturber la couche plane de cellules sédimentent au fond (figure 2.6). </li></ol> L&#39;inclusion de la coordonnée de référence AV-marqueur et plus de gel <ol><li> Une balise noire AV-marqueur (environ 2 mm x 2 mm taille, plane surface, fragment de couleur foncée, le matériel sectionnable) (figure 3) est ajouté comme un poteau indicateur sur le tube de verre (Figure 2.7). </li><li> Liquéfier une aliquote de HG en le fondant au micro-ondes pendant 10 secondes à puissance moyenne. </li><li> Ajouter 0,5 ml de HG fondu pour le tube, mélanger avec le sédiment rapidement, et il récapitulation (figure 2.8) (Passez à l&#39;étape suivante rapidement sans laisser le HG pour commencer à se solidifier). </li><li> Ajoutez environ 2,5 ml d&#39;eau tiède (45 ° C) de l&#39;eau dans le tube en plastique de support (Figure 2.9). </li><li> Le tube de verre plus petit plafonné est placé à l&#39;intérieur du tube en plastique avec de l&#39;eau tiède. (Cette étape est nécessaire pour garder le HG de se solidifier au cours des prochaines étapes) (Figure 2.9). </li><li> Le tube en plastique transporteur est placé dans la centrifugeuse (avec des tasses et non orientable coupes à angle fixe de sorte que les cellules tomber perpendiculairement au fond plat du tube de verre), et tournant à 1805 G (3000 RPM, le rayon-17cm de rotor) pour cinq minutes. Le but de cette étape de centrifugation est de pousser le marqueur AV et pour concentrer les cellules dans une couche proche de la surface de coupe du bloc cellulaire de paraffine finale embarqués (figure 1d). </li><li> Les tubes sont ensuite retirés doucement et verticalement à partir de la centrifugeuse en prenant soin de ne pas perturber la couche sédimentée mince avec des cellules de l&#39;échantillon dans le fond. </li><li> Le tube en plastique est plus non plafonnés et le tube de verre plus petit est retiré verticalement par une pince sans déranger la couche de sédiments de cellules spécimen. </li><li> Le petit tube de verre est réfrigéré en position verticale pendant 15 minutes pour refroidir et se solidifier l&#39;HG (figure 2.11). </li></ol> Retrait du bloc cellulaire comme un bouton de gel avec un spécimen pour le traitement final <ol><li> Le disque HG solidifié, avec la couche de concentré / sédiments spécimens au fond est délogé du tube de verre à fond plat en injectant formol à 10% grâce à une aiguille de calibre 23 avec la seringue (figure 2.12). </li><li> L&#39;aiguille est insérée sur le côté du tube à la périphérie du disque de HG solidifié avec éprouvette (figure 2.12). </li><li> Le needle est tournée sur le côté du tube tout en formol est lentement poussé par la seringue. Il en résulte la séparation de la touche HG avec balise de couleur foncée AV-marqueur et le spécimen concentré dans ce fond plat de la du tube de verre (figure 2.12). </li><li> Le bloc de cellules (bouton de gel avec des cellules spécimen) est ensuite placé dans une cassette étiquetés et soumis pour le traitement des tissus à préparer des blocs de paraffine cellulaire embarqué (figure 2.13). </li></ol> Intégration et la coupe de l&#39;échantillon <ol><li> Le disque est inclus dans la paraffine avec le côté sombre de marqueur balise bas que la surface de coupe (figure 1). </li><li> Le bloc est sectionné jusqu&#39;à ce que la couleur foncée AV-marqueur comme un phare est exposée et visible. </li><li> Trois à quatre sections microns sont coupés de ce niveau qui devrait contenir la plupart des cellules dispersées individuellement à partir du spécimen. </li><li> Les coupes sont recueillies sur la lame de verre pour la coloration de loin, la coloration immunohistochimique, ou d&#39;autres tests comme indiqué. Les protocoles de ces essais, y compris le type de diapositives à utiliser pour le montage des sections peuvent varier. Généralement pour immunocoloration, des lames recouvertes sont utilisés pour l&#39;empêcher de flotter et de perte de sections de la glisse lors des étapes immunomarquage. </li></ol> Abréviations utilisées (par ordre alphabétique): CISH, chromogène tests d&#39;hybridation in situ; FISH, fluorescent tests d&#39;hybridation in situ; FFPE, fixés au formol et inclus en paraffine; FNA, aspiration à l&#39;aiguille fine; HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, liquide cytologie; réaction PCR polymerase chain; <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. La structure du bloc cellulaire préparé par le protocole de Shidham. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Le résumé des différentes étapes de préparation du bloc cellulaire spécimen LBC par le protocole de Shidham. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Préparation d&#39;AV-marqueur de pelures de banane. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Comparaison des blocs de cellules et sections, avec et sans AV-marqueur. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Comparaison des cellularité des sections du bloc cellulaire avec et sans AV-marqueur.

<ol>
	<li>Shidham, V. B., Epple, J., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14,+Appendix+I:+Collection+and+processing+of+effusion+fluids+for+cytopathologic+evaluation.">Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , .</li><li>Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p16INK4a+Immunocytochemistry+as+an+Adjunct+to+Cervical+Cytology+-+Potential+Reflex+Testing+on+Specially+Prepared+Cellblocks+from+Residual+Liquid+Based+Cytology+(LBC)+Specimens.">p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens.</a> Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. , 97a-97a (2009).</li><li>Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell+block+preparation+methods+for+nongynecologic+ThinPrep+specimens.">Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens.</a> Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).</li><li>Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Thin-Prep+and+cell+block+preparation+for+the+evaluation+of+Thyroid+epithelial+lesions+on+fine+needle+aspiration+biopsy.">Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy.</a> CytoJournal. 5, 3-3 (2008).</li><li>Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+diagnostic+accuracy+with+a+cell+block+preparation+from+thin-layer+endometrial+cytology:+a+feasibility+study.">Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study.</a> Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).</li><li>Atkinson, B. F., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Immunocytochemistry+of+effusion+fluids:+introduction+to+SCIP+approach+(Chapter+5.">Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li><li>Shidham, V. B., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15,+Appendix+II:+Immunocytochemistry+of+effusions+processing+and+commonly+used+immunomarkers.">Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li></ol>

Blocs cellulaires sont un outil précieux pour l&#39;évaluation des différents échantillons de cytologie (1). Surtout, en plus des détails architecturaux de l&#39;échantillon, les blocs cellulaires permettent l&#39;évaluation des études auxiliaires tels que l&#39;immunocytochimie, fluorescent / chromogène tests d&#39;hybridation in situ (FISH / CISH) et in-situ de PCR. Une variété de méthodes pour la préparation du bloc cellulaire sont décrites. Cependant, la plupart d&#39;entre eux sont adaptés pour les échantillons de cytologie non gynécologique qui contiennent des cellules relativement nombreuses et avec microfragments tissus tels que dans les aspirations FNA et certaines sérosités tels que les épanchements (1,3,4,5). Parce que les blocs de cellules surtout l&#39;occasion pour l&#39;évaluation immunocytochimiques, leur traitement doit être de préférence similaire à celle de l&#39;fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) des tissus. Finalement, les résultats obtenus après évaluation immunocytochimique de sections bloc cellulaire sont comparés à ceux de la littérature publiée réalisée principalement sur des coupes de tissus FFPE. Toute modification dans le protocole potentiellement compromettre et d&#39;annuler la validité des résultats obtenus sur des blocs de cellules traitées par fixateurs différents et des séquences de réactifs autres que ceux utilisés pour la FFPE routine. Certaines techniques commerciales peuvent avoir l&#39;inconvénient de traitement à travers un protocole d&#39;exposition à d&#39;autres fixateur-réactif exposition. Diverses méthodes de préparation des blocs de cellules sont disponibles pour les spécimens avec une quantité importante de sédiments et de fragments de tissus. Principalement, les sédiments sont concentrées soutenu par un peu de gel ou d&#39;un principe de coagulation. Le bouton manoeuvrable est alors inclus dans la paraffine après traitement, comme les spécimens de pathologie chirurgicale / biopsies. Les gels utilisés comprennent la gélatine, l&#39;agar, le fibrinogène / plasma-thrombine, et autres gels commerciaux tels que HG. Les méthodes de concentration varient de granulation simple des sédiments par centrifugation à la concentration de cellules le long de divers types de membranes. Les exemples incluent: Milipore, collodin (celloïdine) sacs ou racler les cellules du frottis cytologique sur lames de verre (1). Nous avons aussi évalué une variété de gels en essayant différentes combinaisons d&#39;agar-agar et la gélatine. Aucune des combinaisons atteint la consistance d&#39;une entreprise assez pour obtenir un disque facile à manœuvrer de gel solidifié avec des cellules intégrées de l&#39;échantillon en un seul morceau. HG a montré une cohérence appropriée et dans notre expérience les résultats immunomarquage sur des sections de HG bloc cellulaire ont été excellents. La cytologie liquide (LBC) pour la cytologie cervico spécimens sont généralement moins cellulaires que les non-gynécologiques spécimens comme mentionné plus haut. En outre, les spécimens gynécologiques LBC contiennent majoritairement individuels dispersés exfoliée cellules superficielles de la muqueuse cervico. Pour cette raison, la cellularité appropriées dans les sections bloc cellulaire ne peut être atteint sans une approche particulière. Comme ces seules éparpillées composants cellulaires dans le bloc de la ne peut pas être vu par le histotechnologist lors de la coupe la section, le niveau auquel les cellules commencent à apparaître dans les sections ne peuvent pas être appréciés et peuvent être oubliées, soit en coupant passé le niveau avec la plupart des cellules ou non couper assez profondément dans le niveau avec la plus forte concentration de cellules de l&#39;échantillon (figure 4). Protocole Shidham de traite à la fois de ces questions en utilisant HG que l&#39;intégration des équipements de laboratoire moyen et conventionnelles (2) (figure 2). Ce protocole comporte deux caractéristiques principales suivantes (figure 1): <ol><li> Concentration et l&#39;alignement des seules cellules dispersées dans un plan étroite adjacente et parallèle à la surface de coupe du bloc cellulaire (figure 5). </li><li> L&#39;inclusion d&#39;une balise de type sombres AV-marqueur comme un poteau indicateur. Cela est essentiel pour atteindre les caractéristiques suivantes: <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Identifier et surveiller le niveau auquel les cellules sont concentrées dans le bloc cellulaire. L&#39;exposition du panneau de couleur foncée souligne le niveau auquel la plupart des cellules seules éparpillées dans le bloc cellulaire devraient être situés (figure 4). Cela empêche la surexploitation (découpe passé le niveau avec la plupart des cellules) ou une sous-cotation (ne pas couper assez profondément dans le niveau avec la plus forte concentration de cellules de l&#39;échantillon) dans le bloc cellulaire et permettre la sélection des sections du niveau dans le bloc cellulaire correspondant à la plus forte concentration des cellules. </li><li> Le panneau de couleur foncée dans les sections sert aussi de point de référence pour l&#39;enquête et identifier exactement les mêmes cellules dans les différentes sections de série du bloc cellulaire sur des lames différentes (figure 4). Cela est essentiel tout interpréter et évaluer les propriétés de coordonner immunoprofile telles des cellules notamment par l&#39;approche SCIP à suivre les mêmes cellules dans les différentes sections (6,7). </li></ol></li></ol> Bien que ousr le protocole est normalisé et signalés pour liquide à base de spécimens cytologie cervicale, il peut également être utilisé pour améliorer le rendement diagnostique de nombreuses autres non gynécologique spécimens tels que des fluides épanchement, FNA, brossages, contenu du kyste etc En outre, le marqueur AV serait de faciliter l&#39;amélioration application de l&#39;approche SCIP lors de l&#39;évaluation immunohistochimique de sections de bloc cellulaire de ces spécimens. Le milieu d&#39;inclusion peuvent être remplacés par d&#39;autres réactifs avec les modifications appropriées aux étapes pertinentes. HG peut être remplacée par du plasma (fibrinogène) pour être gélifiée par la thrombine à la température ambiante (1).

cell block preparation from cytology specimen with predominance of individually scattered cells

Cette vidéo montre la méthode Shidham pour préparation des blocs de cellules de liquide à base de spécimens de cytologie cervico contenant des cellules dispersées individuellement et les groupes à petites cellules. Cette technique utilise HistoGel (Thermo Scientific) avec un équipement de laboratoire conventionnels. L&#39;utilisation de sections de bloc cellulaire est un outil précieux auxiliaires pour l&#39;évaluation de la non-cytologie gynécologique. Ils permettent d&#39;étudier l&#39;cytopathologiste supplémentaires détails morphologiques spécimen, y compris l&#39;architecture de la lésion. Surtout, ils permettent l&#39;évaluation des études auxiliaires tels que l&#39;immunocytochimie, tests d&#39;hybridation in situ (FISH / CISH) et in situ la réaction en chaîne polymérase (PCR). Les techniques traditionnelles de préparation des blocs cellulaires ont surtout été appliquée aux non-échantillons de cytologie gynécologique, typiquement pour des épanchements de liquide corporel et cytoponctions. Liquide à base de spécimens cervico sont relativement moins cellulaire que leurs homologues non-gynécologique avec de nombreuses cellules individuelles dispersées. Pour cette raison, la cellularité adéquate dans les sections bloc cellulaire est difficile à réaliser. En outre, le sectionnement histotechnologist le bloc ne peut pas visualiser le niveau auquel les cellules sont à la concentration maximale. Par conséquent, il est difficile de contrôler le niveau approprié au cours de laquelle des sections peuvent être sélectionnés pour être transférés à des lames de verre pour les tests. En conséquence, la zone du bloc de cellules avec les cellules d&#39;intérêt peut être manqué, soit en coupant passé ou ne pas couper assez profond. Protocole actuel pour la méthode Shidham aborde ces questions. Bien que ce protocole est normalisé et rapportées pour des échantillons liquides cytologie gynécologique base, il peut également être appliquée aux non-gynécologiques spécimens tels que des fluides épanchement, FNA, brossages, kyste etc contenus pour une meilleure qualité de matériel de diagnostic dans les sections de bloc cellulaire.

Watch this Scientific Journal Video about Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells at JoVE.com

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Shidham la méthode de préparation des blocs de cellules avec AV-marqueurs dans les échantillons de cytologie contenant des cellules dispersées individuellement et les groupes à petites cellules.

Préparation Cell Block de cytologie avec une prédominance de cellules individuellement épars

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

cell-block-preparation-from-cytology-specimen-with-predominance

Research

JoVE Journal

Biology

73.0K vues.  University of Wisconsin - Milwaukee. Shidham la méthode de préparation des blocs de cellules avec AV-marqueurs dans les échantillons de cytologie contenant des cellules dispersées individuellement et les groupes à petites cellules.

Vidéo: Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  approximately one (to two) million irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells is rinsed with HuES media to remove residual serum and cell debris, and then HuES media added and left to equilibrate in the cell culture incubator.  A frozen vial of cells from long term liquid nitrogen storage or a -80C freezer is sourced and quickly submerged in a 37C water bath for quick thawing.  Cells in freezing media are then removed from the vial and placed in a large volume of HuES media.  The large volume of HuES media facilitates removal of excess serum and DMSO, which can cause HuES human embryonic stem cells to differentiate.  Cells are gently spun out of suspension, and then re-suspended in a small volume of fresh HuES media that is then used to seed the MEF plate.  It is considered important to seed the MEF plate by gently adding the HuES cells in a drop wise fashion to evenly disperse them throughout the plate.  The newly established HuES culture plate is returned to the incubator for 48 hrs before media is replaced, then is fed every 24 hours thereafter.

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.

Les cellules ES humaines: la culture à partir de cellules congelées

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Recherche

Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Préparation des cultures de neurones d&#39;embryons de drosophile Midgastrula scène

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

Préparation des suspensions unicellulaires à partir de rate de souris avec le dissociateur gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Préparation des Drosophile Les cellules S2 pour la microscopie optique

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Chromosome Préparation partir des cellules cultivées

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Génération efficace d&#39;origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-microscopie électronique à la préparation des échantillons au moyen d&#39;un faisceau d&#39;ions focalisés

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse des suspensions de cellules isolées de tissus solides par Spectral cytométrie en flux

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

Préparation des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaux de souris

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...