Nous remercions Janice Fischer pour fournir le plasmide SAMU-EGFP :: Msp-300 KASH. L&#39;anticorps a été obtenu mAB24B10 du développement des études Hybridoma Banque élaboré sous les auspices de la NICHD et maintenu par l&#39;Université de l&#39;Iowa, Département de biologie. Le repo-GAL4 actions (BL7415) a été obtenu à partir du Stock Center Bloomington à l&#39;Université de l&#39;Indiana. Le soutien de l&#39;Institutional Research Grant American Cancer Society (IRG # 58-006-53) au Centre de l&#39;Université de Purdue for Cancer Research est appréciée. Jingqun Ma est soutenu par une recherche agricole à l&#39;Université Purdue assistanat alimentaire et agricole de l&#39;Université Purdue.

Une. Génération et caractérisation de EGFP :: KASH Drosophila <ol><li> Chauffeur de la Croix Gal4 vole au SAMU-EGFP :: Msp-300 KASH vole. Alternativement, les mouches recombinants qui portent à la fois le pilote Gal4 et le transgène UAS-EGFP :: Msp-300 KASH peuvent être générés en utilisant des techniques génétiques standard. Cette deuxième approche est avantageuse si un grand nombre de descendants sont nécessaires. </li><li> Caractériser l&#39;expression du marqueur EGFP :: KASH en utilisant des techniques de microscopie classiques. Note: l&#39;expression de l&#39;EGFP peut être observé par les techniques classiques de microscopie à dissection, les tissus fixes de Drosophila, ou chez les larves ensemble, et ne nécessite pas l&#39;utilisation d&#39;un anticorps. <ol><li> Déterminer le profil d&#39;expression de l&#39;EGFP :: KASH marqueur dans l&#39;ensemble de l&#39;organisme sous un microscope à dissection fluorescence (voir Matériaux PDF). Remarque: De nombreux pilotes Gal4, y compris le conducteur repo-GAL4 le montre la figure 1, exposition nmodèles onspecific d&#39;expression dans d&#39;autres tissus tels que les larves de la glande salivaire (voir résultats). </li><li> Analyser le schéma d&#39;expression EGFP :: KASH dans le tissu disséqué d&#39;intérêt en utilisant la microscopie confocale. <ol><li> Fixer le tissu d&#39;intérêt à l&#39;aide du formaldéhyde à une concentration finale de 4%, et l&#39;ADN de la tache en utilisant DAPI à une concentration finale de 0,1 pg / ml pour visualiser la localisation de la balise KASH :: EGFP par rapport à l&#39;ADN. </li><li> Acquérir des images à l&#39;aide d&#39;huile, soit un objectif 40X / 1,30 à immersion ou un objectif 20X / 0,75 à immersion dans l&#39;huile, en fonction de la taille du tissu d&#39;intérêt. Les conditions d&#39;excitation / émission suivants peuvent être utilisés pour l&#39;acquisition de l&#39;image: 408 nm/425-475 nm (DAPI); 488 nm / 525-550 nm (GFP). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Isoler les noyaux de la drosophile larves tissus <ol><li> Préparer le matériel pour la dissection des tissus des larves et l&#39;isolement des noyaux ultérieure. Notez quedechorionated embryons entiers peuvent également être utilisées comme produit de départ si on le désire. Il est recommandé d&#39;utiliser des tissus larvaires partiellement disséqués plutôt que les larves ensemble si le type de cellule d&#39;intérêt est présent dans un tissu spécifique comme le disque imaginal. Cela réduit la liaison non spécifique, et élimine les problèmes qui peuvent être causés par l&#39;expression de certains pilotes Gal4 dans les cellules non cibles aussi. <ol><li> Préparez deux paires de pinces acérées (voir Matériaux PDF), une plaque de verre 9 et siliconé (voir Matériaux PDF), et PBT (1x PBS, pH 7,4; 0,1% de Tween-20). </li><li> Prélier les anticorps de la GFP à des billes magnétiques. Cette étape doit être commencé avant le début de la dissection. Ajouter 10 ul de billes magnétiques (Invitrogen, voir Matériaux PDF) et 2 pg de GFP anticorps (Roche, voir Matériaux PDF) à 400 ul de tampon de lavage (1 x PBS, pH 7,4; 2,5 mM de MgCl2) dans un tube de 1,5 ml . La quantité de perles et des anticorps utilisés peuvent être optimisées si nécessaire sur la base de la quantité de cible dans l&#39;échanple et l&#39;affinité de liaison de l&#39;anticorps aux billes. </li><li> Incuber les billes et les anticorps avec rotation pendant au moins 30 min à température ambiante. </li><li> Placez le tube de 1,5 ml contenant les billes et les anticorps dans le rack magnétique (voir Matériaux PDF) et permettent aux billes de se lier à la magnétique pendant environ 1-2 min. Retirer le surnageant contenant l&#39;anticorps non lié et le tampon de lavage en utilisant une pipette de 1 ml. Les perles resteront liés à la paroi du tube de 1,5 ml sur le côté adjacent à l&#39;aimant. </li><li> Rincer les billes deux fois avec 1 ml de tampon de lavage à chaque fois, comme décrit à la section 2.1.4. Retirez le tube de 1,5 ml de la grille magnétique et inverser brièvement pour mélanger les perles et le tampon de lavage pendant chaque étape de lavage. </li><li> Stocker les perles liées à l&#39;anticorps dans un tampon de lavage avant d&#39;être prêt à passer à l&#39;étape 2.7. Les perles ne doivent pas être autorisés à sécher à n&#39;importe quelle étape du protocole. </li></ol></li><li> Disséquer les tissus larvaires dans PBT et transférer les tissus disséqués àune alvéole du godet 9 puits. Typiquement, la dissection du lobe de l&#39;optique et du disque imaginai de l&#39;oeil à partir de 100 larves au troisième stade larvaire fournit suffisamment de matière pour une analyse en aval de l&#39;expression génique après l&#39;isolement des noyaux. </li><li> Rincer le tissu isolé dans un tampon d&#39;extraction nucléaire (10 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 2,5 mM MgCl 2, KCl 10 mM) dans un tube de 1,5 ml. Transfert tissus larvaires isolées à un 1 ml Dounce Homogenizer (voir Matériaux PDF) sur la glace qui contient 1 ml de tampon d&#39;extraction nucléaire neuf. Incuber sur de la glace pendant 5 min. Il n&#39;est pas nécessaire d&#39;ajouter des inhibiteurs de la protéase si l&#39;ARN doit être extrait après l&#39;isolement des noyaux. </li><li> Perturber le tissu par 20 coups avec le pilon lâche et puis incuber l&#39;échantillon sur de la glace pendant 10 minutes pour permettre aux cellules de la houle. Extraire les noyaux des cellules à l&#39;aide de 15 coups avec le pilon serré. Le nombre de traits avec les pilons lâche et serrés doit être optimisée pour différents tissus et types de cellules, un excès peut entraîner une homogénéisationnoyaux cisaillé, tandis que l&#39;homogénéisation insuffisants ne sera pas extraire tous les noyaux du tissu. </li><li> Un filtrage de l&#39;homogénat, qui contient les noyaux et les débris cellulaires, à travers un 40 um de taille de pore crépine (voir Matériels PDF) qui a été préalablement rincées avec du tampon d&#39;homogénéisation nucléaire. Recueillir le broyat filtré dans un nouveau tube. </li><li> Prélever des échantillons de pré-isolement pour une analyse ultérieure pour déterminer le rendement des noyaux, l&#39;intégrité des noyaux, et pour déterminer les niveaux de gènes cibles avant noyaux isolement de transcription. <ol><li> Transférer 50 ul de l&#39;homogénat filtré pour un tube de 1,5 ml frais à l&#39;aide d&#39;une pipette. Ceci est l&#39;échantillon de pré-isolement. Ajouter 500 ul de réactif Trizol (voir Matériaux PDF, ATTENTION), inverti à mélanger, et conserver à -20 ° C pour l&#39;isolement de l&#39;ARN ultérieure (étape 3.1). </li><li> Transférer 20 ul de l&#39;homogénat filtré à un tube de 1,5 ml de frais. <ol><li> Ajouter DAPI à une concentration finale de 0,1 pg / ml, et incéchantillon Ubate sur la glace pendant 10 min. </li><li> Transfert noyaux DAPI colorées à une lamelle enduit poly-lysine, et les déposer sur une lame de microscope. Sceller la lamelle à l&#39;aide de vernis à ongles transparent. </li><li> Vérifier l&#39;intégrité de noyaux, et la présence de noyaux de GFP étiqueté d&#39;intérêt en utilisant un microscope à fluorescence. Remarque: Il n&#39;est pas nécessaire de fixer les noyaux, ou pour colorer pour la GFP si ces lames sont analysées assez rapidement après la préparation (dans les 24 h). </li></ol></li><li> Transférer 10 ul de l&#39;homogénat filtré à un nouveau tube de 1,5 ml et ajouter 90 ul de tampon de lavage (1 x PBS, pH 7,4; 2,5 mM de MgCl2). Ajouter DAPI à une concentration finale de 0,1 pg / ml, et laisser incuber sur de la glace pendant 10 min. Déterminer le rendement de noyaux dans l&#39;échantillon de pré-isolement en utilisant un hémocytomètre pour compter les noyaux DAPI-positive en utilisant l&#39;épifluorescence sous un objectif 10X d&#39;air. </li></ol></li><li> Placez le tube de 1,5 ml contenant les billes liées à l&#39;anticorps (préparés dans la section 2.1.6) dans un rack magnétique,et permettent aux billes magnétiques de se lier à l&#39;aimant pendant au moins 2 min comme décrit dans la section 2.1.4. Retirer le tampon de lavage des billes liées à l&#39;anticorps en utilisant une pipette de 1 ml et ajouter l&#39;homogénat filtré de l&#39;étape 2.5 pour le tube de 1,5 ml à l&#39;aide d&#39;une pipette de 1 ml. </li><li> Retourner doucement le tube plusieurs fois pour mélanger et incuber à 4 ° C pendant 30 min avec la fin sur la fin de l&#39;agitation. Éviter les bulles dans le tube, si possible, étant donné que ceux-ci peuvent se traduire par l&#39;agglutination des noyaux. </li><li> Placez le tube de 1,5 ml contenant les billes et homogénat anticorps lié à un support magnétique, et permettent aux billes magnétiques de se lier à l&#39;aimant pendant au moins 2 min comme décrit dans la section 2.1.4. Retirer le broyat contenant la fraction non liée noyaux utilisant une pipette de 1 ml. </li><li> Laver l&#39;échantillon 3x avec 1 ml de tampon de lavage à chaque fois. Retirez le tube de 1,5 ml contenant les perles, des noyaux liés et le tampon de lavage du rack et mélanger par inversion plusieurs fois, puis placer le tube dans le support magnétique comme décrità l&#39;étape 2.9 et retirer le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette de 1 ml. </li><li> Ajouter 150 ul de tampon de lavage pour les billes, qui doivent être liés à des noyaux cibles. Ceci est l&#39;échantillon post-isolation. Préparer les échantillons pour analyse au microscope et l&#39;extraction de l&#39;ARN ultérieure. <ol><li> Transférer 20 ml de l&#39;échantillon post-isolation à un tube de 1,5 ml frais et tache avec DAPI et analyser comme décrit dans la section 2.6.2. Comptez le GFP + / DAPI + et + GFP-/DAPI noyaux capturés par des billes magnétiques pour déterminer la pureté de la GFP enrichi + noyaux dans l&#39;échantillon post-isolation. </li><li> Ajouter 1 ml de réactif Trizol pour le reste de l&#39;échantillon post-isolation, mélanger par inversion, et conserver à -20 ° C pour l&#39;isolement de l&#39;ARN ultérieure (étape 3.1). Note: Les échantillons de Trizol peuvent être stockées pendant plusieurs semaines si nécessaire à -20 ° C. Il n&#39;est pas nécessaire pour éluer les noyaux à partir des billes magnétiques avant l&#39;extraction de l&#39;ARN en utilisant le réactif Trizol, because les bourrelets ne gênent pas l&#39;isolement d&#39;ARN ultérieur. </li></ol></li></ol> 3. Déterminer les niveaux de transcription dans des noyaux isolés de larves tissus <ol><li> Isoler l&#39;ARN des échantillons de pré-et post-isolation isolement préparés dans les sections 2.6.1 et 2.11.2 en utilisant le protocole standard décrit pour l&#39;extraction de l&#39;ARN à base de Trizol (voir Matériaux PDF) avec les modifications suivantes: <ol><li> Après la précipitation de la pastille d&#39;ARN, ajouter 19,2 ul d&#39;eau exempte de RNase et 0,8 ul de réactif (voir Matériaux RNASecure PDF) au culot et incuber à 60 ° C pendant 20 min pour inactiver des ARNases. </li></ol></li><li> Déterminer la concentration de l&#39;ARN avec un colorant fluorescent de liaison d&#39;ARN-tel que le kit de dosage de l&#39;ARN du qubit (voir Matériels PDF) en utilisant la 2,0 QubitR Fluoromètre selon le protocole du fabricant. </li><li> Synthétiser l&#39;ADNc en utilisant une transcriptase inverse amplifier comme le EpiScript kit de transcriptase inverse et des amorces oligodT en suivant les instructions du fabricant. Remarque: En général, 50 à 100 ng d&#39;ADNc de l&#39;ARN génère suffisante pour effectuer les analyses d&#39;expression de gènes multiples. Des quantités équivalentes de pré-isolement et l&#39;isolement de l&#39;ARN post-doivent être utilisés pour générer l&#39;ADNc. </li><li> Ajouter 180 ul d&#39;eau sans nucléase à l&#39;échantillon d&#39;ADNc de 20 pi de diluer ce 10 fois avant de PCR en temps réel quantitative (qPCR) analyse. Cette dilution est une étape importante, parce que les échantillons d&#39;ADNc non dilués peuvent inhiber la qPCR. </li><li> Préparer un mélange maître PCR quantitative avec la polymerase et des dNTP, 4 pmoles de chacune des amorces avant et inverse, composé avec de l&#39;eau stérile pour le volume de réaction final de 20 pi. <ol><li> Concevoir des amorces qPCR pour cibler des gènes qui sont attendus pour être exprimé dans le type de cellule d&#39;intérêt, et à l&#39;étape de développement au cours de laquelle le tissu est collecté. Conception des amorces à s&#39;étendre un intron si possible, de sorte que la génomique etdes produits de PCR de l&#39;ADNc peuvent être distinguées. Remarque: Si le profil d&#39;expression du gène de type de la cellule cible n&#39;est pas connue, les amorces contre l&#39;eGFP, qui doit être exprimé spécifiquement dans la population de noyaux marqués, peuvent être utilisés pour optimiser le protocole d&#39;un type particulier de cellules et de tissus (tableau 1). </li></ol></li><li> Déterminer les niveaux de transcription relative de chaque gène d&#39;intérêt dans des échantillons pré-et post-isolation isolement par rapport à une série de dilutions d&#39;ADNc préparée à partir du tissu ensemble. niveaux de gènes cibles de transcription doivent être normalisées à un gène de référence, tel Rpl32 (ou de préférence de plusieurs gènes de référence). </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Ce protocole peut être utilisé pour isoler ou enrichir très précisément noyaux marqués de populations de cellules mixtes chez la drosophile embryonnaire ou tissus larvaires. En utilisant ce protocole, les noyaux peuvent être isolés à partir de tissus disséqués en environ 1 heure. La pureté et le rendement des noyaux isolés doivent être déterminés expérimentalement pour chaque type de cellule. Il peut être difficile de quantifier les noyaux de talon lié à l&#39;étape de post-isolement du pro...

Drosophila tissus tels que le système nerveux central contiennent un mélange complexe de types cellulaires. Ainsi, pour analyser les profils d&#39;expression de gènes spécifiques des cellules provenant de tissus de Drosophila, il est d&#39;abord nécessaire d&#39;isoler une population homogène de cellules spécifiques dans des quantités suffisantes pour permettre à des applications en aval. Des procédés pour isoler des cellules provenant de tissus intacts comprennent microdissection par laser, et la cellule activé par fluorescence (FACS) de cellules entières. Bien que FACS a été utilisé pour isoler des cellules et des noyaux d&#39;embryons de Drosophila et de Caenorhabditis elegans pour l&#39;expression génique et la chromatine de profilage 1-3, FACS et microdissection laser peuvent être difficiles à effectuer avec succès dans des tissus qui contiennent des types de cellules très mélangés entre eux ou que les cellules contiennent avec morphologie irrégulière, telles que les neurones. Pour surmonter cette difficulté, plutôt que les noyaux des cellules peuvent être isolées à partir de types de cellules spécifiques et utilisés pour gen suivantee profilage de l&#39;expression. Fait important, l&#39;analyse d&#39;expression de l&#39;ARNm à base de puces à ADN, en utilisant des échantillons d&#39;ARN nucléaires montre des résultats généralement comparables à celles effectuées en utilisant l&#39;ARN total de 4, 5. En outre, l&#39;analyse de l&#39;expression du gène en utilisant l&#39;ARN nucléaire a été utilisée avec succès pour étudier l&#39;expression des gènes dans plusieurs organismes, y compris C. elegans, Arabidopsis thaliana, la drosophile, et les êtres humains 4, 5 2, 3. Plusieurs approches ont été récemment décrite pour l&#39;isolement de populations spécifiques de noyaux marqués à partir de tissus de Drosophila qui sont appropriés pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique et / ou immunoprécipitation de la chromatine. L&#39;isolement de lot de la chromatine tissu-spécifique pour la méthode immuno-précipitation (BiTS-Chip) utilise FACS pour isoler les noyaux fixes sur la base d&#39;un type de cellule spécifique expression de la GFP nucléaire localisée 2. Cette approche a été successfully utilisé pour analyser la distribution des modifications des histones et des facteurs de transcription à l&#39;aide d&#39;immunoprécipitation de la chromatine des noyaux isolés du mésoderme d&#39;embryons de Drosophila 2. Cependant, les approches basées sur FACS peuvent être moins approprié pour isoler noyaux marqués qui constituent seulement une petite proportion d&#39;une population mixte en raison du temps de tri accrue nécessaire pour obtenir un nombre adéquat pour des applications en aval. Pour surmonter ces limitations, plusieurs groupes ont utilisé des techniques d&#39;isolement basées sur l&#39;affinité pour purifier les noyaux qui sont marqués avec un épitope spécifique d&#39;un type cellulaire particulier. L&#39;isolement des noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques de la méthode (INTACT) développés pour une utilisation chez Arabidopsis thaliana 6, 7 a récemment été adapté pour être utilisé chez la drosophile 8. Dans ce procédé, une protéine de fusion de l&#39;enveloppe nucléaire qui est un substrat pour la biotinylation in vivo est coexpressed avec la biotine ligase de Escherichia coli BirA dans des types cellulaires spécifiques. les noyaux marqués à la biotine peuvent être ensuite purifiés à partir de populations mixtes à l&#39;aide de l&#39;isolement d&#39;affinité basée streptavidine. En utilisant cette approche, les noyaux ont été marqués avec succès et le mésoderme isolés à partir d&#39;embryons de Drosophila, dans lequel une protéine de fusion de l&#39;enveloppe nucléaire a été exprimée sous le contrôle d&#39;un amplificateur spécifique-8 du mésoderme. Les auteurs ont également généré des protéines nucléaires enveloppe de fusion qui peuvent être exprimées dans n&#39;importe quel type de cellule sous contrôle de la séquence régulatrice Gal4, UAS 9. Cette approche est capable d&#39;isoler rapidement des sous-ensembles de noyaux marqués de populations mixtes, mais nécessite trois constructions transgéniques distinctes et n&#39;est donc pas adapté pour des applications génétiques particulières. Récemment, une approche a été décrite dans lequel SUN (S ad1 et C-84 des Nations Unies) des protéines contenant le domaine qui localisent à la membrane interne de l&#39;enveloppe nucléaire ont été marqués pardes protéines fluorescentes et exprimé sous le contrôle du système GAL4/UAS 10. Les noyaux ont été isolés en présence d&#39;un détergent non ionique pour enlever la membrane externe de l&#39;enveloppe nucléaire, et purifié par affinité en utilisant des billes magnétiques couplées à des anticorps anti-GFP. Cette approche a été utilisée avec succès pour isoler de petites populations de noyaux marqués de sous-types de neurones spécifiques dans le cerveau adulte de Drosophila 10. Ici, un protocole d&#39;isolement des noyaux marqués à partir d&#39;une population mixte de cellules de Drosophila tissu larvaire est décrite. Cette méthode a été développée de façon indépendante, mais est similaire à l&#39;approche décrite par Henry et al. 10 Tout d&#39;abord, les noyaux ont été marqués avec un marqueur fluorescent qui est exprimé uniquement dans des types cellulaires spécifiques chez Drosophila melanogaster pour faciliter l&#39;isolement subséquent de noyaux marqués de populations mixtes en utilisant une approche basée sur l&#39;affinité. Pour marquer les noyaux,le domaine KASH (K larsicht / A nc-1 / S yne h omology) a été utilisé. Le domaine KASH est un domaine transmembranaire qui localise à la membrane externe de l&#39;enveloppe nucléaire, en partie grâce à des interactions avec le soleil protéines contenant le domaine au sein de l&#39;espace périnucléaire 11. Le domaine de KASH C-terminale de protéines telles que Drosophila Msp-300 et Klarsicht ancre ces protéines de la membrane nucléaire externe, tandis que leurs domaines N-terminal d&#39;interagir avec des protéines du cytosquelette telles que l&#39;actine ou les microtubules dans le cytoplasme de 12 à 14. Les constructions ont été générées, dans lequel le domaine de Drosophila KASH Msp-300 a été fusionnée à l&#39;extrémité C-terminale de l&#39;EGFP, sous le contrôle de la séquence régulatrice de Gal4, UAS dans le vecteur pUAST-attB 15, 16. Utilisation phiC31 intégration spécifique de site, les mouches transgéniques ont été générées, dans lequel les UAS-EGFP :: Msp-300 KASH transgène a été inséré dans le locus sur le chromosome attP23L 17. Le SAMU-EGFP :: Msp-300 KASH vole peut être croisée avec les mouches qui expriment le pilote Gal4 dans un type cellulaire particulier, résultant dans l&#39;expression ciblée de EGFP sur la membrane nucléaire externe dans le type cellulaire d&#39;intérêt. Noyaux marqués peuvent ensuite être purifiés à partir de populations cellulaires mixtes utilisant des anticorps contre la GFP couplés à des billes magnétiques. Dans cette approche, l&#39;utilisation d&#39;un détergent non-ionique n&#39;est pas nécessaire parce que la balise EGFP est localisée sur le côté cytoplasmique de la membrane nucléaire externe, et est donc accessible à des anticorps. Le protocole décrit ci-dessous peut être utilisé pour isoler / enrichir noyaux EGFP marqué à partir de types de cellules spécifiques dans Drosophila tissus larvaires, pour quantifier la pureté et le rendement de noyaux isolés, et l&#39;extrait d&#39;ARN nucléaire approprié pour la transcription inverse couplée avec polymérase quantitative de la chaîne (qRT -PCR) Analyse de l&#39;expression des gènes. L&#39;isolement et la purification par affinité de noyaux (hors tissue dissection) peut être effectuée en moins d&#39;une heure. Les résultats sont présentés montrant que les noyaux gliales peuvent être isolés avec succès à partir du lobe de l&#39;optique et des larves disque imaginai de l&#39;oeil, et utilisées pour l&#39;analyse ultérieure de l&#39;expression des gènes. Il est prévu que cette approche est utile pour l&#39;isolement / enrichissement de noyaux marqués à partir de tissus embryonnaires et larvaires dans laquelle les cellules cibles constituent moins de 5% de la population globale. Tous les stocks de drosophile et les plasmides générées par cette étude sont disponibles auprès des auteurs sur demande.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1884">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td style="width:263px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:195px;">mAB24B10</td>
			<td style="width:828px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BEQPCR-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dounce Homogenizer (1 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62400-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Tweezers, 11 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td>This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EpiScript Reverse Transcriptase</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>ERT12910K</td>
			<td><a href="http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf">http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon cell strainers, 40 &#956;m pore size</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-949</td>
			<td>Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LSKMAGS08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Mini tube rotator</td>
			<td style="width:263px;">Genemate</td>
			<td style="width:195px;">H-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:599px;">Qubit starter kit</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">Q32871</td>
			<td style="width:828px;">Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RNAsecure (Ambion)</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">AM7010</td>
			<td style="width:828px;">The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RT-PCR machine Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">CFX Connect Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Siliconized 9 well glass plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 - 460nm) excitation + yellow barrier</td>
			<td style="width:263px;">Nightsea</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td>This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:195px;">SMZ 745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td>CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf" >http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0777-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity-based isolation of tagged nuclei from drosophila tissues for gene expression analysis

Les tissus embryonnaires et les larves de Drosophila melanogaster contiennent souvent un mélange très hétérogène de types de cellules, ce qui peut compliquer l&#39;analyse de l&#39;expression génique dans ces tissus. Ainsi, pour analyser les profils d&#39;expression de gènes spécifiques des cellules provenant de tissus de Drosophila, il peut être nécessaire d&#39;isoler des types cellulaires spécifiques avec une grande pureté et à des rendements suffisants pour des applications en aval, tels que le profilage de la transcription et immunoprécipitation de la chromatine. Cependant, la morphologie cellulaire irrégulière dans des tissus tels que le système nerveux central, couplé à la population rare de types de cellules spécifiques dans ces tissus, peut poser des problèmes pour les méthodes traditionnelles d&#39;isolement des cellules, tels que la microdissection laser et cellulaire activé par fluorescence (FACS) . Ici, une approche alternative pour la caractérisation des profils d&#39;expression de gènes spécifiques des cellules en utilisant l&#39;isolement par affinité à base de noyaux marqués, plutôt que des cellules entières, est décrite. Noyaux dans le c spécifiquetype d&#39;intérêt de coude sont génétiquement marqué avec une étiquette de EGFP enveloppe nucléaire localisée en utilisant le système d&#39;expression binaire GAL4/UAS. Ces noyaux d&#39;EGFP-étiqueté peuvent être isolés en utilisant des anticorps contre la GFP qui sont couplés à des billes magnétiques. L&#39;approche décrite dans ce protocole permet l&#39;isolement cohérente des noyaux à partir de types de cellules spécifiques dans le système larvaire nerveux central chez la drosophile à haute pureté et à des niveaux suffisants pour une analyse d&#39;expression, même si ces types de cellules comprennent moins de 2% de la population cellulaire totale dans l&#39; tissu. Cette approche peut être utilisée pour isoler les noyaux à partir d&#39;une grande variété de Drosophila embryonnaire et types de cellules en utilisant des larves de Gal4 pilotes spécifiques, et peut être utile pour isoler les noyaux de types de cellules qui ne conviennent pas pour FACS ou microdissection par laser.

Le pilote repo-GAL4 (Bloomington stock number 7415) est spécifiquement exprimée dans les cellules gliales du système nerveux chez la drosophile à plusieurs stades de développement 18. Les mouches ont été générés qui expriment de manière stable SAMU-EGFP :: Msp-300 KASH sous le contrôle du pilote repo-GAL4 en utilisant des techniques génétiques standard. Afin de caractériser le profil d&#39;expression de l&#39;EGFP :: KASH transgène dans ces mouche...

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Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis | Biology | Video

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Tissus de Drosophila contiennent souvent un mélange hétérogène de types de cellules. Afin d&#39;examiner l&#39;expression des gènes dans des types de cellules spécifiques d&#39;un tissu particulier, les noyaux peuvent être génétiquement marqués et ensuite isolés en utilisant une approche basée sur l&#39;affinité. Des noyaux isolés peuvent être utilisés pour des applications en aval tels que l&#39;analyse de l&#39;expression génique et immunoprécipitation de la chromatine.

Isolation basée sur l&#39;affinité de Tagged noyaux de<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

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Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

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14.6K vues.  Purdue University.  Tissus de Drosophila contiennent souvent un mélange hétérogène de types de cellules. Afin d'examiner l'expression des gènes dans des types de cellules spécifiques d'un tissu particulier, les noyaux peuvent être génétiquement marqués et ensuite isolés en utilisant une approche basée sur l'affinité. Des noyaux isolés peuvent être utilisés pour des applications en aval tels que l'analyse de l'expression génique et immunopré...

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Analyse bactérienne expression génique par puces à ADN

Recherche

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Isolement d&#39;ARN à partir de synthèse d&#39;ADNc embryonnaires Zebrafish et pour analyser l&#39;expression génique

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robotique et d&#39;analyse d&#39;images dynamiques pour les études d&#39;expression génique dans les tissus végétaux

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.