Ce protocole aide à isoler la microglie des lésions de démyélinisation microdisséquées du cerveau de la souris adulte pour étudier les caractéristiques microgliales in vivo. Cette technique permet de gagner du temps et d’avoir des exigences plus faibles pour les expérimentateurs et les équipements. Cette méthode aide à isoler les microglies du cerveau de l’animal, en particulier les tissus microdisséqués dans divers états pathologiques.
Commencez par microdisséquer les lésions marquées par un colorant neutre autour du corps calleux sous un stéréomicroscope. Centrifuger le tissu disséqué à 300 fois g pendant 30 secondes pour prélever l’échantillon au fond du tube. Préchauffer le mélange d’enzymes un et le mélange d’enzymes deux à 37 degrés Celsius dans un incubateur.
Ensuite, ajoutez 1 950 microlitres de mélange d’enzymes préchauffé un à un échantillon et digérez dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajouter 30 microlitres d’enzymes préchauffées mélanger deux, et mélanger doucement. Après la digestion, ajoutez quatre millilitres de PBS froid au tube et secouez doucement.
Centrifuger les échantillons de tissu à 300 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et aspirer le surnageant lentement et complètement. Remettez en suspension doucement la pastille de cellule avec 1 550 microlitres de PBS froid. Ajouter 450 microlitres de la solution froide pour l’élimination des débris et bien les mélanger.
Utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour superposer le mélange très lentement et doucement avec deux millilitres de PBS froid. Centrifugez le mélange, puis recherchez les trois couches. Utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour aspirer complètement les deux couches supérieures et remplissez le tube jusqu’à cinq millilitres avec un tampon de chargement à froid.
Inverser doucement le tube trois fois. Ensuite, après centrifugation et aspiration du surnageant, remettez en suspension la pastille de cellule avec 90 microlitres de tampon de chargement et ajoutez 10 microlitres de billes CD11b. Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Après l’incubation, ajoutez un millilitre du tampon de chargement et lavez les cellules en pipetant doucement le liquide de haut en bas avec une pipette de 1 000 microlitres. Centrifuger les cellules à 300 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et aspirer complètement le surnageant pour éliminer les billes non liées. Remettez en suspension les cellules dans 500 microlitres du tampon de chargement et placez la colonne MS avec son séparateur pour une sélection positive dans le champ magnétique.
Rincez la colonne avec 500 microlitres du tampon de chargement pour protéger les cellules et assurer l’efficacité du tri magnétique basé sur le protocole du fabricant. Appliquez la suspension de cellule sur la colonne MS et jetez le flux contenant les cellules non étiquetées. Ajoutez 500 microlitres du tampon de chargement pour laver la colonne et retirez-la du séparateur.
Placez la colonne sur un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et ajoutez un millilitre du tampon de chargement dans la colonne. Enfin, poussez le piston vers le bas de la colonne pour débusquer les cellules marquées magnétiquement. Une représentation schématique de la stratégie de contrôle utilisée dans l’analyse par cytométrie en flux de microglies isolées des lésions de démyélinisation de souris adultes avant et après le tri cellulaire activé magnétiquement est présentée ici.
Les images graphiques représentent la hauteur de diffusion vers l’avant et la hauteur de dispersion latérale pour la sélection des cellules, la zone de dispersion vers l’avant et la hauteur de dispersion vers l’avant pour la sélection de cellules uniques, et CD11b-FITC et CD45-APC pour sélectionner les cellules myéloïdes et la microglie. La proportion de microglies a considérablement augmenté après le tri des cellules activées magnétiquement. L’image graphique représente la stratégie de contrôle utilisée dans l’analyse de cytométrie en flux pour les cellules individuelles vivantes et mortes après le tri des cellules activées magnétiquement.
Ici, la 7-aminoactinomycine D et la hauteur de dispersion latérale ont été utilisées pour sélectionner les cellules vivantes. Lors de cette tentative, n’oubliez pas de microdisséquer avec précision les lésions démyélinisantes sous un stéréomicroscope en fonction des marques rouges neutres.
