Nous remercions le Dr Yijun Song, et les membres du Hattar Kuruvilla Zhao tri-laboratoire du Département de biologie, Université Johns Hopkins pour les conseils et l&#39;aide. Soutenu par des subventions du NIH et de DC007395 DC009946.

Partie 1. La configuration de l&#39;enregistrement EOG L&#39;appareil d&#39;enregistrement est constitué d&#39;une électrode d&#39;enregistrement, l&#39;électrode de référence, le tube de distribution d&#39;air, le stade de l&#39;échantillon, et d&#39;un microscope de dissection, tous ancrés sur une table d&#39;air dans une cage de Faraday. Micromanipulateurs sont utilisés pour le placement des électrodes et le tube d&#39;arrivée d&#39;air. Un courant d&#39;air continu est barboter dans l&#39;eau distillée pour ajouter de l&#39;humidité avant de passer par le tube d&#39;arrivée d&#39;air et plus l&#39;échantillon. Une boîte de culture de 60 mm rempli de Sylgard à une profondeur de 6-8 mm est utilisée comme une surface de montage pour l&#39;échantillon. Un puits et un canal sont creusées dans la Sylgard dans le plat de montage de fournir un moyen pour relier électriquement l&#39;électrode de référence au modèle via la solution de Ringer modifiée. L&#39;électrode d&#39;enregistrement et de l&#39;électrode de référence sont connectés à un amplificateur. Les signaux de l&#39;amplificateur sont envoyés à un numériseur, puis à un ordinateur. Des logiciels tels que Axograph ou pClamp peut être utilisé pour contrôler le protocole de stimulation, d&#39;enregistrer le signal, et pour une analyse ultérieure des réponses. Un oscilloscope relié après l&#39;amplificateur peut être pratique pour le suivi en temps réel du potentiel électrique en plaçant l&#39;électrode d&#39;enregistrement et pendant les enregistrements EOG. La livraison des stimuli olfactifs est contrôlé par un Picospritzer, qui est connecté à l&#39;ordinateur que celle utilisée pour l&#39;acquisition du signal. La pression d&#39;air à l&#39;Picospritzer est fixé à 10 psi. Un réservoir d&#39;air unique et régulateur peut être utilisé pour fournir de l&#39;air à la fois à la table de l&#39;air et l&#39;Picospritzer. Un réservoir d&#39;air seconde et régulateur est utilisé pour fournir de l&#39;air pour le flux d&#39;air humidifié, car cela nécessite une pression plus faible et une grande quantité d&#39;air. Juste avant de livrer un stimulus odorant, la sortie Picospritzer est connecté à une bouteille odorant. La bouteille odorant est ensuite relié au tube de refoulement d&#39;air. Partie 2: Préparation des électrodes L&#39;électrode d&#39;enregistrement est un fil d&#39;argent chloruré dans un verre tiré capillaire rempli de solution de Ringer modifiée (135 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 10 mM d&#39;HEPES, pH 7,4, stérilisée par filtration). L&#39;électrode de référence est un fil d&#39;argent chloruré. <ol><li> Installez fil d&#39;argent dans le porte-électrode. Pour l&#39;électrode d&#39;enregistrement, un à deux centimètres du câble doit dépasser de la fin du porte-électrodes. Plus de fil peut être laissé pour l&#39;électrode de référence. </li><li> Pour ajouter la couche d&#39;AgCl le fil d&#39;argent, la position du fil dans 0,1 M de NaCl et connectez le porte-électrode à la borne positive d&#39;une source de 1,5 à 9 V CC. La borne négative de la source d&#39;alimentation doit être connecté électriquement à la solution 0,1 M de NaCl. Laisser la réaction de chloration de procéder pendant 10 minutes. Pour égaliser toute charge statique entre l&#39;enregistrement et l&#39;électrode de référence, brièvement les électrodes ensemble avant de les installer sur l&#39;appareil d&#39;enregistrement. </li><li> Tirez un verre capillaire en utilisant un extracteur micropipette. L&#39;ouverture à l&#39;extrémité du capillaire doit être autour de 5-10 microns de diamètre. </li><li> Utilisez un crayon de diamant pour marquer et casser l&#39;extrémité émoussée du capillaire de sorte qu&#39;il est ~ 2 cm de plus que le fil d&#39;argent. Incendie-polonais à la fin couper avec la torche au butane. </li><li> Faire fondre de 0,5% d&#39;agarose dans une solution de Ringer modifiée. Tirez une petite quantité d&#39;agarose solution fondue dans la pointe de l&#39;électrode à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert. </li><li> Remplir le capillaire tiré environ 1 / 2 de la voie avec une solution de Ringer modifiée (une seringue qui a été chauffé et a tiré à avoir une fin longue et mince est utile à cet effet). Tapotez doucement la capillarité pour déloger les bulles d&#39;air. Magasin de l&#39;électrode dans le bocal rempli de stockage avec une petite quantité de solution de Ringer modifiée dans le bas jusqu&#39;à ce qu&#39;elles soient prêtes à être utilisées. Une fois un échantillon de tissu est préparé et prêt pour l&#39;enregistrement, l&#39;installation d&#39;un capillaire rempli sur le fil électrode d&#39;enregistrement. </li></ol> Partie 3: Préparation des solutions odorant L&#39;acétate d&#39;amyle et odorants heptaldéhyde évoquent des réponses et des grands choix sont donc de bonnes comme des stimulants de EOG. <ol><li> En microtubes, préparer une série de dilutions de substance odorante dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Comme point de départ d&#39;une courbe dose-réponse, préparer 10 dilutions de 5 m à 5 x 10 -6 M. Faire des dilutions fraîche chaque jour. </li><li> Diluer les odorants de 50 fois dans de l&#39;eau en mélangeant 100 uL d&#39;actions dilué dans du DMSO à 4,9 ml dans l&#39;eau 2 bouteilles avec des bouchons en silicone once. Laissez les solutions s&#39;équilibrer dans les bouteilles pendant au moins 30 minutes. Notez que la concentration de vapeur d&#39;odorants dans chaque bouteille est inconnue, mais peut varier en fonction de la concentration des molécules odorantes dans la phase liquide. </li><li> Insérez deux aiguilles de calibre 18 à travers le bouchon de silicone à pournir entrée et de sortie. Les ports devraient être branché lorsque la bouteille n&#39;est pas en usage. </li></ol> Partie 4: Enregistrement des données et l&#39;analyse de l&#39;EOG <ol><li> Sacrifice d&#39;une souris par le CO 2 d&#39;euthanasie ou d&#39;anesthésie surdose suivie par décapitation. Retirez la peau recouvrant le crâne et sagittalement coupent la tête le long de la ligne médiane. </li><li> Montez une moitié de la tête, côté médial le haut, sur le plat de montage. Retirer délicatement le septum pour exposer les cornets. </li><li> Placer le plat avec le tissu monté sur la scène d&#39;enregistrement. Aligner la scène pour que l&#39;emplacement d&#39;enregistrement sur les cornets est centré sous le microscope. </li><li> Mettez le réservoir d&#39;air pour fournir de l&#39;air humidifié à la surface du cornet. Placez le tube d&#39;alimentation d&#39;air de sorte qu&#39;il est d&#39;environ 10 mm de l&#39;emplacement d&#39;enregistrement. Le débit est de ~ 600 mL / min. </li><li> Régler l&#39;amplificateur à courant continu en mode (amplification AC va induire des artefacts dans le signal EOG) avec filtre passe-bas à 1 kHz, et le gain à 100x. </li><li> D&#39;enregistrement et de montage des électrodes de référence sur le micromanipulateurs. </li><li> Basse l&#39;électrode de référence dans le puits sur le plat de montage et couvrir avec une solution telle qu&#39;elle est relié électriquement au tissu modifiés Ringer. </li><li> Abaisser avec précaution l&#39;électrode d&#39;enregistrement sur la surface du cornet IIb ou III. L&#39;électrode doit à peine toucher la surface de l&#39;épithélium olfactif! Lorsque l&#39;électrode est en contact avec l&#39;épithélium (c&#39;est à dire un circuit électrique) d&#39;une ligne de base droite apparaîtra dans l&#39;oscilloscope. </li><li> Attacher un flacon odorant sur le port parallèle sur le tube d&#39;arrivée d&#39;air. </li><li> Sur l&#39;ordinateur, lancer un protocole de stimulation. Le taux d&#39;échantillonnage pour l&#39;acquisition de données devrait être de 2 kHz ou plus. Le logiciel va déclencher une impulsion odeur et commencer l&#39;enregistrement. </li><li> Un protocole de stimulation typique peut être une durée d&#39;impulsion de 100 ms unique, jumelé de 100 msec impulsions séparées par un intervalle de 1 seconde, ou une impulsion de 10 sec soutenue. </li><li> Laisser un peu de temps entre les protocoles de sorte que le tissu est peu adapté. Une minute suffit pour les concentrations de liquide de l&#39;acétate d&#39;amyle et heptaldéhyde jusqu&#39;à 10 -3 M; à des concentrations élevées permettre 5 minutes. Après avoir livré les concentrations de l&#39;odeur forte (comme à la fin d&#39;une courbe dose-réponse) d&#39;odeur résiduelle peut rester dans le tube. Laver le tube d&#39;air avec de l&#39;éthanol à 95% et sec avant de continuer avec des échantillons de tissus supplémentaires. </li><li> Axograph logiciel fournit des outils pour mesurer les principaux paramètres du signal EOG. Ces paramètres incluent l&#39;amplitude de la réponse, la latence, le temps de pointe, et des constantes de temps de résiliation. Il peut être souhaitable de filtrer numériquement les traces à 25 Hz, avant une analyse plus poussée. </li></ol> Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Paramètres pour EOG analyse. Plusieurs paramètres de l&#39;EOG sont particulièrement utiles pour la comparaison des réponses entre les souris, y compris l&#39;amplitude de la réponse, la latence (le temps entre le moment où le stimulus est administrée et la réponse commence), temps de montée (le temps entre le début de la réponse et la crête), le temps de pointe (le temps depuis le début de la stimulation à la pointe de la réponse), et la constante de temps de résiliation (τ, déterminées en ajustant la phase de décroissance de la réponse à une seule équation exponentielle ). Pour la comparaison des paramètres cinétiques tels que la latence, temps de montée, et la constante de temps de résiliation, il est conseillé de normaliser l&#39;amplitude du pic des réponses avant l&#39;analyse. <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Représentant EOG signaux sous différents protocoles de stimulation. (A) Exemples de EOGs d&#39;une souris en réponse à une stimulation par des concentrations croissantes de l&#39;acétate d&#39;amyle. La ligne noire en haut du panneau indique la date et la durée de la stimulation odorante. Les concentrations dans la légende sont les concentrations de la solution liquide. (B) Une relation dose-réponse en moyenne de cinq souris. Les barres d&#39;erreur sont les intervalles de confiance à 95%. Une baisse de l&#39;amplitude du pic est souvent observé à des concentrations d&#39;odeur très forte. (C) Un exemple d&#39;EOG en réponse à une stimulation double choc. Une seule impulsion courte odorant provoque l&#39;adaptation durables pendant plusieurs secondes. (D) Un exemple d&#39;EOG en réponse à un 10-sec de la stimulation odorante. L&#39;EOG montre désensibilisation lors de la présentation odorant continue.

<ol>
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I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+marker+protein+(OMP)+gene+deletion+causes+altered+physiological+activity+of+olfactory+sensory+neurons.">Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).</li><li>Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. 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D., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase+1C+is+dispensable+for+rapid+response+termination+of+olfactory+sensory+neurons.">Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons.</a> Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia.">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem Senses. 33, 839-859 (2008).</li><li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+"IP(3)-odors".">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors".</a> J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).</li><li>Pinato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroolfactogram+responses+from+organotypic+cultures+of+the+olfactory+epithelium+from+postnatal+mice.">Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice.</a> Chem Senses. 33, 397-404 (2008).</li><li>Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+distribution+of+rat+electroolfactogram.">Regional distribution of rat electroolfactogram.</a> J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).</li><li>Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+air+flow+on+rat+electroolfactogram.">Effects of air flow on rat electroolfactogram.</a> Chem Senses. 25, 761-768 (2000).</li></ol>

Les souris ont été traitées et euthanasié aux méthodes approuvées par le soin des animaux et des comités Utilisation de l&#39;Université Johns Hopkins.

Avec la configuration décrite dans ce protocole, les stimuli olfactifs à la surface de l&#39;épithélium olfactif sera compatible entre les préparations des tissus, permettant une comparaison entre le type sauvage et des souris mutantes, même si la concentration odorante exacte et la dynamique sont inconnus. Plusieurs facteurs, notamment l&#39;emplacement d&#39;enregistrement et le débit d&#39;air humidifié, provoquent des variations de l&#39;EOG. Il faut prendre soin d&#39;enregistrer à partir des positions similaires sur le même cornet pour minimiser les variations. Cela peut facilement être réalisée par le l&#39;enregistrement à partir du même côté de la tête et en gardant l&#39;empreinte du microscope, le tube de livraison odeur, et micromanipulateurs sur la table de l&#39;air stable entre des échantillons de tissus. En outre, des échantillons de tissus devraient être immédiatement placés dans le flux d&#39;air humidifié après la dissection afin d&#39;éviter un séchage excessif des tissus. Enregistrements EOG sur les souris peuvent également être réalisées avec un appareil de perfusion du liquide sur la souris préparées cornets 7, 14, 15, ou en laissant la tête intacte et l&#39;insertion de l&#39;électrode dans un petit trou percé au-dessus des 16 cornets, 17. Chaque variation de l&#39;enregistrement EOG a ses propres forces: air-phase des enregistrements sur des préparations de tissus tels que décrits dans ce protocole nécessite une quantité minime de configuration et sont plus faciles à mener, des enregistrements en utilisant un appareil de perfusion de liquide de faciliter l&#39;utilisation de réactifs pharmacologiques, bien que le nature hydrophobe des molécules odorantes de nombreux complique la livraison d&#39;odeur, enfin, les enregistrements dans lesquels la tête est laissée intacte peut être utilisé en «artificiel renifler» les expériences, même si le placement des électrodes est plus difficile que lorsque les cornets sont totalement exposés.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Air delivery tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom fabricated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute</td>
</tr>
<tr>
<td>Air table</td>
<td>equipment</td>
<td>Newport</td>
<td>LW3030B-OPT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>equipment</td>
<td>Warner</td>
<td>DP-301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer and Data Acquisition Software</td>
<td>equipment</td>
<td>Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/.</td>
</tr>
<tr>
<td>Butane torch</td>
<td>equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A cr&egrave;me br&ucirc;l&egrave;e torch works well</td>
</tr>
<tr>
<td>Digitizer</td>
<td>equipment</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Scope</td>
<td>equipment</td>
<td>Scienscope</td>
<td>SSZ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrode holder</td>
<td>equipment</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>64-1021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Holding Devices (12 mm)</td>
<td>equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>M10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulators</td>
<td>equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>M3301R M3301L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>equipment</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oscilloscope</td>
<td>equipment</td>
<td>Tektronix </td>
<td>5110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer III</td>
<td>equipment</td>
<td>Parker Instrumentation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone tubing</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalge Nunc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Specimen stage</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom fabricated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay.</td>
</tr>
<tr>
<td>18 gage needles</td>
<td>material</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>305195</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 oz. glass bottles</td>
<td>material</td>
<td>VWR International</td>
<td>16152-201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass capillaries</td>
<td>material</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW150F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone stoppers size 16D</td>
<td>material</td>
<td>Chemware</td>
<td>D1069809</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silver wire</td>
<td>material</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>AGW1010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SylGuard 184</td>
<td>material</td>
<td>Dow Corning </td>
<td>SYLG184</td>
<td>From World Precision Instruments</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amyl acetate</td>
<td>reagent</td>
<td>Aldrich</td>
<td>W504009</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-1016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5879</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heptaldehyde</td>
<td>reagent</td>
<td>Aldrich</td>
<td>H2120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9272</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
<td>reagent</td>
<td>JT Baker</td>
<td>3624-05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>flowmeter</td>
<td>equipment</td>
<td>Gilmont</td>
<td>GF-2260</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording

Animaux dépendent pour beaucoup sur l&#39;olfaction comportements critiques, telles que trouver des sources de nourriture, éviter les prédateurs, et l&#39;identification des congénères pour l&#39;accouplement et autres interactions sociales. Le electroolfactogram (EOG) est une méthode d&#39;enregistrement informatif, facile à conduire, fiable et à la fonction olfactive de dosage au niveau de l&#39;épithélium olfactif. Depuis la description de 1956 de l&#39;EOG par Ottoson de grenouilles 1, l&#39;enregistrement EOG a été appliquée dans de nombreux vertébrés, y compris les salamandres, les lapins, les rats, les souris et les humains (revu par Scott et Scott-Johnson, 2002, réf. 2). Les récents progrès dans la modification génétique sur les souris ont ravivé l&#39;intérêt pour l&#39;enregistrement de la EOG pour la caractérisation physiologique de la fonction olfactive de knock-out et souris knock-in. Enregistrements EOG ont été appliquées avec succès à démontrer le rôle central des composants olfactifs transduction du signal 3-8, et plus récemment pour caractériser la contribution de certains mécanismes de réglementation pour les réponses OSN 9-12. Détection Odorant produit à la surface de l&#39;épithélium olfactif sur les cils des ARS, où une cascade de transduction du signal conduit à l&#39;ouverture de canaux ioniques, générant un courant qui circule dans les cils et dépolarise la membrane 13. L&#39;EOG est le potentiel négatif enregistré extracellulaire à la surface de l&#39;épithélium olfactif lors de la stimulation odorante, résultant d&#39;une sommation des changements potentiels causés par les différents réactifs ARS dans le domaine de l&#39;enregistrement 2. Comparaison de l&#39;amplitude et la cinétique de l&#39;EOG donc fournir de précieuses informations sur la façon dont la modification génétique et d&#39;autres manipulations expérimentales influencent la signalisation moléculaire sous-jacente de la réponse aux odeurs OSN. Nous décrivons ici un enregistrement EOG air de phase sur une préparation de cornets de souris olfactif. Brièvement, après avoir sacrifié la souris, les cornets olfactifs sont exposés par la bissectrice de la tête le long de la ligne médiane et en enlevant la cloison. La préparation du cornet est ensuite placé dans la configuration de l&#39;enregistrement, et une électrode d&#39;enregistrement est placé à la surface de l&#39;épithélium olfactif sur l&#39;un des cornets médial. Une électrode de référence est relié électriquement à travers le tissu d&#39;une solution tampon. Un flux continu de l&#39;air humidifié est soufflé sur la surface de l&#39;épithélium pour le garder humide. La vapeur de solutions odorisant est soufflé dans le flux d&#39;air humidifié pour stimuler l&#39;épithélium. Les réponses sont enregistrées et numérisées pour une analyse ultérieure.

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Le electroolfactogram (EOG) l&#39;enregistrement est une instructive, facile à réaliser et fiable d&#39;évaluer la fonction olfactive au niveau de l&#39;épithélium olfactif. Ce protocole décrit une configuration d&#39;enregistrement, de préparation des tissus de la souris, la collecte de données et d&#39;analyse des données de base.

Réponses Analyse des souris neurones sensoriels olfactifs Utilisation de l&#39;enregistrement Electroolfactogram Air-phase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.4K vues.  Johns Hopkins University. Le electroolfactogram (EOG) l'enregistrement est une instructive, facile à réaliser et fiable d'évaluer la fonction olfactive au niveau de l'épithélium olfactif. Ce protocole décrit une configuration d'enregistrement, de préparation des tissus de la souris, la collecte de données et d'analyse des données de base.

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Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Recherche

Neurosciences

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Photolyse des composés en cage dans les cils olfactifs des neurones sensoriels

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorant induites réponses enregistrées à partir de neurones récepteurs olfactifs en utilisant la technique de la pipette d&#39;aspiration

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Intracellulaire enregistrement, le mappage des champs sensorielle, et la culture de neurones identifiés dans le Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Enregistrement Light-réponses évoquées dans les neurones post-synaptiques dans Dark-adaptés, Préparations rétine de la souris tranche en utilisant des techniques de patch clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforé patch-clamp enregistrement des souris neurones sensoriels olfactifs dans neuroépithélium Intact: Analyse fonctionnelle des neurones exprimant un récepteur odorant Identifié

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Utilisation Sensillum simple enregistrement pour détecter les réponses olfactive Neuron des punaises de lit à écomones

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Comportements olfactifs dosées par Tracking Computer Of<em&gt; Drosophila</em&gt; Dans un Olfactométre quatre quadrants

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Immunomarquage quadruple de l&#39;ampoule olfactive pour la visualisation des codes d&#39;identité moléculaire des axes sensoriels olfactifs

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...