Il s’agit de la méthode la plus robuste et la plus sensible pour évaluer la sensibilité olfactive chez les poissons marins, car elle enregistre un signal purement sensoriel avant tout traitement par le SNC. Les principaux avantages de cette technique sont sa sensibilité et qu’elle peut être facilement transférée à une espèce différente d’un environnement différent indépendamment de la salinité externe. Pour préparer l’eau de contrôle, recueillir un litre d’eau de mer filtrée au charbon de bois et utiliser une sonde pH pour vérifier le pH.
Le pH devrait être d’environ 8,2. Si ce n’est pas le cas, faire bouillonner l’eau de mer avec l’air atmosphérique jusqu’à ce qu’un pH de 8,2 soit atteint. Ensuite, utilisez un titrateur d’alcalinité pour mesurer l’alcalinité de l’eau, puis mesurez la température et la salinité de l’eau.
Pour préparer l’eau à haute teneur en dioxyde de carbone, filtrer un litre d’eau de mer à travers des filtres à charbon inactivés aux particules avant de bouillonner de dioxyde de carbone jusqu’à ce que le pH désiré soit atteint. Utilisez une sonde de pH pour vérifier le pH, qui devrait être d’environ 7,7, puis utilisez un titrateur d’alcalinité pour mesurer l’alcalinité de l’eau et mesurer la température et la salinité de l’eau. Pour déterminer la pression de dioxyde de carbone dans l’eau de contrôle et de dioxyde de carbone élevée, ouvrez un logiciel conçu pour calculer les paramètres de dioxyde de carbone dans l’eau et ajouter la salinité de l’eau, la température, la pression, l’alcalinité totale et les valeurs de pH dans la fenêtre d’entrée.
Sélectionnez ensuite les constantes, les échelles et les unités, et cliquez sur le processus pour déterminer la pression de dioxyde de carbone. Après avoir confirmé un niveau approprié de sedation par un manque de réponse au pincement de la queue, placez le poisson anesthésié sur un support de coussin personnalisé pour le modèle et placez un tube de silicium de taille appropriée dans la bouche du poisson. Le tube est relié à une pompe submersible et un réservoir d’anesthésique contenant de l’eau de mer aérée et de l’eau est pompé sur les branchies à une vitesse d’environ 100 millilitres par minute par kilogramme.
Ensuite, insérez une goupille de terre dans le muscle du flanc et connectez la goupille à l’étage de tête de l’amplificateur. Couvrez le poisson d’un chiffon humide avec seulement la tête exposée et placez le tube avec le système de livraison de stimulus dans la narine. Pour exposer les nerfs olfactifs, utilisez une perceuse et un microscope disséquant pour enlever la peau et l’os du crâne entre les yeux.
Lors de l’utilisation d’une daurade, utilisez une scie circulaire pour enlever la partie du crâne immédiatement au-dessus des yeux pour juste postérieur aux yeux et utiliser la perceuse pour enlever l’os entre les yeux. Une fois que suffisamment d’os a été dégagé, utilisez des forceps fins pour enlever la graisse et le tissu conjonctif qui survolent les nerfs olfactifs sans endommager les nerfs ou les vaisseaux. Nettoyez les électrodes avant de les utiliser en les connectant au pôle négatif d’une source dc de trois volts et en plaçant la pointe dans la solution saline physiologique pendant 20 à 30 secondes.
Un flux régulier de petites bulles doit être vu venant de la pointe. Connectez les électrodes de tungstène enduites de parylène à l’étape principale d’un préamplificateur ac à courant alternatif. Une fois que les nerfs olfactifs ont été exposés, utilisez des micro-manipulateurs pour insérer les électrodes dans le nerf olfactif approprié dans une position qui donne une réponse maximale à la norme et une réponse minimale au vide.
À condition que la dissection se soit bien passée, l’étape critique consiste à mettre les électrodes dans la bonne position. Cela peut prendre du temps et implique un certain degré d’essais et d’erreurs. Pour obtenir des lectures électrophysiologiques, utilisez une valve à trois sens actionnée par le solenoïde pour mettre en place un système de distribution de stimulus pour permettre le passage rapide de l’eau de fond propre au stimulus contenant de l’eau et relier la prise commune au tube transportant de l’eau à la rosette olfactive.
Placez une ligne dans l’eau de mer de fond et l’autre dans la solution d’essai. Connectez le conducteur de la vanne à la gâchette d’un convertisseur numérique analogique et configurez le logiciel pour commencer à enregistrer lors de l’événement déclencheur et pour continuer pendant une période prédéterminée. Pour vérifier la stabilité de la préparation, enregistrez et mesurez à plusieurs reprises l’amplitude de la réponse intégrée à plusieurs reprises avec la norme permettant à une minute de s’écouler entre les stimuli successifs.
Ensuite, enregistrez les réponses nerveuses olfactives aux acides aminés dans le contrôle de l’eau de mer, et laissez une minute s’écouler entre les stimuli successifs, puis enregistrez la réponse à une fois 10 à la sérine molaire négative troisième dans une solution de contrôle blanc de l’eau. Enregistrez ensuite les réactions nerveuses olfactives aux acides aminés dans l’eau de mer à haute teneur en dioxyde de carbone. La réponse à une solution blanche d’eau à haute teneur en dioxyde de carbone et la réponse à une fois 10 à la troisième sérine molaire négative dans une solution vide d’eau de contrôle.
Ici, des réponses typiques aux stimulus positifs et négatifs de commande enregistrés du nerf olfactif d’une daurade sont montrées. Dans environ une seconde de l’application de stimulus, une augmentation rapide de l’activité peut être observée suivie d’une période d’adaptation pendant que le stimulus est toujours présent et un retour à l’activité de base une fois que le stimulus a pris fin. En revanche, un stimulus blanc évoque peu ou pas de réponse.
Dans cette courbe typique de réponse à la concentration, on peut observer que l’augmentation des concentrations d’un odorant peut évoquer des augmentations de plus en plus importantes de l’activité et donc l’amplitude des réponses intégrées. Le traçage des données normalisées et la régression linéaire correspondante permettent d’estimer le seuil de détection des réponses de concentration de chaque animal ou d’un groupe d’animaux. Les courbes de réponse de concentration sigmoïde peuvent être tracées semi-logarithmically, permettant le calcul de la concentration d’odorant qui évoque à la réponse maximale de 50%.
Il est important de garder le poisson aussi sain que possible. Par exemple, assurez-vous que les branchies sont adéquatement irriguées et que l’épithélium olfactif est maintenu humide pendant l’enregistrement. Un de nos objectifs est de tracer les voies neuronales dans le cerveau à l’endroit où l’information sensorielle est relayée.
