Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (subvention aucune. DBI 0.519.984) et le National Institutes of Health (subvention aucune. 5R01GM078279) ..

1) Préparation du matériel végétal <ol><li> Les protoplastes peuvent être dérivées de nombreuses espèces de plantes différentes et des tissus sous réserve que la bonne combinaison de la paroi cellulaire des enzymes digérant est utilisé 1. Avant une expérimentation à grande échelle est entreprise, une digestion à petite échelle de la matière est conseillé afin d&#39;évaluer l&#39;efficacité protoplastes du tissu, des enzymes, etc, et d&#39;estimer les cellules pour cent positif pour le tri cellulaire. Ici, les protoplastes dérivés à partir des racines des plants d&#39;Arabidopsis thaliana cette cellule de type expriment spécifiquement la protéine fluorescente verte (GFP) sont utilisés. L&#39;endoderme et le centre de repos sont marquées par P RCS:: GFP et le centre de repos par P WOX5:: GFP 2,3 (figure 1). </li><li> Les plants sont cultivés en hydroponie dans phytatrays (Sigma; figure 2a) sur un filtre en nylon (250 mailles um; NITEX) qui permet la croissance des racines dans le milieu grâce à la croissance (0,22% p / v de Murashige et Skoog basale [sigma], 1% p / v de saccharose, 0,05% p / v MES [2 - (N-morpholino) acide éthanesulfonique], pH 5,7 avec KOH). Alternativement, les plantes peuvent être cultivées sur un filtre en nylon (maille 100 um) en position verticale des plaques d&#39;agar à 1% (Figure 2b). </li><li> L&#39;utilisation des filtres ci-dessus contribue non seulement à la récolte des racines, il facilite également facile de traitement supplémentaire des plants, si désiré. Les filtres permettent les semis à être transférés en masse pour phytatrays nouvelles ou des plaques d&#39;agar complété par un catalyseur d&#39;intérêt. Par exemple, l&#39;ensemble phytatray a été utilisé pour des cellules spécifiques au type d&#39;analyse de la réponse transcriptionnelle au traitement de l&#39;azote dans des plants d&#39;Arabidopsis 4. </li><li> Assurez-vous que votre microscope marqueur fluorescent est correctement exprimé (en particulier lorsque vous utilisez l&#39;option de traitement, comme la cellule de type marqueurs spécifiques eux-mêmes pourraient être influencés par le traitement). Dans ce cas, les plants sont inspectés sous un microscope à fluorescence (Nikon, figure 1). Notez que la cellule spécifique du type lignes marqueur fluorescent devrait être caractérisé d&#39;abord sous un microscope confocal à déterminer exactement quels types de cellules sont marquées et de déterminer la variabilité dans l&#39;expression. </li></ol> 2) Préparation de la solution de protoplastes <ol><li> Dissoudre 1,25% p / v cellulase (Yakult), 0,3% p / v Macerozyme (Yakult), 0,4 M de D-mannitol, 20 mM de MES et 20 mM de KCl (à partir d&#39;un stock de 1 M) dans de l&#39;eau déminéralisée et ajuster le pH à 5,7 avec 1 M Tris / HCl pH 7,5. Cette solution sera légèrement trouble. </li><li> Chauffer la solution à 55 ° C pendant 10 minutes (la solution va devenir clair) et laisser refroidir à température ambiante avant d&#39;ajouter 0,1% p / v de BSA (sérum albumine bovine), CaCl2 10 mM et 5 mM β-mercaptoéthanol . </li></ol> 3) Récolte et protoplastes de la matière végétale <ol><li> Les racines sont récoltées par les grattant le filet de nylon avec un scalpel et déposés dans un flacon contenant la solution protoplastes. Généralement, 10 ml de solution protoplastes est utilisée par 1500 racines des plantules. </li><li> Agiter les flacons en douceur (75 min) à température ambiante pendant une heure. Un temps d&#39;incubation peut augmenter le rendement de protoplastes, mais va également ajouter à l&#39;effet de lui-même protoplastes sur l&#39;expression génique. </li><li> Filtrer la solution de protoplastes avec une passoire cellule 40 um (BD Falcon) et diviser la solution sur des tubes coniques de 15 ml (BD Falcon). </li><li> Faites tourner les tubes dans une centrifugeuse swing-seau pendant 10 minutes à 500 g. Remarquez que cette vitesse de centrifugation va dépendre du type de protoplastes utilisés, leur fragilité et de la quantité de débris de cellules produites pendant le traitement enzymatique. </li><li> Retirez la plupart du surnageant, remettre en suspension les protoplastes dans la solution restante et les inspecter au microscope (figure 3). </li><li> Faire usage d&#39;un hématimètre pour estimer le nombre et la densité de protoplastes. La densité cellulaire permettra de déterminer la vitesse d&#39;injection de l&#39;échantillon, les événements par seconde et donc le temps total nécessaire pour trier les cellules au FACS (voir aussi rubrique 4.3). </li><li> 3.7) Soit procéder directement à FACS ou se laver et remettre en suspension les protoplastes dans une solution d&#39;incubation, comme W5 (154 mM NaCl, 125 mM de CaCl2, 5 mM de KCl, 5 mM MES, ajuster le pH à 5,7 avec KOH) ou de solution sans le protoplastes ajoute des enzymes. Surtout quand on regarde les changements de la transcription, il est d&#39;importance pour minimiser l&#39;exposition des échantillons à des conditions qui pourraient influer sur l&#39;expression des gènes, comme le changement de la mémoire tampon, les protoplastes sont maintenus po Il est donc recommandé de garder les protoplastes dans une solution de protoplastes et de procéder au FACS dès que possible. </li></ol> 4) Le tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes <ol><li> Allumez-le et préparer le trieur de cellules. Ici, un FACSAria (BD) est utilisé. </li><li> Mettre en place un flux de débit avec un 100 m &amp;u; buse m et une pression de 20 psi gaine. </li><li> La densité cellulaire et la vitesse d&#39;injection de l&#39;échantillon peut être ajusté à l&#39;expérience particulière basée sur le savoir si un meilleur rendement possible, ou plus grande vitesse possible est souhaitée. Nous avons trié avec succès avec des densités atteignant 10.000.000 cellules / ml. </li><li> Utilisez l&#39;option d&#39;agitation de l&#39;échantillon sur le FACS pour empêcher la sédimentation des protoplastes. Si le colmatage du FACS est un problème, il ya trois étapes de dépannage possibles: 1. Effectuer un échantillon de rétrobalayage ligne. 2. Diluer la suspension de votre protoplastes pour réduire la densité. 3. Nettoyer la solution de protoplastes en répétant l&#39;étape de filtration (3,3) après centrifugation et resuspension. </li><li> Préparez l&#39;appareil à mesurer diffusion vers l&#39;avant (FSC), la diffusion latérale (SSC) et émission à 530/30 nm pour la GFP et 610/20 nm pour le spectre rouge autofluorescence (RSA) après excitation par un laser à 488 nm. Ce sont essentiellement les seuls paramètres utilisés pour isoler la GFP-positives protoplastes. Ici, les réglages de tension ont été comme suit: FSC - 60V, 250V SSC, la GFP 350V 335V et RSA. Notez que les réglages de tension optimale sera différente pour chaque FACS et sera même pas besoin d&#39;être ajustée pendant toute la durée de la trieuse de cellules. </li><li> Commencez par mettre en place un dotplot pour diffusion vers l&#39;avant par rapport diffusion latérale. Appliquer les réglages de tension de sorte que les événements mesurés sont centrés dans le complot. </li><li> Ensuite, créez un tracé de points de vert par rapport rouges signaux de fluorescence. Appliquer les réglages de tension de sorte que les événements mesurés donnent une population centrée en diagonale dans la parcelle en regardant une suspension de type sauvage protoplastes (non-GFP). Une suspension de protoplastes provenant d&#39;une ligne de marqueur GFP va produire une population claires de vert fluo des événements jamais vus dans des échantillons de type sauvage. </li><li> Régler les contraintes d&#39;ajuster la rémunération de chevauchement spectral entre la GFP et RSA. Une bonne paramètres contrainte de compensation permettra une meilleure séparation des protoplastes GFP-positives à partir des protoplastes non-GFP et de débris. Les contraintes utilisées ici sont comme suit: RSA, moins GFP 17,91%. </li><li> Mettre en place un portail d&#39;identifier GFP-positives événements, un contrôle négatif de la non-GFP protoplastes devrait être utilisé pour aider à définir les limites de grille (figure 4). </li><li> Mettre en œuvre une coupure diffusion vers l&#39;avant afin de laisser sortir les petits débris de l&#39;analyse. Visualisez les événements GFP-positives dans le complot FSC vs SSC pour aider à déterminer le placement de la coupure. Ici, le seuil était fixé à 5000. Notez que le FACS comptera les débris que les événements de tri et d&#39;un échantillon avec un niveau élevé de débris peuvent avoir un pour cent événements différents GFP positives que prévu. Ce n&#39;est pas nécessairement un problème. Cependant, le plus de débris dans l&#39;échantillon, plus le tri va prendre. </li><li> Selon l&#39;expérience et l&#39;abondance du type de cellule à analyser, de définir le mode de précision FACS, soit pour un rendement optimal ou la pureté optimale des cellules triées. </li><li> Pour l&#39;extraction d&#39;ARN, de préparer des tubes de prélèvement (1,5 ml microtubes de) avec la quantité appropriée de tampon d&#39;extraction d&#39;ARN. Avec cette configuration, 20000 évènements de tri donnera un volume total d&#39;environ 100 ul qui ont été triés pour 350 pi de tampon d&#39;extraction (RNeasy Micro Kit, QIAGEN). Mélanger les échantillons après l&#39;achèvement de la sorte que la suspension de cellules peuvent mettre en commun au sommet. </li><li> Conserver les échantillons ou de procéder directement à extraction de l&#39;ARN. Analyses microarray réussies ont été préformé avec l&#39;ARN extrait d&#39;aussi peu que 500 événements triés. Ici, nous avons utilisé un kit d&#39;extraction RNeasy Micro (QIAGEN), le système WT-Ovation Pico amplification de l&#39;ARN et FL-Ovation ADNc Biotine Module V2 (NuGEN). </li></ol> Les résultats représentatifs Un phytatray d&#39;environ 1500 RCS d&#39;une semaine, âgé P: semis GFP a donné environ 60 000 protoplastes (tel que mesuré par hématimètre). 2,6% des 65 000 évènements FACS-transformés ont été définis comme étant GFP-positives et ont été triés (figure 4b). Huit plaques d&#39;environ 1500 de quatre jours, âgé de P WOX5:: GFP plants chacun (12 000 au total) a donné environ 30.000.000 protoplastes (tel que mesuré par hématimètre). 0,063% des 16.000.000 d&#39;événements FACS-traitées ont été définis comme étant GFP-positives et ont été triés (figure 4C). 10.000 manifestations triées sont généralement utilisés pour l&#39;extraction de l&#39;ARN et peut produire de 20 à 140 ng d&#39;ARN total (figure 5). <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Cellulaire spécifique du type lignes de marqueur GFP dans la racine d&#39;Arabidopsis. Microscopie à fluorescence images ont été prises avec un contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) et une GFP sur un microscope à Eclipse 90i (Nikon) fonctionnant sur ​​le logiciel Metamorph (Molecular Devices) de filtrage. Les images DIC et GFP ont été superposées à des fins de visualisation. Les deux lignes de marqueur utilisé dans cette expérience visuelle sont présentés;a) P RCS:: GFP et b) P WOX5:: GFP. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Plants conditions de croissance. Ont été cultivées dans un contrôleur de l&#39;environnement hydroponique dans phytatrays (a) ou sur gélose positionnée verticalement (b). <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Protoplastes de plantes exprimant la GFP. Microscopie à fluorescence images ont été prises avec un contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) et un filtre GFP sur un microscope à Eclipse 90i (Nikon) fonctionnant sur ​​le logiciel Metamorph (Molecular Devices). Les images DIC et GFP ont été superposées à des fins de visualisation. Les flèches indiquent une cellule éclatement, les débris cellulaires et d&#39;un protoplaste GFP-positives. La distance entre deux lignes blanches est de 50 um. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Fluorescence tri cellulaire activé de la GFP-positives protoplastes protoplastes issus de type sauvage (a) P RCS.:: GFP (B) ou P WOX5:: GFP (c) des lignes de marqueur ont été analysés et triés avec un FACSAria (BD) en utilisant les portes définies sur un dotplot de vert (530/30 nm; axe des x) par rapport à rouge (610/20 nm; axe Y) de fluorescence. 100 000 événements sont présentés dans chaque parcelle. Les événements relevant de la porte de tri GFP sont surlignés en vert. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Représentant des extractions d&#39;ARN à partir 10.000 cellules triées. Les cellules ont été triées directement dans l&#39;ARN d&#39;extraction du tampon (QIAGEN), l&#39;ARN a été purifié et vérifiées pour la concentration, la pureté et l&#39;intégrité sur un bioanalyseur 2100 (Agilent). Trois répliques pour les deux lignes de marqueur sont affichées.

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	<li>Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+in+maize+and+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts.">Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127, 595-603 (2000).</li><li>Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PIN+auxin+efflux+facilitator+network+controls+growth+and+patterning+in+Arabidopsis+roots.">The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots.</a> Nature. 433, 39-44 (2005).</li><li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity.">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).</li><li>Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+fluorescent+selection+permits+precise,+rapid,+and+in-depth+overexpression+analysis+in+plant+protoplasts.">Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts.</a> Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).</li><li>Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis.">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li></ol>

Les protoplastes peuvent, en principe, être dérivé d&#39;une variété de tissus végétaux, l&#39;optimisation des conditions favorables permettra d&#39;améliorer grandement la qualité et la quantité d&#39;ARN. Tant la solution protoplastes et le tampon d&#39;incubation élective utilisés auront une influence sur cet aspect. Beaucoup de différentes protéines fluorescentes peuvent être utilisés, selon les capacités de la FACS utilisé, par exemple, la GFP, RFP, YFP, CFP ...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>250 &mu;m nylon mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sefar Filtration</td>
<td>NITEX 03-250/50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 &mu;m nylon mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sefar Filtration</td>
<td>NITEX 03-100/47</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Square petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-757-10k</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phytatrays</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1552</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Murashige and Skoog Basal Medium (MS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5519</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>S5-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M2933</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1767</td>
<td>10 M stock</td>
</tr>
<tr>
<td>Eclipse 90i microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellulase R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yakult Pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macerozyme R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yakult Pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-mannitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9546</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8041</td>
<td>1 M stock</td>
</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CALBIOCHEM</td>
<td>444203</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2536</td>
<td> 1 M stock</td>
</tr>
<tr>
<td>orbital shaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>LAB-LINE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40 &mu;m cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>conical 15 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>table centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sorvall</td>
<td>Legend RT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FACSAria</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 ml microfuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>20170-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy micro kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QIAGEN</td>
<td>74004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>WT-Ovation Pico RNA Amplification System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NuGEN</td>
<td>3300_12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FL-Ovation cDNA Biotin Module V2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NuGEN</td>
<td>4200_12</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts

Haute résolution, le type spécifique de cellules d&#39;analyse de l&#39;expression génique améliore considérablement la compréhension de la régulation du développement et des réponses aux stimuli de l&#39;environnement dans tout organisme multicellulaire. Hybridation in situ et la visualisation gène rapporteur peut dans une certaine mesure être utilisés à cette fin, mais pour une grande résolution quantitative RT-PCR ou haut-débit à l&#39;échelle d&#39;analyse du transcriptome à l&#39;isolement de l&#39;ARN à partir des types cellulaires particuliers sont requis. Cellulaire dissociation des tissus exprimant un marqueur fluorescent protein dans un type cellulaire spécifique et ultérieures de tri cellulaire par fluorescence (FACS), il est possible de collecter des quantités suffisantes de matériel pour l&#39;extraction d&#39;ARN, d&#39;ADNc analyse de synthèse / amplification et de biopuces. Un vaste ensemble de cellules spécifiques au type de lignes rapporteur fluorescent est disponible à la communauté scientifique des plantes. Dans ce cas, deux lignes de marqueur de la racine d&#39;Arabidopsis thaliana sont utilisées: P RCS:: GFP (endoderme et le centre de repos) et P WOX5:: GFP (centre de repos). Un grand nombre (des milliers) de jeunes plants sont cultivés en hydroponie ou sur plaques de gélose et d&#39;obtenir du matériel récolté assez de racines pour une analyse ultérieure. Cellulaire de dissociation de la matière végétale est obtenue par digestion enzymatique de la paroi cellulaire. Cette procédure permet l&#39;utilisation de haute osmolalité induite par plasmolyse et cellulases disponibles dans le commerce, pectinases et hémicellulases pour libérer protoplastes dans la solution. FACS de GFP-positives cellules permet l&#39;utilisation de la visualisation des verts contre les spectres d&#39;émission rouge de protoplastes excité par un laser à 488 nm. GFP-positives protoplastes peuvent être distingués par leur ratio est passé du vert à l&#39;émission de rouge. Les protoplastes sont généralement triés directement dans un tampon d&#39;extraction de l&#39;ARN et stockés pour un traitement ultérieur à une date ultérieure. Cette technique se révèle être simple et réalisable. Par ailleurs, il est démontré qu&#39;il peut être utilisé sans difficulté d&#39;isoler un nombre suffisant de cellules pour l&#39;analyse du transcriptome, même pour des types de cellules très rares (par exemple les cellules du centre de repos). Enfin, une installation de croissance des semis d&#39;Arabidopsis est démontré que le traitement permet simple des plantes avant de tri cellulaire (par exemple pour le type spécifique de cellules d&#39;analyse des réponses au stress biotiques ou abiotiques). Supplémentaires éventuelles utilisations des FACS des protoplastes végétaux sont discutées.

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Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Une méthode pour isoler des types cellulaires spécifiques du matériel végétal est démontrée. Cette technique utilise des lignes de marqueur transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans des types cellulaires particuliers, cellulaire dissociation et de tri cellulaire activé par fluorescence. De plus, une installation de croissance est établi ici, qui facilite le traitement des<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semis avant le tri cellulaire.

Tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes végétaux

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

fluorescence-activated-cell-sorting-of-plant-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biology

24.6K vues.  New York University. Une méthode pour isoler des types cellulaires spécifiques du matériel végétal est démontrée. Cette technique utilise des lignes de marqueur transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans des types cellulaires particuliers, cellulaire dissociation et de tri cellulaire activé par fluorescence. De plus, une installation de croissance est établi ici, qui facilite le traitement des Arabidopsis thaliana Semis avant le tri cellulaire.

Vidéo: Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Chromatographie d&#39;affinité lipidique des vésicules médiée utilisant magnétique tri cellulaire activé (LIMACS): une nouvelle méthode pour analyser les interactions protéines-lipides

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Recherche

Biologie

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification of bacterial taxa that transform specific pools of DOC in nature poses a technical challenge. 
Here we describe an approach that couples bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation, fluorescence activated cell sorting (FACS), and 16S rRNA gene-based molecular analysis that allows culture-independent identification of bacterioplankton capable of degrading a specific DOC compound in aquatic environments. Triplicate bacterioplankton microcosms are set up to receive both BrdU and a model DOC compound (DOC amendments), or only BrdU (no-addition control). BrdU substitutes the positions of thymidine in newly synthesized bacterial DNA and BrdU-labeled DNA can be readily immunodetected 1,2. Through a 24-hr incubation, bacterioplankton that are able to use the added DOC compound are expected to be selectively activated, and therefore have higher levels of BrdU incorporation (HI cells) than non-responsive cells in the DOC amendments and cells in no-addition controls (low BrdU incorporation cells, LI cells). After fluorescence immunodetection, HI cells are distinguished and physically separated from the LI cells by fluorescence activated cell sorting (FACS) 3. Sorted DOC-responsive cells (HI cells) are extracted for DNA and taxonomically identified through subsequent 16S rRNA gene-based analyses including PCR, clone library construction and sequencing.

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Environmental bacterioplankton are incubated with a model dissolved organic carbon (DOC) compound and a DNA labeling reagent, bromodeoxyuridine (BrdU). Afterward, DOC-degrading cells are separated from the bulk community based on their elevated BrdU incorporation using fluorescence activated cell sorting (FACS). These cells are then identified by subsequent molecular analyses.

Bromodésoxyuridine (BrdU) l&#39;étiquetage et ultérieures de tri cellulaire activé par fluorescence de la culture indépendante Identification de carbone organique dissous dégradants bactérioplancton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Analyse cellulaire spécifique de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Feuilles en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

Isolation des fibroblastes normales et cancéreuses associées à partir de tissus frais par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

La mesure de la perméabilité à l&#39;eau Coefficient osmotique (P<sub&gt; F</sub&gt;) Des cellules sphériques: protoplastes de plantes isolées comme un exemple

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Analyse rapide des phénotypes circadiens dans Arabidopsis protoplastes transfectées avec un Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualisation Fréquence Stromule avec Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Fiche Fluorescence Microscopy Lumière de racines de plante qui pousse sur la surface d&#39;un gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Cellule magnétique activé tri des stratégies visant à isoler et purifier Synovial fluide mésenchymateuses cellules souches dérivées d’un modèle de lapin

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...