Ce travail a été soutenu par le &quot;Agence Nationale de la Recherche&quot; ANR-09-JCJC-0117-01 et &quot;Neuropôle de Recherche Francilien-NERF&quot; subvention pour Romain Chery. Nous remercions Françoise Lefebvre pour le développement de logiciels en C + + / Qt, et Laurent Pinot et Batiste Janvier pour aider à l&#39;élaboration de la configuration de l&#39;imagerie optique.

1. Préparer l&#39;animal pour l&#39;imagerie (en conformité avec les recommandations européennes pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire, la directive 86/609/CEE) <ol><li> 6 à 8 semaines vieilles souris mâles C57BL6 sont anesthésiés avec un cocktail de kétamine (10mg/kg) et de xylazine (100mg/kg) injecté par voie intrapéritonéale. Chirurgie commence lorsque la souris ne répond plus aux pattes arrière de pincement. Pendant toute l&#39;expérience de l&#39;animal est placé sur un coussin chauffant. La température du corps est constamment surveillée et maintenue à 37 ° C. Profondeur de l&#39;anesthésie est maintenue pendant toute la chirurgie et la session d&#39;imagerie en vérifiant l&#39;absence d&#39;un membre retirer. Une injection sous-cutanée de 20% du cocktail initiales anesthésique est administré autrement. </li><li> En utilisant tondeuses, enlever les poils du cuir chevelu. Nettoyer la peau exposée à partir de cheveux résiduelles en utilisant une gaze stérile imbibée de sérum physiologique. </li><li> Placez la souris dans le cadre stéréotaxique. Le museau doit être dans le même plan que le dos de la tête,afin de définir la surface du bulbe olfactif à l&#39;horizontale. Fixez solidement l&#39;oreille et le nez bars afin d&#39;empêcher les mouvements pendant l&#39;imagerie. </li><li> Appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux de l&#39;animal pour éviter le dessèchement et la douleur. </li><li> Désinfecter tous les instruments chirurgicaux avec l&#39;éthanol 70 ° et la zone du cuir chevelu avec des balayages successifs du bétadine. </li><li> Pour enlever la peau qui recouvre le crâne, commencez par faire une incision dans la peau avec des ciseaux à l&#39;arrière de la tête entre les oreilles. Ensuite, couper dans les deux côtés vers la base de l&#39;oreille et dans le sens antéropostérieur vers le front le long de la paupière. Terminer enlever le cuir chevelu en coupant la peau sur le dessus du museau à proximité de la barre de nez. </li><li> Sous observation binoculaire, utilisez un coton-tige imbibé de sérum physiologique pour détachez le périoste sur le sommet du crâne. Utilisez une pince pour enlever le tissu restant et racler la surface du crâne avec un scalpel pour avoir une préparation propre. </li><li>L&#39;OB est une structure symétrique composé de deux hemibulbs qui sont situés entre les paupières. Elles sont limitées dans la rostrale et dans la direction caudale par un sinus veineux, et séparés par la suture sagittale. Placez un morceau d&#39;éponge imbibée de gélatine absorbable eau distillée sur l&#39;os au-dessus de l&#39;OB. Il est important de garder cette zone de l&#39;os humide toute l&#39;expérience. </li></ol> 2. Préparer la fenêtre crânienne <ol><li> Retirez l&#39;éponge de gélatine et de commencer en grattant doucement l&#39;os avec le n ° 10 lame de bistouri. Gardez un angle constant de 45 ° entre la lame et l&#39;os, et déplacer la lame de la paupière vers le côté sagittale de la zone de l&#39;ampoule. Ne pas appliquer une pression verticale sur l&#39;os ou de gratter l&#39;os au-dessus du sinus veineux. </li><li> Pendant le processus d&#39;amincissement, arrêter tous les 5min et le lieu d&#39;une éponge de gélatine hydratée sur l&#39;os pour refroidir la préparation. Swab le crâne avec l&#39;éponge pour enlever la poussière d&#39;os. </li><li> Gardez le balayage etde refroidissement bien jusqu&#39;à la visualisation des travées, la couche d&#39;os spongieux. La vascularisation fine de l&#39;OB doit être visible à ce stade. Arrêtez gratter l&#39;os, et commencer à utiliser la pointe du bistouri perpendiculairement à &quot;dessiner&quot; une zone rectangulaire entourant l&#39;OB. A ce stade, n ° 11 lame de bistouri peut être utilisé. Gardez la chirurgie dans les limites des sinus veineux qui doit être sûre de tout coup de scalpel. </li><li> Creusez la tranchée progressivement formé rectangulaires en utilisant mouvements successifs du scalpel. Essuyer l&#39;embout du scalpel périodiquement pour le nettoyer et de le garder coupants. Soyez très prudent de la profondeur de la pointe pour éviter de toucher la surface dure-mère. </li><li> Afin d&#39;obtenir un sens de l&#39;épaisseur de l&#39;os restant, poussez-le délicatement avec la pointe d&#39;une paire de pinces. Si les plis volet osseux sous pression, passer à l&#39;étape suivante. </li><li> En vertu d&#39;une goutte de solution saline, utilisez la pointe de l&#39;orientées horizontalement pour bistouri soulever le volet osseux. La suppression de la trappe qui doit être fait carefully pour éviter de déchirer l&#39;os restant. </li><li> Une fois la surface de l&#39;OB est exposée, de vérifier l&#39;absence de tout saignement ou les vaisseaux sanguins anastomose. Blesser les-mère ou la surface du tissu permettra de réduire les chances d&#39;obtenir des signaux optiques. Essuyez la zone avec une éponge de gélatine trempées dans une solution saline, afin de conserver l&#39;humidité ampoule. </li><li> Appliquer polyacrylate ciment dentaire pour former un puits sur l&#39;os autour de la fenêtre. </li><li> Déposer une goutte de bas point de fusion d&#39;agarose (1,2%) au cours de la dure-mère, et mettre un couvercle en verre stérile à la dimension de la fenêtre. Lors de la séance d&#39;imagerie, une petite quantité d&#39;agarose peuvent être ajoutées afin de compenser le dessèchement. Agarose permettra d&#39;éviter l&#39;OB de se déplacer avec la respiration et offrira une surface plane pour l&#39;imagerie optique. </li></ol> 3. L&#39;imagerie optique de configuration pour la cartographie de l&#39;activité olfactive <ol><li> La stimulation olfactive doit être précisément définie dans le temps et l&#39;intensité de l&#39;utilisation d&#39;un olfactomètre. Nous utilisons une version modifiée de coutume MultiVial perfusion du système Valvebank 8II d&#39;automatiser scientifique associée à une base compresseur d&#39;air (air comprimé respirable serait adapté aussi bien). Ce système permet un contrôle précis et rapide de soupape externe. Les solutions de pures odorantes sont diluées dans une huile minérale à la concentration choisie. Pour activer les aldéhydes dorsale OB tels que l&#39;hexanal sont couramment utilisés. Un volume précis de l&#39;odorant dilué (20 à 50 pl) est chargé sur un papier filtre et placés dans un réservoir seringue. Grâce au système de perfusion, la pression atmosphérique contrôlé est livré pour le système, assurant un taux constant de livraison odorisé flux d&#39;air dans le nez des animaux lors de l&#39;ouverture de la vanne. Odorant est livrée à travers un tube Tygon R-3603 Vacuum (Saint-Gobain Corporation) portant l&#39;air à un débit de ~ 1000ml/min. Éviter la contamination entre les molécules odorantes et les quantités résiduelles de odorisant dans le tube. Si disponible, la reproductibilité de la stimulation odorante peut être controlled par l&#39;utilisation d&#39;un détecteur à ionisation de flamme (2020 microFID Photovac). </li><li> La configuration optique est allumée. Il se compose d&#39;un refroidissement entrelacé 12 bits caméra CCD (ORCA AG Hamamatsu) associé à un stéréomicroscope à fluorescence (Leica MZ16), un olfactomètre contrôlé par ordinateur et des lampes d&#39;excitation appropriée stabilisé avec des filtres d&#39;interférence bande passante. Un schéma décrivant notre configuration est fournie dans la figure 2. Pour intrinsèque signaux d&#39;imagerie optique (IOSI), une lampe au tungstène 200W halogène (QTH Oriel) couplé à un anneau de fibre légère (Schott) branchée sur l&#39;objectif du microscope sont utilisés pour fournir un éclairage stable et homogène. Pour flavoprotéine Signaux Autofluorescence Imaging (FASI), une lampe aux halogénures métalliques 150W (Leica) avec un guide de lumière noyau liquide 5mm fournir même une excitation localisée de la fluorescence par le port épi-illumination du stéréomicroscope. L&#39;acquisition des images et la synchronisation du matériel sont réalisés par un logiciel personnalisé. Le s ouvrirOurce logiciels microgestionnaire peut également être utilisé pour contrôler la configuration optique et d&#39;acquisition. </li></ol> 4. L&#39;imagerie optique <ol><li> Placez le cadre stéréotaxique sous la loupe binoculaire, la fenêtre crânienne centré dans le champ de vue (voir Fig. 2A pour un schéma du montage optique). </li><li> Tune au microscope pour se concentrer sur les capillaires. Avant les essais de stimulation (voir description en 5) une image de l&#39;ampoule est prise en vertu de 560nm (vert) (anneau de fibre) qui fournit un bon contraste pour l&#39;imagerie des vaisseaux sanguins. Cette image est utilisée comme un contrôle anatomique de vérifier l&#39;état de la préparation et est acquis à plusieurs reprises pendant l&#39;expérience. </li><li> Pour IOS imagerie, reflète l&#39;intensité lumineuse est enregistrée par la caméra CCD en 630 + / -10 nm (rouge) d&#39;illumination. Les images sont acquises à l&#39;image complète (pas de binning) à 5 images par seconde qui correspond à un temps d&#39;exposition d&#39;environ 150ms. Puissance de la source lumineuse est ajustée à nouveau<html> haque niveaux de gris d&#39;au moins ~ 3000 sur la zone OB, proche de la saturation des puits CCD pixels. Cela permet de profiter de la dynamique du CCD 12bits pour saisir les changements d&#39;intensité légère pendant l&#39;activation. Maximum amplitudes IOS atteindre ~ 1%. </li><li> Pour le SAF imagerie de fluorescence est acquis en vertu d&#39;excitation de 480nm + /-20nm (bleu) de lumière epiflurorescence. Un filtre passe-haut à 515nm est mis en place pour capter la lumière. Les images sont acquises à 5 images par seconde avec un binning de 4 par 4 pour maximiser la sensibilité. Puissance lumineuse d&#39;excitation est ajusté similaire à IOS avec des niveaux de gris de 3000 sur la zone OB. Maximum amplitudes SAF atteindre ~ 3%. Pour les deux modalités d&#39;imagerie, la profondeur de champ dans le plan du sujet est le même et a été mesurée à 0,5 mm pour un grossissement d&#39;environ 4 fois. </li><li> La lumière doit être éteinte entre les essais d&#39;imagerie afin d&#39;éviter le chauffage et photoblanchiment de la préparation. </li></ol>Le &quot;&gt; 5. Imaging essais <ol><li> Norme session d&#39;imagerie comprenait une base de 5 à 10s où l&#39;air est livrée seule, suivie par la stimulation des odeurs pour 3 à 10s selon la concentration d&#39;odeur choisi, et de 70 à 82S sont encore enregistrés avec un débit d&#39;air constant pour la récupération de base (fig. 2A). A la fin du procès, la lumière est éteinte et l&#39;air pur est livré pour la durée de l&#39;intervalle entre essais (1 à 3 minutes) pour laver les molécules d&#39;odeur résiduelle et éviter l&#39;accoutumance sensorielle. Essais d&#39;odeurs ont été intercalées avec des essais en blanc (livraison par avion). </li><li> Odeur évoqués zones activées sont visualisés comme des zones grossièrement sphérique sur les cartes et correspondent à la taille de l&#39;individu glomérules (80 à 200μm de diamètre 9). Traitement de l&#39;image est expliqué dans la figure 2B. Cartes olfactives sont présentés dans la figure 3. Contrairement à tout autre système sensoriel, le rapport signal-bruit dans l&#39;OB a été suffisant pour résoudre les odeurs réponses évoquées dans les essais simples (Fig. 3B pour IOS et Fig. 3D pour le SAF). </li><li> Les souris sont euthanasiés immédiatement à la fin de la séance d&#39;imagerie utilisant des méthodes conformes aux recommandations européennes pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs (voir les cartes olfactives dans la figure 3): <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig1.jpg" /> Figure 1 organisation structurelle de l&#39;ampoule olfactif principal chez les rongeurs. Neurones sensoriels olfactifs, des cellules primaires sensoriels situés dans l&#39;épithélium olfactif principal, expriment le récepteur odorant mêmes et convergent sur le même glomérule dans l&#39;OB. Glomérules olfactifs, les neuropils de forme ronde (cercles pointillés), sont situés à la surface de l&#39;OB. Notez que d&#39;un réseau très dense et complexe vasculaire est présente au niveau glomérulaire. Abréviations (haut / bas): ONL: Couche nerf olfactif; GL: couche glomérulaire, la LPE: couche externe plexiforme; MCL:couche de cellules mitrales; GCL: couche de cellules granulaires. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig2.jpg" /> Figure 2 réflectance et l&#39;enregistrement des signaux de fluorescence in vivo. A. grand champ de configuration d&#39;imagerie optique. Le cerveau d&#39;une souris anesthésiée est exposé à deux rouges (IOS) ou bleu (SAF) soit la lumière à travers un anneau de fibre annulaire fixé à l&#39;objectif optique ou d&#39;un port épi-illumination d&#39;un microscope. Les odeurs sont chargés dans des flacons scellés et odorisé l&#39;air est livré au nez des animaux (vert clair: ouvrir la vanne). B. Enregistrement du protocole et de traitement des données. IOS et le SAF sont enregistrées sous forme de séries d&#39;essais individuels (d&#39;une durée de 90s). Le diagramme montre le scénario d&#39;un seul essai: de base varie de 5 à 10s, la stimulation de 3 à 10s, et le retour à la normale de 70 à 82S. Traitement de l&#39;image nécessite pixel par pixel soustraction des valeurs d&#39;intensité durant la référence pour les valeurs d&#39;intensité pendant les périodes de stimulation (pour SAF) oR Plus de stimulation retour au départ (pour IOS). Cette différence est ensuite divisée par des valeurs de base pour obtenir une variation en% (voir les images résultant de la Fig. 3). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig3.jpg" /> Figure 3 Odeur évoqués cartes d&#39;activité dans l&#39;OB à l&#39;aide d&#39;IOS et FAS imagerie. A. Vasculature de la dorsale OB visualisées sous lumière verte. Colombie-Britannique. IOS imagé (seul essai contre trois essais en moyenne respectivement) pour une présentation de l&#39;hexanal 10s 20%. Les flèches blanches indiquent les régions sphériques d&#39;intérêt activé par cette odeur. Ces cartes d&#39;activation ont été obtenus en utilisant les cadres en moyenne pendant la première seconde après la fin de la stimulation d&#39;odeurs (maximum de variation de réflectance -0,63% en A et -0,52% en B). Notez les zones noires de l&#39;absorbance, où l&#39;odeur d&#39;activation a eu lieu. CD-ROM. SAF acquise séquentiellement dans la même souris pour l&#39;odorant même (seul essai contre trois essais en moyenne respectiveLy). Ces cartes d&#39;activation ont été obtenus en utilisant les cadres en moyenne pendant la première seconde après le début de la stimulation d&#39;odeurs (maximum de variation 0,72% en fluorescence D et 0,66% en E). Notez que les zones blanches de l&#39;émission de l&#39;autofluorescence indiquées par des flèches noires correspondent aux zones noires dans l&#39;IOS. L&#39;aspect granuleux vu dans la carte SAF est due à la 4 par 4 binning requis pour l&#39;amélioration de la sensibilité. SAF images n&#39;ont pas été corrigées à partir autofluorescence de blanchiment. Les dimensions réelles des images BE: 0,7 mm de large x 1,2 mm de long.

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	<li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals.">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li><li>Rubin, B. D., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+odorant+representations+in+the+mammalian+olfactory+bulb.">Optical imaging of odorant representations in the mammalian olfactory bulb.</a> Neuron. 23, 499-511 (1999).</li><li>Chance, B., Cohen, P., J&amp;246, b. s. i. s., &amp;amp, F., Schoener, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+oxidation-reduction+states+in+vivo.">Intracellular oxidation-reduction states in vivo.</a> Science. 137, 499-508 (1962).</li><li>Shibuki, K., Hishida, R., Murakami, H., Kudoh, M., Kawaguchi, T., Watanabe, M., Watanabe, S., Kouuchi, T., Tanaka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+somatosensory+cortical+activity+in+the+rat+visualized+by+flavoprotein+autofluorescence.">Dynamic imaging of somatosensory cortical activity in the rat visualized by flavoprotein autofluorescence.</a> J. Physiol. 549 (Pt. 3, 919-9127 (2003).</li><li>Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+maps+in+the+mammalian+olfactory+bulb:+domain+organization+and+odorant+structural+features.">Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features.</a> Nat. Neurosci. 3, 1035-1043 (2000).</li><li>Gurden, H., Uchida, N., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory-evoked+intrinsic+optical+signals+in+the+olfactory+bulb+are+coupled+to+glutamate+release+and+uptake.">Sensory-evoked intrinsic optical signals in the olfactory bulb are coupled to glutamate release and uptake.</a> Neuron. 52, 335-345 (2006).</li><li>Soucy, E. R., Albeanu, D. F., Fantana, A. L., Murthy, V. N., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+diversity+in+an+odor+map+on+the+olfactory+bulb.">Precision and diversity in an odor map on the olfactory bulb.</a> Nat. Neurosci. 12, 210-220 (2009).</li><li>Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+functional+architecture+and+local+coupling+between+neuronal+activity+and+the+microcirculation+revealed+by+in+vivo+high-resolution+optical+imaging+of+intrinsic+signals.">Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6082-6086 (1990).</li><li>Meister, M., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+and+topography+in+an+odor+map+on+the+rat+olfactory+bulb.">Tuning and topography in an odor map on the rat olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 21, 1351-1360 (2001).</li><li>Dunn, A. K., Devor, A., Bolay, H., Andermann, M. L., Moskowitz, M. A., Dale, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+total+cerebral+hemoglobin+concentration,+oxygenation,+and+blood+flow+during+functional+activation.">Simultaneous imaging of total cerebral hemoglobin concentration, oxygenation, and blood flow during functional activation.</a> Opt. Lett. 28, 28-30 (2003).</li><li>L'Heureux, B., Gurden, H., Pain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+imaging+of+NADH+and+flavoproteins+in+the+rat+brain:+insights+from+Monte+Carlo+simulations.">Autofluorescence imaging of NADH and flavoproteins in the rat brain: insights from Monte Carlo simulations.</a> Optics. Express. 17, 9477-9490 (2009).</li><li>Renaud, R., Gurden, H., Chery, R., Bendhamane, M., Martin, C., Pain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+the+olfactory+bulb+activation:+influence+of+realistic+differential+pathlength+correction+factors+on+the+derivation+of+oxygenation+and+total+hemoglobin+concentration+maps+(Proceedings+Paper).">Multispectral imaging of the olfactory bulb activation: influence of realistic differential pathlength correction factors on the derivation of oxygenation and total hemoglobin concentration maps (Proceedings Paper).</a> , (2011).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

Dans cet article nous présentons IOS et le SAF techniques d&#39;imagerie pour enregistrements in vivo des odeurs évoquées activités dans l&#39;OB de la souris. Pour atteindre cet objectif est relativement simple et abordable à large champ de configuration d&#39;imagerie optique est nécessaire. L&#39;acquisition de l&#39;imagerie de données nécessite une formation pour effectuer les procédures chirurgicales fines et éviter tout dommage causé à la mère ou le tissu cérébral. En particulier, les saignements majeurs seront enregistrées absorbent les photons pour l&#39;imagerie et finissent par l&#39;expérience. Un des avantages de l&#39;IOS et FAS imagerie est d&#39;éviter l&#39;injection de traceurs fluorescents qui pourraient entraîner une toxicité cellulaire ou des effets secondaires indésirables. Elles permettent d&#39;aborder des questions au sujet des cartes olfactives ainsi codage spatial des stimuli sensoriels. Contrairement à l&#39;imagerie 2-désoxyglucose, ils offrent la possibilité aux odeurs d&#39;image de plusieurs dans un seul animal. Toutefois, depuis la pénétration des photons est limitée dans le tissu, IOS et le SAF sont limités à la partie dorsale de l&#39;OBet ne peuvent pas être enregistrés à partir des régions ventrales. Endogènes imagerie signal optique offre une excellente résolution spatiale pour l&#39;imagerie in vivo. Technique des calculs améliorations concernent quantitative des composants vasculaires dans la réflexion des signaux 8,9 ainsi que la dynamique de l&#39;oxygénation du sang et du volume lors de l&#39;activation sensorielle 10. Imagerie Multiwavelength des approches d&#39;imagerie IOS sont actuellement développés dans notre laboratoire pour quantifier pleinement la concentration d&#39;hémoglobine totale et l&#39;oxygénation de l&#39;OB lors de l&#39;activation sensorielle. Ces mesures spectroscopiques optiques ajouté au SAF imagerie donnera l&#39;occasion de répondre à la relation non résolus entre la dynamique vasculaire et intracellulaires lors de l&#39;activation sensorielle 11,12.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du Régent </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Imalgène </td><td> Merial </td><td></td></tr><tr><td> Rompun </td><td> Bayer </td><td></td></tr><tr><td> Agarose, de type III-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9793-50G </td></tr><tr><td> Hexanal 98% </td><td> Aldrich </td><td> 115 606-100ml </td></tr></tbody></table>

imaging odor-evoked activities in the mouse olfactory bulb using optical reflectance and autofluorescence signals

Dans le cerveau, la stimulation sensorielle active des populations de neurones distribués parmi les modules fonctionnels qui participent à la codification du stimulus. Fonctionnelle des techniques d&#39;imagerie optique sont avantageux pour visualiser l&#39;activation de ces modules dans cortex sensoriels à haute résolution spatiale. Dans ce contexte, endogènes signaux optiques qui découlent de mécanismes moléculaires liés à neuroénergétique sont de précieuses sources de contraste d&#39;enregistrer des cartes spatiales des stimuli sensoriels plus larges champs dans le cerveau des rongeurs. Ici, nous présentons deux techniques basées sur les variations des propriétés optiques endogènes du tissu du cerveau pendant l&#39;activation. D&#39;abord les signaux optiques intrinsèques (IOS) sont produites par une altération locale de réflexion de la lumière rouge en raison de: (i) l&#39;absorption par les changements de niveau d&#39;oxygénation du sang et du volume sanguin (ii) la diffusion des photons. L&#39;utilisation in vivo des IOS pour enregistrer des cartes spatiales a commencé dans le milieu des années 1980 avec les observatisur des cartes optiques de barils moustaches chez le rat et les colonnes d&#39;orientation dans le cortex visuel de chat 1. IOS imagerie de la surface du rongeur bulbe olfactif principal (OB) en réponse à plus tard a été démontré odorants par groupe de Larry Katz 2. La seconde approche repose sur les signaux d&#39;autofluorescence flavoprotéine (FAS) en raison de changements dans l&#39;état redox de ces intermédiaires métaboliques mitochondriales. Plus précisément, la technique est basée sur la fluorescence verte due à l&#39;état oxydé du flavoprotéines lorsque le tissu est excité par la lumière bleue. Bien que ces signaux ont probablement été parmi les premières molécules fluorescentes enregistré pour l&#39;étude de l&#39;activité du cerveau par les études pionnières des Chances Britton et ses collègues 3, il n&#39;a pas été jusqu&#39;à récemment qu&#39;elles ont été utilisées pour la cartographie de l&#39;activation du cerveau in vivo. SAF imagerie a été d&#39;abord appliquée au cortex somatosensoriel chez les rongeurs en réponse à une stimulation patte postérieure par groupe Katsuei Shibuki 4. Le système olfactif est d&#39;une importance capitale pour la survie de la grande majorité des espèces vivantes car il permet une détection efficace et d&#39;identification des substances chimiques dans l&#39;environnement (nourriture, des prédateurs). L&#39;OB est le premier relais de traitement de l&#39;information olfactive dans le cerveau. Il reçoit des projections afférentes du olfactifs primaires neurones sensoriels qui permettent de détecter des molécules volatiles odorantes. Chaque neurone sensoriel exprime un seul type de récepteur odorant et les neurones portant le même type de récepteur envoient leurs prolongements nerveux à la même bien définis microrégions de ~ 100 microns 3 constitué de neuropile discret, le glomérule olfactif (fig. 1). Dans la dernière décennie, IOS d&#39;imagerie a favorisé l&#39;exploration fonctionnelle de l&#39;OB 5, 6, 7, qui est devenu l&#39;une des structures les plus étudiées sensorielle. La cartographie de l&#39;activité d&#39;imagerie OB avec le SAF n&#39;a pas été réalisée ce jour. Ici, we montrent les étapes successives d&#39;un protocole efficace pour les IOS et le SAF imagerie pour cartographier les odeurs évoquées activités dans l&#39;OB de la souris.

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Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

Cet article présente les protocoles d&#39;intrinsèques des signaux optiques et d&#39;imagerie d&#39;autofluorescence flavoprotéines signaux de cartographier les odeurs évoquées activités à la surface du bulbe olfactif chez la souris.

Activités d&#39;imagerie Odeur évoqués dans le bulbe olfactif de la souris en utilisant la réflectance optique et Signaux Autofluorescence

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

imaging-odor-evoked-activities-mouse-olfactory-bulb-using-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.9K vues.  UMR8165 Université Paris Sud 11, Paris Diderot 7 – CNRS. Cet article présente les protocoles d'intrinsèques des signaux optiques et d'imagerie d'autofluorescence flavoprotéines signaux de cartographier les odeurs évoquées activités à la surface du bulbe olfactif chez la souris.

Vidéo: Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Réponses Analyse des souris neurones sensoriels olfactifs Utilisation de l&#39;enregistrement Electroolfactogram Air-phase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Recherche

Neurosciences

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Mouse Imaging neuroanatomiques par résonance magnétique

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Cibler les neurones Bulbe olfactif Utiliser combiné In Vivo L&#39;électroporation et de Gal4-Based Enhancer Piège Lignes Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imagerie de calcium des odeurs évoquées réponses dans le Drosophila Lobe antennaire

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo préparatifs de l&#39;ampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Enregistrement Neuronal activité induite de Température-travers le contrôle des modifications de calcium dans le bulbe olfactif de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system. This system is constructed from a broadband white light source, a motorized filter wheel with a set of narrowband interference filters, a light guide, a collecting lens, a video zoom lens, and a monochromatic charged-coupled device (CCD) camera. An ellipsoidal cranial window is made in the skull bone of a rat under isoflurane anesthesia to capture in vivo multispectral diffuse reflectance images of the cortical surface. Regulation of the fraction of inspired oxygen using a gas mixture device enables the induction of different respiratory states such as normoxia, hyperoxia, and anoxia. A Monte Carlo simulation-based multiple regression analysis for the measured multispectral diffuse reflectance images at nine wavelengths (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, and 760 nm) is then performed to visualize the two-dimensional maps of hemodynamics and the light scattering properties of the in vivo rat brain.

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system.

L&#39;évaluation simultanée de l&#39;hémodynamique cérébrale et Light Scattering Propriétés du<em&gt; In Vivo</em&gt; Cerveau de rat en utilisant multispectral Imaging Diffuse Réflectance

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomographie par cohérence optique : Imagerie souris ganglionnaires rétiniennes cellules In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Immunomarquage quadruple de l&#39;ampoule olfactive pour la visualisation des codes d&#39;identité moléculaire des axes sensoriels olfactifs

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the substantia nigra, is essential. To estimate the total dopaminergic neuron number, unbiased stereology using the optical fractionator method is currently considered the gold standard. Because the theory behind the optical fractionator method is complex and because stereology is difficult to achieve without specialized equipment, several commercially available complete stereology systems that include the necessary software do exist, purely for cell counting reasons. Since purchasing a specialized stereology setup is not always feasible, for many reasons, this report describes a method for the stereological estimation of dopaminergic neuronal cell counts using standard microscopy equipment, including a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane) with imaging software, and a computer for analysis. A step-by-step explanation is given on how to perform stereological quantification using the optical fractionator method, and pre-programmed files for the calculation of estimated cell counts are provided. To assess the accuracy of this method, a comparison to data obtained from a commercially available stereology apparatus was performed. Comparable cell numbers were found using this protocol and the stereology device, thus demonstrating the precision of this protocol for unbiased stereology.

This work presents a step-by-step protocol for the unbiased stereological estimation of dopaminergic neuronal cell numbers in the mouse substantia nigra using standard microscopy equipment (i.e., a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane), and public domain software for digital image analysis.

Stéréologique Estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra de souris à l’aide de l’optique fractionnateur et l’équipement de microscopie Standard

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...