Nous remercions les membres du laboratoire Rosenblatt pour des discussions scientifiques, des suggestions et commentaires. Nous tenons également à remercier Mary Halloran qui a gentiment fourni le plasmide codant pour DP-UtrCH et David Grunwald qui a fourni les CK: GFP transgéniques poisson zèbre. Merci également à Gretchen King et le personnel de la ressource centralisée au poisson-zèbre à l&#39;Université de l&#39;Utah pour l&#39;entretien et les soins excellents du poisson-zèbre. Ce travail a été soutenu par le NIH Prix NIGMS directeur du NIH est une Innovateur Nouveau DP2 OD002056-01 à JR. GTE a été soutenu par le NIH multidisciplinaire du cancer du Programme de subventions de formation 5T32 CA03247-8.

Workflow de base pour la visualisation de la dynamique d&#39;actine lors de l&#39;extrusion cellulaire de l&#39;épiderme du poisson zèbre développement L&#39;épiderme du poisson-zèbre en développement est composé de deux couches distinctes, la couche de surface (ou périderme) et une couche basale de cellules que le contact de la membrane 2 sous-sol. Les cellules de la couche de surface extérieure apoptose et sont éliminés du tissu par extrusion 3 (figure 1). Pour visualiser ce processus en temps réel, nous injectons ARN codant pour une protéine fluorescente rouge fusionnée au domaine d&#39;homologie calponine de l&#39;utrophine, une protéine liant l&#39;actine (DP-UtrCH) 4,5, dans un stade de cellules transgéniques exprimant le poisson-zèbre protéine fluorescente verte (GFP ) sous le stratifié promoteur épithélium cytokératine 8 6 (figure 2A). Bien que DP-UtrCH est exprimée de manière ubiquitaire dans l&#39;animal après l&#39;injection d&#39;ARN, nous nous concentrons sur les cellules superficielles épidermiques qui expriment à la fois DP et GFP de suivre la dynamique d&#39;actine spécifiquement dans l&#39;épiderme (figure 2B). Nous avons ensuite traiter les larves avec G418 pour induire l&#39;extrusion de cellules apoptotiques et l&#39;image des filaments d&#39;actine et de l&#39;épiderme à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal à disque rotatif et d&#39;acquérir des bases de données 4D. Avant de commencer l&#39;expérience <ol><li> In vitro, la transcription de l&#39;ARN à partir d&#39;un modèle d&#39;ADN linéarisé en utilisant le kit mMessage mMachine SP6 (Ambion) et de purifier l&#39;ARN coiffé en utilisant le kit RNeasy Mini (Qiagen). Diluer l&#39;ARN à l&#39;aide de ~ 60ng/ul eau stérile, assurez-3-5uL aliquotes et stocker à -80 ° C jusqu&#39;au moment de l&#39;injection. Remarque: éviter le gel répétitif / décongélation pour prévenir la dégradation de l&#39;ARN. </li><li> Faire un moule à tenir les embryons pendant l&#39;injection en versant 40 ml d&#39;agarose à 2% en milieu d&#39;embryon E3 (E3) dans une plaque de 100 x 15mm et la culture de placer un moule microinjection (Adaptive Science Tools, # I-34) dans ce bac. Une fois que l&#39;agarose est solidifié, retirer le moule pour exposer le creux de l&#39;agarose. Magasin de la plaque à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Tirez aiguilles pour l&#39;injection capillaire à l&#39;aide de filaments de verre borosilicaté (OD 1.0mm, ID 0,78, longueur 10cm) et un extracteur Sutter pipette P-97 avec les paramètres suivants (chaleur 485, Pull 50, vitesse 60, Delay / Durée 90, Pression 200 ). Remarque: différents types de verre, il faudra l&#39;optimisation des conditions énumérées. </li><li> Maquillage 1% Low Melt (LM) agarose en E3 et stocker 1ml aliquotes à 42 ° C. Soyez prudent car l&#39;évaporation de l&#39;E3 à partir des stocks peut augmenter la concentration d&#39;agarose. </li><li> Maintenir le poisson zèbre adulte dans des conditions standard de laboratoire, avec une régulière de la lumière cycle jour / nuit de 14 heures de lumière et 10 heures d&#39;obscurité 7. La nuit avant l&#39;expérience mis en place les poissons à s&#39;accoupler en plaçant 3 femelles et 2 mâles dans un réservoir séparé par une cloison. Le lendemain matin, changer l&#39;eau dans le réservoir et tirez le diviseur lorsque les lumières s&#39;allument. </li></ol> 1. L&#39;injection d&#39;ARN codant pour la protéine actine par fluorescence Tagged reliure <ol><li> Décongeler les ARN sur la glace. Ajouter 0,5% rouge de phénol à l&#39;ARN à un ratio de 1:1 pour une concentration finale de l&#39;ARN et de la charge ~ 30ng/μl solution de 1 microlitre dans une aiguille tiré capillaire par remblayage. </li><li> Recueillir ~ 75 1-cellule stade 8 CK: GFP dans des embryons E3. Pipet la pipette recueillies embryons dans le moule avec une microinjection 5 ¾ Pasteur et doucement orienter les embryons dans le creux avec FST Dumont # 5 forceps. Remarque: Prenez soin de travailler rapidement pour éviter d&#39;injecter dans un embryon au stade multi-cellules, ce qui peut entraîner l&#39;expression mosaïque de l&#39;ARN injecté. </li><li> En vertu d&#39;un stéréomicroscope standard de laboratoire de dissection, d&#39;injecter de l&#39;ARN dans le jaune de l&#39;embryon en utilisant un microinjecteur pression contrôlée (Harvard Apparatus PLI-100 Pico-injecteur). Une tache rouge (rouge de phénol) doivent être visibles dans l&#39;embryon après l&#39;injection. Injecter au moins 50 embryons pour chaque expérience. (Voir le protocole JoVE précédent pour un protocole détaillé sur l&#39;injection de l&#39;ARN dans des embryons de poisson zèbre 9). Note: <ol type="A"><li> Un volume de ~ 2NL devrait être utilisé pour l&#39;injection de l&#39;ARN en une seule cellule embryons au stade. Pour déterminer la quantité d&#39;ARN injecté, dispenser un bolus de l&#39;ARN dans une goutte d&#39;huile minérale sur une lame micrométrique calibrée ou sous un microscope avec une barre d&#39;échelle construite dans les oculaires. La goutte de l&#39;ARN doit être une sphère parfaite. Calculez le montant remis à l&#39;aide de l&#39;équation: Volume (en NL) = 4/3πr 3. Réglez le volume livré en changeant la pression d&#39;injection ou de temps sur l&#39;instrument. </li><li> Des précautions doivent également être prises pour injecter le plus faible quantité d&#39;ARN qui permet la visualisation du fluorophore, comme de fortes concentrations d&#39;ARN peuvent être toxiques pour l&#39;embryon en développement. Pour déterminer le niveau d&#39;expression approprié, une expérience dose-courbe doit être effectué avant l&#39;exécution de l&#39;expérience. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Trier les embryons pour éliminer les œufs non fécondés ou endommagé et placer tous les embryons restants à 28,5 ° C. </li><li> Après 24 heures, utiliser un microscope à fluorescence dissection de sélectionner les embryons de poisson zèbre qui ont un niveau élevé de la GFP (épiderme) et DP (actine) à fluorescence. Placer les embryons sélectionnés à 28,5 ° C jusqu&#39;au moment de procéder à la désintoxication à induire l&#39;apoptose. </li></ol> 2. L&#39;induction de cellules dans Extrusion larves de poisson zèbre en utilisant G418 Nous avons constaté que l&#39;exposition à l&#39;antibiotique aminoglycoside G418 ou généticine, provoque l&#39;apoptose et l&#39;extrusion des cellules épidermiques dans le développement de larves de poisson zèbre 3 par un mécanisme inconnu. Surtout, ce traitement ne fonctionne que sur les larves qui sont quatre jours après la fécondation et plus. Nous constatons que ~ 5-25 cellules peuvent être trouvées extrusion à un moment donné de la nageoire épithéliales de G418 zebrafish larvaires traitées. Comme la quantité de cellules apoptotiques extrusion peut varier de poissons à pêcher, nous recommandons de monter les poissons multiples pour l&#39;imagerie. <ol><li> Recueillir et placer 4 jours après la fécondation (DPF) des larves de poisson zèbre présentant à la fois la GFP et DP de fluorescence dans un plat de 35 x 10mm culture contenant 3 millilitres (ml) de l&#39;E3. On peut traiter jusqu&#39;à 25 larves dans cette boîte de culture de taille. </li><li> Replacez soigneusement le support avec des 3mLs 1mg/mL contenant des larves de l&#39;E3 G418 et incuber dans le médicament pendant 4 heures à 28,5 ° C. Notez que le G418 est sensible à la lumière, afin de prendre soin de garder la boîte de culture couverte ou dans l&#39;obscurité. </li><li> Retirez le support et le remplacer par pré-chauffé à 28,5 ° C E3 Media contenant 0,02% de tricaïne et de procéder à de fixation des larves. </li></ol> 3. Les larves de poisson zèbre de montage pour l&#39;imagerie <ol><li> Transfert 3 larves d&#39;un tube eppendorf de 1,5 ml et de retirer la plupart de l&#39;E3, après l&#39;évier de poisson à fond du tube. Nous avons constaté que jusqu&#39;à 3 animaux peuvent être correctement monté avant l&#39;agarose se solidifie. </li><li> En utilisant une pipette couper, 120ul pipette de 1% LM-agarose (42 ° C) dans le tube, mélanger, puis délicatement la pipette, les larves et le mélange d&#39;agarose sur la lamelle dans le fond d&#39;une boîte de culture de MatTek. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un support TSF broches avec une broche d&#39;insertion ou de tungstène aiguille, rapidement orienter les larves de sorte qu&#39;elles sont droites et à plat contre la lamelle du plat MatTek. Note: Nous utilisons généralement une épingle droite pour orienter le premier larves, puis une broche en forme de L pour s&#39;assurer qu&#39;ils sont bien à plat contre la lamelle tout en prévenant les dommages aux spécimens. </li><li> Une fois que l&#39;agarose est solidifié, délicatement remplir la cuve avec l&#39;E3 contenant 0,02% de tricaïne. Note: Alternativement, le G418 peut être ajouté à l&#39;E3 dans le plat d&#39;imagerie à continuer d&#39;extrusion induisant, bien que l&#39;exposition prolongée aux 1mg/mL G418 va tuer les larves. </li></ol> 4. En direct sur la dynamique d&#39;imagerie actine et les comportements individuels des cellules épithéliales lors de l&#39;extrusion cellulaire en utilisant un microscope confocal à disque rotatif Nous avons constaté que l&#39;ensemble du processus d&#39;extrusion cellulaire par apoptose de l&#39;épiderme du développement des larves de poisson zèbre prend environ 20 minutes 3. Ici nous démontrons comment configurer une expérience d&#39;imagerie time-lapse de collecter une série de plans z grâce à une seule couche de l&#39;épiderme zèbre de visualiser le processus d&#39;extrusion. Nous avons constaté que les microscopes à champ large typiquement fluorescents cause importante photoblanchiment des filaments d&#39;actine et ne permettent pas pour l&#39;imagerie timelapse. Par conséquent, afin de maximiser notre résolution et de prévenir photoblanchiment, nous utilisons un microscope confocal à disque rotatif. Ci-dessous nous décrivons comment configurer l&#39;expérience en utilisant le logiciel IQ Andor avec un microscope Nikon, bien que les principes exposés peuvent être appliqués au microscope similaires set-ups. <ol><li> D&#39;abord, allumer l&#39;Argon (pour l&#39;excitation de la GFP à 488nm) et HeNe (pour l&#39;excitation de la DP à 561nm) lasers, un microscope, une caméra et la lampe à fluorescence. </li><li> Dans le logiciel Andor QI (version 1.10.1), créer un protocole de séries chronologiques contenant les longueurs d&#39;onde que vous voulez à l&#39;image, la fréquence de l&#39;intervalle entre les captures d&#39;image et le nombre de fois la capture doit être répété. </li><li> Placez délicatement le plat contenant MatTek votre spécimen sur la platine du microscope et de l&#39;utilisation d&#39;un objectif 20x avec la lumière transmise à se concentrer sur les larves. </li><li> Déplacer l&#39;objectif de l&#39;eau d&#39;immersion 40X (NA 0,8) dans la position correcte. L&#39;utilisation de cet objectif, nous pouvons films environ 20-25 cellules par champ, ce qui nous permet de suivre les comportements cellulaires lors de l&#39;extrusion tout résoudre dynamique de l&#39;actine sous-cellulaires. Remarque: Le montage mêmes et les stratégies d&#39;imagerie peuvent être appliquées aux microscopes droits, même si un objectif 40X d&#39;eau d&#39;immersion avec une longue distance de travail doit être utilisé. </li><li> Placez délicatement une goutte d&#39;eau sur le dessus de l&#39;objectif 40x et placer rapidement le plat de MatTek sur le dessus. None: la solution d&#39;immersion Zeiss Immersol peut également être utilisé si l&#39;évaporation de l&#39;eau est un problème. </li><li> Identifier l&#39;échantillon en utilisant la phase d&#39;illumination ou de DIC et ensuite utiliser épifluorescence 488nm de se concentrer spécifiquement sur l&#39;épiderme, la GFP positives. </li><li> Passer en mode confocal à balayage. Ajuster l&#39;intensité du laser et le temps d&#39;exposition pour chacun des canaux (488nm et 561nm) en conséquence. Prenez soin d&#39;équilibrer la puissance du laser et le temps d&#39;exposition pour une détection optimale de votre signal et d&#39;empêcher toute photoblanchiment ou de toxicité. </li><li> Pour identifier les cellules extrusion, utilisez épifluorescence pour visualiser la GFP étiqueté épiderme et d&#39;identifier un groupe de cellules dans un modèle de rosette classique, composé d&#39;une collection de cellules entourant une petite cellule ronde au milieu. Utilisation du mode confocal à balayage, il devrait également y avoir une accumulation de l&#39;actine DP-étiquetés visible comme un anneau autour de la petite cellule ronde au milieu, une caractéristique de l&#39;extrusion cellulaire. Une fois que vous avez identifié une cellule d&#39;extrusion, rapidement mis en place le microscope pour acquérir 4D (XYZ-temps) des ensembles de données confocale. </li><li> Définissez les points supérieur et inférieur dans le plan z pour visualiser une seule couche de l&#39;épiderme, y compris la cellule d&#39;extrusion, et sélectionnez la taille du pas. Pour imagerie time-lapse, réglez la fréquence de la capture d&#39;image et le nombre de répétitions. Par exemple, nous avons généralement l&#39;acquisition d&#39;une série Z couvrant 5 10 microns, avec une taille de 1 um étape, toutes les 1-2 minutes pendant 30 minutes. </li><li> Pour afficher les données, nous font généralement en 3-D des projections de la série Z et enregistrer l&#39;ensemble des données comme un fichier vidéo qui est compatible avec Quick Time (Apple). De cette manière, nous pouvons visualiser la contraction de l&#39;anneau d&#39;actine et de comportements épithéliales qui se produisent autour de la cellule meurt au cours du temps. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Schéma de l&#39;extrusion cellulaire par apoptose. Les filaments d&#39;actine sont indiquées en rouge, la GFP positives cellules épidermiques sont de couleur verte. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Workflow expérimentale. Schéma A. du workflow pour l&#39;expérience. B. Expression de la DP-UtrCH dans l&#39;épiderme d&#39;un CK 4dpf: GFP poisson zèbre. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Images fixes (z-projections) à partir d&#39;un film accéléré qui suit en direct dynamique de l&#39;actine au cours du processus d&#39;extrusion des cellules épithéliales. Les flèches indiquent l&#39;anneau d&#39;actine formés par les cellules voisines qui se contracte et se ferme au cours des 2 minutes.

<ol>
	<li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li><li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium.">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li><li>Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li><li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8.">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li></ol>

Assurance protection des animaux Toutes les procédures effectuées dans ce protocole en utilisant le poisson zèbre, Danio rerio, ont été approuvés par l&#39;Institutional Animal Care et utilisation comité (IACUC) à l&#39;Université de l&#39;Utah (Assurance Animal Welfare # 10-07017).

Le protocole décrit ici montre une méthode simple et facile à visualiser le processus d&#39;extrusion dans un tissu vivant épithéliales. Ce type d&#39;expérience nous permet d&#39;examiner les subtilités de la dynamique de l&#39;actine pas auparavant appréciés dans les analyses de tissus fixés, et par conséquent, des compléments en commun des méthodes d&#39;immunofluorescence. Nous pouvons utiliser ce protocole en combinaison avec des inhibiteurs chimiques ou mutants génétiques pour mieux analyser le proc...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom </th><th> Tapez </th><th> Société </th><th> Nombre de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Réactifs </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6 Kit </td><td> Réactifs </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td> Réservoirs Traversée </td><td> Outil </td><td> Thoren systèmes aquatiques </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La pompe à Pipet </td><td> Outil </td><td> Produits Bel Art </td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ¾ pipette Pasteur </td><td> Outil </td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td> Moule microinjection </td><td> Outil </td><td> Adaptive Science Tools </td><td> I-34 </td><td></td></tr><tr><td> Plaque de culture 100x15mm </td><td> Outil </td><td> Fisher </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / Brown micropipette Puller </td><td> Outil </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> Modèle P97 </td><td></td></tr><tr><td> Capillaires en verre borosilicate avec filament </td><td> Outil </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> B1400-78-10 </td><td> OD 1.0mm, 0.78mm ID, longueur 10cm </td></tr><tr><td> Pot de rangement des électrodes </td><td> Outil </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td> Rouge de phénol </td><td> Réactifs </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td><td> 0,5% dans DPBS </td></tr><tr><td> Pression contrôlée microinjecteur et Micromanipulateur </td><td> Outil </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-100 </td><td></td></tr><tr><td> Boîte de culture 35x10mm </td><td> Outil </td><td> Cellstar </td><td> 627-160 </td><td></td></tr><tr><td> G418 (généticine) </td><td> Réactifs </td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> 50 mg / mL dans dH 2 0 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 forceps </td><td> Outil </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11253-20 </td><td></td></tr><tr><td> 12cm Pin Holder </td><td> Outil </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> Insérez Pins </td><td> Outil </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26007-02 et-03 </td><td></td></tr><tr><td> Boîte de culture à fond de verre avec 1,5 lamelle </td><td> Outil </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> Low Melt Agarose </td><td> Réactifs </td><td> Fisher </td><td> BP1360-100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaïne </td><td> Réactifs </td><td> Sigma </td><td> A-5040 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td> Microscope </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td> Microscope </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Fluorescent loupe binoculaire </td><td> Microscope </td><td> Olympus </td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning microscope confocal disque </td><td> Microscope </td><td> Nikon </td><td> Eclipse Ti </td><td> Muni d&#39;une tête Yokagawa disque en rotation </td></tr><tr><td> Caméra CCD </td><td> Caméra </td><td> Andor </td><td> DV-885-VP </td><td> 1002x1004x8 microns pixels carrés </td></tr></tbody></table>

live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish

L&#39;entretien homéostatique des tissus épithéliaux exige le retrait continu des cellules endommagées, sans perturber la fonction de barrière. Nos études ont montré que les cellules meurent envoyer des signaux à leurs voisins en direct à la forme et le contrat d&#39;un anneau d&#39;actine et la myosine qu&#39;elle éjecte hors de la feuille épithéliales lors de la fermeture des lacunes qui pourraient avoir résulté de sa sortie, un processus appelé extrusion 1 cellule. La clarté optique de développement du poisson zèbre offre un excellent système pour visualiser l&#39;extrusion dans la vie épithéliums. Nous décrivons ici une méthode pour induire et d&#39;extrusion d&#39;image dans l&#39;épiderme zebrafish larvaire. Pour visualiser l&#39;extrusion, nous injectons une sonde protéine fluorescente rouge étiqueté pour la F-actine dans des embryons stade unicellulaire poisson zèbre transgénique exprimant la protéine fluorescente verte dans l&#39;épiderme et induisent l&#39;apoptose par addition de G418 pour les larves. Nous utilisons ensuite imagerie time-lapse sur un microscope confocal à disque rotatif pour observer la dynamique de l&#39;actine et les comportements des cellules épithéliales au cours du processus d&#39;extrusion cellulaire par apoptose. Cette approche nous permet d&#39;étudier le processus d&#39;extrusion en direct épithéliums et fournira une avenue à étudier les états pathologiques causés par le défaut d&#39;éliminer les cellules apoptotiques.

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Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Cellules qui meurent sont extrudés à partir des tissus épithéliaux par la contraction concertée des cellules voisines, sans perturber la fonction de barrière. La clarté optique de développement du poisson zèbre offre un excellent système pour visualiser l&#39;extrusion dans la vie épithéliums. Nous décrivons ici les méthodes d&#39;induire et d&#39;extrusion d&#39;image dans l&#39;épiderme zebrafish larvaire à une résolution cellulaire.

Imagerie cellulaire en direct d&#39;extrusion de l&#39;épiderme du poisson zèbre développement

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.6K vues.  University of Utah. Cellules qui meurent sont extrudés à partir des tissus épithéliaux par la contraction concertée des cellules voisines, sans perturber la fonction de barrière. La clarté optique de développement du poisson zèbre offre un excellent système pour visualiser l'extrusion dans la vie épithéliums. Nous décrivons ici les méthodes d'induire et d'extrusion d'image dans l'épiderme zebrafish larvaire à une résolution cellulaire.

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

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Biologie

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection d&#39;organes sur le poisson zèbre pour adultes

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Préparation de développement et de l&#39;adulte Drosophile Cerveaux et la rétine d&#39;imagerie en temps réel

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Vivre imagerie cellulaire de l&#39;autophagie premiers événements: Omegasomes et au-delà

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.