Travaux décrits dans ce manuscrit a été rendue possible grâce au financement de la Fondation Patrick F. Taylor.

Une. Chromosome récolte de cellules adhérentes <ol><li> Protocole standard <ol><li> Cultiver des cellules selon les conditions particulières de culture cellulaire. Lorsque les cellules ont atteint la phase logarithmique (80% de confluence), ajouter 10 ul / ml de Colcemid dans le ballon de culture de cellules. Un minimum de 2 x 10 6 cellules est recommandée. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% pendant 45 min. En utilisant une pipette stérile, transférer médias de cellules dans un tube de 15 ml conique. Mettre de côté. </li><li> Lavez délicatement les cellules en ajoutant 2 ml de HBSS tampon dans le flacon. Tampon tourbillon puis retirez à l&#39;aide d&#39;une pipette. Jeter. </li><li> Ajouter 1 ml de trypsine, en veillant à ce qu&#39;il couvre toute la surface du flacon. Ne laisser que les cellules de la trypsine pendant environ 2 min. Une fois que la majorité des cellules ont détaché, la pipette les médias dans le tube conique en arrière sur les cellules. </li><li> Transférer la suspension cellulaire en aliquotes de 10 ml dans des tubes de 15 ml coniques.Centrifuger à 200 g pendant 10 min. Retirer le surnageant et remettre le culot. </li><li> Ajouter 10 ml de 0,075 M de KCl, qui a été préchauffée à 37 ° C et le culot restant dans le tube conique. Vortex à vitesse moyenne pour mélanger KCl et cellules. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant 10 min. Centrifuger à 200 g pendant 5 min à 25 ° C. Retirer le surnageant (jusqu&#39;à environ 0,5 ml restes) et remettre le culot. </li><li> Ajouter avec précaution 5 ml de fixateur de Carnoy frais (3:1 de méthanol: acide acétique glacial) pour les cellules tout en vortex. Ajouter ensuite 5 ml de fixateur sans plus de vortex pour un total de 10 ml. </li><li> Centrifuger à 200 g pendant 5 min. Éliminer les cellules surnageant et remettre en suspension. Ajouter 5 ml de fixateur dans chaque tube. </li><li> Centrifuger à 200 g pendant 5 min. Éliminer les cellules surnageant et remettre en suspension. Ajouter 5 ml de fixateur dans chaque tube. Les cellules peuvent à présent être stockées dans le 4 ° C pendant jusqu&#39;à un an. </li></ol></li><li> Modification du protocole: harvesti chromosomiquesng de lignées de cellules lymphoblastoïdes <ol><li> Cultiver des cellules selon les conditions particulières de culture cellulaire. (Utilisez le flacon approprié pour la quantité de cellules mises en culture). Lorsque les cellules ont atteint la phase logarithmique (environ 2 jours après les cellules sont split), ajouter 10 ul / ml de Colcemid dans le ballon de culture de cellules. </li></ol></li><li> Modification du protocole: Chromosome récolte du sang total Phytohémagglutinine (PHA), un dérivé de la lectine de haricot rouge, est un puissant agent mitogene pour les cellules T humaines 16. 72 h après l&#39;addition de PHA à la culture, environ 45% des cellules sont en phase S. Cela représente le pic d&#39;activité mitotique, et est le point optimal pour la récolte pour les études de chromosomes. D&#39;autres agents mitogènes tels que la phytolaque (1-10 pg / ml) peuvent être utilisés dans l&#39;analyse de cellules B 17,18. <ol><li> Prélever au moins 1 ml de sang total dans un tube à héparine de sodium top vert. Utiliser dans les 3 jours suivant la collecte. sang de magasin à la température ambiante nontil prêt à l&#39;emploi. </li><li> Aliquote de 0,25 ml de sang total dans 10 ml de milieu RPMI complet contenant de la L-glutamine (sérum de veau fœtal à 20%, 1% de pénicilline / streptomycine, 1% de fungizone et 1% de PHA). Culture à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Modification du protocole: Chromosome récolte de moelle osseuse L&#39;analyse cytogénétique de la moelle osseuse est utile dans de nombreux troubles hématologiques malignes comme l&#39;observation d&#39;un clone de chromosome anormal peut être de diagnostic pour un type spécifique de la leucémie. Des études chromosomiques sont également utilisés pour évaluer la progression de la maladie telle que l&#39;apparition d&#39;une crise blastique et la réponse au traitement. Comme les cellules de la moelle osseuse se divisent activement, aucune stimulation mitogène est nécessaire 9,19. Pour les leucémies aiguës 24 et 48 h cultures sont également mis en place. <ol><li> Prélever au moins 1 ml de moelle osseuse dans un tube à héparine de sodium top vert. Aliquote de 0,25 ml de la moelle osseuse dans 10 ml de milieu RPMI complet contenant de la L-glutamine (20% de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline / streptomycine, 1% Fungizone). Culture à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Glisser Préparation et coloration solide Une évaluation rapide d&#39;une diapositive représentant fournira des informations sur la qualité de la récolte avant de continuer à d&#39;autres procédures telles que G-banding, FISH, CGH, ou SKY. Certains laboratoires préfèrent tache solide, les cellules de récolte rapide et de l&#39;évaluation de chromosome. En variante, un microscope à contraste de phase peut être utilisé pour cette analyse. Les lames sont préparés au mieux lorsque le taux d&#39;humidité est d&#39;environ 50% et la température ambiante de (20 à 25 ° C). <ol><li> Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min à 25 ° C. Retirer le surnageant jusqu&#39;à seulement 0,3-0,5 ml restes. </li><li> Après remise en suspension doucement la pastille, pipettes trois gouttes de la suspension de cellules à partir d&#39;une distance d&#39;environ 2 à sur une lame qui est incliné à un angle d&#39;environ 45 ° et permettre à la suspensionà rouler à travers la diapositive. Ajoutez une grosse goutte de fixateur de Carnoy frais à la diapositive. </li><li> Sécher le dos de la lame sur une serviette en papier, puis reposer la diapositive à sécher pendant au moins 10 min. La lame doit être complètement sec. </li><li> Préparer une nouvelle solution de coloration Giemsa (3:1 ratio de tampon Gurr et Giemsa). Placer les lames sur un support de coloration. Couvrir l&#39;ensemble de la diapositive dans la solution de coloration de Giemsa. Que les glissières restent dans la solution de coloration pendant 5 min. Rincer les lames avec de l&#39;eau distillée, les égoutter et laisser sécher à l&#39;air. </li><li> Ajouter 4 gouttes de Permount et une lamelle sur la lame. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles sous la lamelle. L&#39;excédent Permount peut être enlevé avec une serviette en papier. </li><li> Analyser les cellules avec un microscope optique à 10X et 100X. Si les cellules en métaphase sont abondants et bon étalement, les lames restantes peuvent être utilisées pour d&#39;autres procédures expérimentales. </li></ol> 3. G-baguage utilisant de la trypsine et Giemsa (GTG) &lt;p&gt; La trypsine est une enzyme protéolytique qui dénature euchromatiques histones dans des régions d&#39;ADN avec une activité transcriptionnelle plus élevée qui en résulte. Après Giemsa, ces régions apparaissent comme des bandes claires. Chromatine fortement condensée avec l&#39;activité transcriptionnelle peu ou pas (hétérochromatine) aura une grande partie de ses histones protégées à partir de la trypsine et ne sera donc tache sombre suivant la coloration de Giemsa. Il est essentiel de d&#39;abord la bande G une diapositive à surveiller les conditions et ajuster le calendrier de la trypsine si nécessaire pour les diapositives suivantes. <ol><li> Ajouter les solutions suivantes pour 4 jarres de Coplin. Pot # 1 = 30 ml de HBSS 1x et 4 ml de 10x la trypsine (0,5%) Pot n ° 2 = 50 ml de HBSS 1x Pot n ° 3 = 45 ml de HBSS 1x et 5 ml de sérum foetal bovin Pot n ° 4 = 50 ml de HBSS 1x </li><li> Plongez chaque diapositive dans le pot n ° 1 pendant 5 sec, rinçage rapide dans le pot n ° 2, laisser chaque diapositive dans le pot n ° 3 pendant au moins 30 secondes, rinçage rapide dans le pot n ° 4 puis laissez lames sécher. </li><li> Préparer fresh Giemsa Solution (3:1 de tampon Gurr et Giemsa). Placer les lames sur un support de coloration. Couvrir l&#39;ensemble de la diapositive dans la solution de coloration de Giemsa. Que les glissières restent dans la solution de coloration pendant 5 min. </li><li> Rincer les lames dans de l&#39;eau distillée dans le même ordre qu&#39;ils ont été colorées. Laisser les lames sécher pendant environ 10 min. La lame doit être complètement sec. </li><li> Ajouter 4 gouttes de Permount et une lamelle sur la lame. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles sous la lamelle. L&#39;excédent Permount peut être enlevé avec une serviette en papier. </li><li> Analyser les cellules avec un microscope optique à 10X et 100X. Ajuster la trypsine synchronisation du reste des diapositives sur la base des résultats de la première glissière. </li></ol>

<ol>
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Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).</li><li>McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+conventional+cytogenetics+(G-banding),+comparative+genomic+hybridization+(CGH)+and+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+(i-FISH)+for+the+detection+of+genomic+rearrangements+in+acute+leukemia.">Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia.</a> J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).</li></ol>

Nous avons utilisé la présente procédure pour l&#39;isolement du chromosome à partir de cellules de différents organismes, y compris divers types de cellules obtenues à partir de l&#39;homme, les macaques rhésus, les rats, les souris et les 11,20-22. Le protocole standard est fourni, mais peut être ajustée pour ces divers types de cellules certaines étapes et variables clés. Plusieurs mesures spécifiques sont indispensables à la fois dans la préparation chromosomique et G-bandes pour assurer la ...

L&#39;analyse des chromosomes est une technique classique utilisée dans le monde entier pour diagnostiquer l&#39;instabilité chromosomique et réarrangements conduisant à des troubles génétiques et cancer 1,2,8,9. En outre, une résolution plus élevée pour le diagnostic et la recherche d&#39;anomalies génétiques constitutionnels et cancer acquis peut être réalisé avec la combinaison des procédures cytogénétique classique et des méthodes de cytogénétique moléculaire telles que l&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH), l&#39;hybridation génomique comparative (CGH) , et le caryotype spectral (SKY) 14,15. Plus récemment, ces techniques ont été utilisées pour l&#39;évaluation de l&#39;instabilité chromosomique associée à la recherche sur les cellules souches. Anomalies caryotypiques telles que l&#39;aneuploïdie des cellules en culture à long terme embryonnaires (ES) et des cellules souches adultes de divers organismes ont été rapportés par plusieurs laboratoires. Les données récentes confirment que certaines lignées cellulaires sont par nature plus enclins à chromosome instabilité, indépendamment des conditions de culture. Pour cette raison, lors de l&#39;établissement et / ou le maintien de lignées de cellules souches rhésus humain, une souris ou, une analyse chromosomique est recommandé dans le cadre du processus de contrôle de la qualité. De nombreux rapports décrivent l&#39;intérêt croissant pour l&#39;utilisation de la cytogénétique et moléculaire de routine pour surveiller la stabilité chromosomique de cellules souches et de cellules malignes ou de divers organismes en culture de 10 à 13. Ces protocoles sont de plus en plus utilisés par des laboratoires non génétiques pour l&#39;évaluation chromosomique rapide de leurs cellules en culture 13. Nous présentons nos procédures de base pour la préparation des chromosomes de différents types de cellules, qui peuvent être appliquées à des fins et des cellules cliniques et de recherche provenant de divers organismes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">KaryoMAX Colcemid</td>
			<td style="width:213px;">Gibco</td>
			<td style="width:145px;">15212-012</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin EDTA 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Tablets &#34;GURR&#34;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10580-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Geimsa Stain</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3250-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>6700130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Krackeler Scientific Inc.&#160;</td>
			<td>11-9508-05</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromosome preparation from cultured cells

Chromosome (cytogénétique) analyse est largement utilisée pour la détection de l&#39;instabilité chromosomique. Lorsque suivi par G-banding et techniques moléculaires tels que l&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH), ce test a l&#39;avantage de pouvoir analyser des cellules individuelles pour les aberrations qui impliquent des gains ou des pertes de portions du génome et des réarrangements impliquant un ou plusieurs chromosomes. Chez l&#39;homme, des anomalies chromosomiques surviennent chez environ 1 pour 160 naissances vivantes 1,2, 60-80% de toutes les fausses couches 3,4, 10% des mortinaissances 2,5, 13% des personnes ayant une maladie cardiaque congénitale 6, 3-6% des cas d&#39;infertilité 2, et chez de nombreux patients atteints de déficience intellectuelle et des malformations congénitales 7. L&#39;analyse cytogénétique des tumeurs malignes est couramment utilisé par les chercheurs et les cliniciens, comme il a été démontré observations d&#39;anomalies chromosomiques clonales à avoir à la fois une signification diagnostique et pronostique 8,9.60, l&#39;isolement de chromosomes est inestimable pour la thérapie génique et les cellules souche d&#39;organismes y compris les primates non humains et les rongeurs 10-13. Les chromosomes peuvent être isolés à partir de cellules de tissus vivants, notamment des lymphocytes de sang, les fibroblastes de la peau, les cellules amniotiques, le placenta, la moelle osseuse, et des échantillons de tumeur. Les chromosomes sont analysées au stade de la métaphase de la mitose, quand ils sont les plus condensées et donc plus visible. La première étape de la technique d&#39;isolement du chromosome implique la rupture des fibres du fuseau par incubation avec Colcemid, pour empêcher les cellules de passer à l&#39;étape ultérieure de l&#39;anaphase. Les cellules sont ensuite traitées avec une solution hypotonique et conservés dans leur état gonflé, avec le fixateur de Carnoy. Les cellules sont ensuite déposés sur de diapositives et peuvent ensuite être utilisés pour une variété de procédures. G-banding implique un traitement à la trypsine suivie d&#39;une coloration au Giemsa à créer de la lumière caractéristique et bandes sombres. Le même procedure pour isoler les chromosomes peuvent être utilisés pour la préparation de cellules pour des procédures telles que l&#39;hybridation in situ par fluorescence (FISH), l&#39;hybridation génomique comparative (CGH), et le caryotypage spectral (SKY) 14,15.

Métaphase écarts de qualité sont essentiels pour l&#39;analyse des chromosomes. Un test réussi donne chromosomes qui sont bien répartis et de la morphologie des chromosomes approprié. Chromosomes correctement G-bagués contiennent la lumière caractéristique et profils de bandes sombres. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1.jpg" /> Figur...

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Chromosome Preparation From Cultured Cells

Les chromosomes peuvent être isolés à partir de cellules vivantes telles que des lymphocytes ou des fibroblastes de la peau, et à partir d&#39;organismes, y compris les humains et les souris. Ces préparations de chromosomes peuvent en outre être utilisés pour G-banding routine et les procédures de cytogénétique moléculaire telles que l&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH), l&#39;hybridation génomique comparative (CGH), et le caryotype spectral (SKY).

Chromosome Préparation partir des cellules cultivées

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

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Research

JoVE Journal

Biology

80.6K vues.  Louisiana State University Health Science Center.  Les chromosomes peuvent être isolés à partir de cellules vivantes telles que des lymphocytes ou des fibroblastes de la peau, et à partir d'organismes, y compris les humains et les souris. Ces préparations de chromosomes peuvent en outre être utilisés pour G-banding routine et les procédures de cytogénétique moléculaire telles que l'hybridation fluorescente in situ (FISH), l'hybridation génomique comparative (CGH), et le caryotype spectral...

Vidéo: Chromosome Preparation From Cultured Cells

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Comptage et détermination de la viabilité des cellules cultivées

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Biologie

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Préparation des Courges drosophile chromosomes polytènes pour marquage de l&#39;anticorps

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualisation de réticulum endoplasmique sous-domaines dans les cellules cultivées

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Essais Reporter massivement parallèles dans des cellules de mammifères en culture

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagerie Ca locale<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaux de cellules de mammifères cultivées

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

Un air sec Chromosome Dropping rapide Méthode de préparation adéquate pour les poissons dans les usines

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

Préparation des chromosomes à la méiose se propage de Spermatocytes de souris

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. HIF-1 consists of a heterodimeric oxygen-regulated &#945; subunit (HIF-1&#945;) and constitutively expressed &#946; subunit (HIF-1&#946;) also known as aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT), regulating genes involved in diverse processes including angiogenesis, erythropoiesis and glycolysis. The identification of HIF-1 interacting proteins is key to the understanding of the hypoxia signaling pathway. Besides the regulation of HIF-1&#945; stability, hypoxia also triggers the nuclear translocation of many transcription factors including HIF-1&#945; and ARNT. Notably, most of the current methods used to study such protein-protein interactions (PPIs) are based on systems where protein levels are artificially increased through protein overexpression. Protein overexpression often leads to non-physiological results arising from temporal and spatial artifacts. Here we describe a modified co-immunoprecipitation protocol following hypoxia treatment using endogenous nuclear proteins, and as a proof of concept, to show the interaction between HIF-1&#945; and ARNT. In this protocol, the hypoxic cells were harvested under hypoxic conditions and the Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) wash buffer was also pre-equilibrated to hypoxic conditions before usage to mitigate protein degradation or protein complex dissociation during reoxygenation. In addition, the nuclear fractions were subsequently extracted to concentrate and stabilize endogenous nuclear proteins and avoid possible spurious results often seen during protein overexpression. This protocol can be used to demonstrate endogenous and native interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators under hypoxic conditions.

Here we describe a co-immunoprecipitation protocol to study protein-protein interactions between endogenous nuclear proteins under hypoxic conditions. This method is suitable for demonstration of the interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators at hypoxia.

Essai de co-immunoprécipitation des protéines nucléaires endogènes de cellules cultivées dans des Conditions hypoxiques

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

Préparation des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaux de souris

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Methods Article

Chromosome Préparation partir des cellules cultivées