Le financement fourni par le sud de l&#39;Arizona Anciens Combattants de la santé Système de soins de VA examen du mérite 0142 de subvention et l&#39;Arizona recherche biomédicale subvention de la Commission 0803.

Préparation des tissus pour être visualisé sur diapositives <ol><li> Un coloscope peut être passé dans le côlon par l&#39;anus. Un coloscope est un long tube qui a un éclairage et une caméra vidéo à la tête, la capacité de passer de l&#39;air dans le côlon de le faire sauter comme un ballon long pour permettre une meilleure visualisation du côlon, et a un passage pour les pinces à biopsie qui peut s&#39;étendre au-delà de la caméra vidéo pour pincer une zone 3-5 millimètre de la surface &quot;peau&quot; intérieure ou couche muqueuse du côlon pour nous donner un échantillon de biopsie. Les pinces à biopsie peut aussi être utilisé pour enlever éventuellement polypes précancéreux dans le côlon. </li><li> Nous avons obtenu des biopsies de tissus muqueux colique normale chez les patients, avec le consentement éclairé. Ces patients ont été l&#39;objet d&#39;une coloscopie de dépistage dans une clinique de gastro-intestinal. Notre biopsies ont été placés dans des bocaux de formol. Après 4 heures, le formol a été remplacé par l&#39;alcool à 70%. </li><li> Échantillons de tissus similaires ont été prises à partir des zones de résections du côlon, enlevée pendant la chirurgie, qui étaient de 1 cm et 10 cm de cancers du côlon ou adénomes avec néoplasie avancée. Ces échantillons de tissus ont également été placés dans du formol, et si les échantillons de tissus ont été grands, certains ont été conservés dans le formol pour une longue période avant d&#39;être placé dans l&#39;alcool à 70%. </li><li> Les échantillons de tissu sont pris à un laboratoire d&#39;histologie pour être traités et placés dans des blocs de paraffine. </li><li> Les blocs de paraffine sont refroidis dans un réfrigérateur pour les rendre plus facilement coupé par un microtome. </li><li> Des sections de tissu de 4 microns d&#39;épaisseur sont découpées dans les blocs de tissus, en utilisant un microtome, et flottait sur l&#39;eau. </li><li> Pour comparer l&#39;expression des deux protéines, par exemple ERCC1 et PMS2, des coupes de tissus de remplacement peuvent être ramassés sur deux diapositives, jusqu&#39;à il ya trois sections de tissus sur chacun des deux lames. Par exemple, les articles 1, 3 et 5 peut être placé sur une lame étiquetés ERCC1 et les articles 2, 4 et 6 peuvent être placés sur une diapositive étiquetés PMS2. Avoir trois sections de tissus immunocolorées pour une protéine sur une seule lame peut vous permettre de voir si une tendance inhabituelle coloration d&#39;une crypte est un artefact ou est réel, puisque les artefacts ne seraient pas répétées dans plus d&#39;une coupe de tissu sur une lame. Cryptes du côlon sont d&#39;environ 60 microns de diamètre, alors que près de 15 sections de tissus pourraient être réduits grâce à une crypte, et la crypte même chose pourrait être visualisées sur des coupes de tissus multiples par diapositive. </li></ol> Immunocoloration coupes de tissus <ol><li> Les lames sont ensuite soumises à la procédure marquage immunohistochimique. Ceci est une procédure de huit heures, et est assez standard. Les pièces de la procédure que nous utilisons, qui ne sont pas standard, sont l&#39;utilisation de conteneurs Sequenza pour la coloration, et l&#39;utilisation d&#39;une solution pour réduire la coloration de fond appelée &quot;Sniper&quot;. Le &quot;sniper&quot; solution est vendu comme une formule exclusive par Biocare médicale, Concord en Californie. </li><li> Certaines des étapes de nos procédures sont présentées ici. </li><li> À titre d&#39;exemple, pour PMS2 immunohistochimie, diapositives sont d&#39;abord déparaffinées en plaçant en 3 changements de xylène (3 minutes chacun), suivis par deux changements dans l&#39;éthanol à 100% (2 minutes chacun), suivis par deux changements dans l&#39;éthanol à 95% (2 minutes chacun), suivis par les deux changements d&#39;eau distillée (2 minutes chacun). Ces procédures sont réalisées sous une hotte chimique avec la pression d&#39;air négative de sorte que l&#39;expérimentateur n&#39;est pas exposé à des vapeurs. </li><li> Lorsque le formol a été initialement utilisée pour fixer le tissu, les pièces des protéines dans l&#39;échantillon de tissu est devenu réticulé. Maintenant nous avons besoin de rompre les liens inter-sorte qu&#39;un anticorps capable de reconnaître la protéine d&#39;intérêt. Les lames sont placées dans une solution tampon qui est amenée à ébullition dans un four à micro-ondes. Il est suivi par 10 minutes sur le réglage moyen, suivi d&#39;un refroidissement pendant 20 minutes sur la glace. Cette étape doit être testé et ajusté pour les micro-ondes différentes, jusqu&#39;à ce que de bons résultats sont obtenus. Notez que pour l&#39;immunocoloration CCOI ou Ku86 nous avons utilisé un tampon citrate de sodium fait avec l&#39;acide citrique + 9 ml de citrate de sodium 41mL + 450mL H 2 O (un tampon, y compris les ions sodium), qui avait un pH d&#39;environ 6,0 pour ERCC1, nous avons utilisé un tampon citrate fait à l&#39;acide citrique 2,1 g + 1 litre H 2 O + ~ hydroxyde de sodium 5 ml d&#39;apporter pH à 6.1 (un tampon avec un minimum d&#39;ions sodium ajouté), et pour PMS2 nous avons utilisé une solution faite avec une solution Antigène Démasquer 5mL (par le vecteur) + 533mL H 2 O. Différents tampons sont nécessaires pour accroître l&#39;interaction des anticorps avec des épitopes des protéines particulières. </li><li> Les lames sont ensuite mis en peroxyde d&#39;hydrogène à 3% (dilué dans du méthanol) pendant 20 minutes suivie d&#39;un rinçage à l&#39;eau distillée pendant 3 minutes, et lavés dans un tampon phosphate salin (PBS appelé) pendant 5 minutes. </li><li> Les lames sont ensuite placés dans l&#39;appartement de racks coloration étroit appelé Sequenza (Système Shandon Immunocoloration Sequenza de Thermo Scientific) et rincées avec du PBS. </li><li> Les diapositives étant immunocolorées pour ERCC1 ou PMS2 sont ensuite exposés à 10 minutes d&#39;exposition à un traitement supplémentaire de 3 gouttes d&#39;une solution propriétaire, obtenu à partir Biocare, appelé «Sniper», qui agit pour réduire la non-coloration des protéines spécifiques de fond. </li><li> Les lames sont rincées avec un tampon &quot;TBST&quot; qui est de 1 ml + 100 ml de Tween 10x Tris + 900 ml d&#39;eau distillée [où 10x Tris est de 24,2 grammes Trizma + 80 grammes de NaCl + 1000 ml d&#39;eau distillée et déminéralisée + HCl concentré (environ 15 ml) d&#39;apporter la solution à pH 7,6]. </li><li> Les lames sont ensuite rincés trois fois avec un tampon, et 100 microlitres d&#39;anticorps secondaire biotinylé DAKO au 1:100 dilution (en 2% d&#39;albumine sérique bovine constitué dans le tampon TBST) est ajoutée à la glisse et incubé pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> À ce stade, Vectastain ABC (avidine biotine) (à partir de Vector Laboratories) réactif est préparé, en utilisant 2,5 ml de PBS, une solution de laisser tomber une, une solution B de chute, et la solution est laissée au repos pendant 30 minutes. </li><li> Les lames sont rincées 3 fois avec le tampon TBST. </li><li> Puis 3 gouttes de réactif Vectastain ABC est ajouté et les lames sont incubées à température ambiante pendant 30 minutes, suivi d&#39;un rinçage 2 fois avec TBST. </li><li> Les lames sont ensuite immergées dans le DAB (diamino-benzamide) (2,9 ml DAB + 400 microlitres de PBS + 250 microlitres du peroxyde d&#39;hydrogène) pendant environ 5 minutes. </li><li> Les lames sont ensuite rincés 2 fois à l&#39;eau distillée, eau déminéralisée. </li><li> Contre-coloration est faite avec une solution diluée d&#39;hématoxyline pendant 10 secondes. Les lames sont soigneusement rincés à l&#39;eau du robinet, suivi d&#39;eau déminéralisée. </li><li> Les lames sont ensuite déshydratées 2 fois pendant 2 minutes dans de l&#39;éthanol à 95%, 2 fois pendant 2 minutes dans de l&#39;éthanol 100% et 2 fois pendant 2 minutes dans le xylène. </li><li> Un couple de gouttes de Cytoseal XYL (Richard-Allan scientifique) sont ensuite ajoutés à la glisse et une lamelle appliquée. </li><li> L&#39;évaluation immunohistochimique de ERCC1, Ku86 et CCOI sont effectuées en utilisant le même protocole que pour les PMS2, mais en remplaçant l&#39;anticorps PMS2 avec des anticorps pour ERCC1, Ku86 et CCOI décrites dans le tableau ci-dessous. </li></ol> Évaluation des coupes de tissus pour les cryptes déficient dans l&#39;expression de ERCC1, PMS2, Ku86 et CCOI <ol><li> Nous examinerons d&#39;abord des coupes de tissus sous un Motic (DM-BA300) photomicroscope pour l&#39;expression de ERCC1 et PMS2 dans les cryptes de la muqueuse colique. </li><li> PMS2 et ERCC1 sont deux enzymes de réparation de l&#39;ADN, et donc ils sont situés là où l&#39;ADN est, dans les noyaux des cellules des cryptes. Ceci est indiqué dans la figure 1, où le colon brune représentant de coloration pour ERCC1, se produit dans les noyaux des cellules dans une crypte. La crypte normale, nous montrons d&#39;abord dans le microscope a été colorées pour ERCC1, et la tache brune montre l&#39;emplacement de ERCC1. Nous rappelons les types de cellules dans les cryptes, où &quot;cellules caliciformes&quot; sont en forme un peu comme un verre de vin, avec des noyaux à une petite région à la base des cellules sur le bord extérieur de la crypte, et un ballonnement article, rempli de granules de mucine blanc dans la partie de la cellule à l&#39;intérieur de la crypte. Les deux autres types de cellules regard un peu comme dans nos sections colorées, et ils sont les entérocytes et cellules entéroendocrines, et leurs noyaux sont également au bord extérieur de la crypte, à la base des cellules. Dans les biopsies prélevées chez des patients qui n&#39;ont jamais eu une néoplasie du côlon, ou dans des biopsies loin de tout site de cancer du côlon, la quasi-totalité des noyaux dans tous les cryptes normales montrent haut niveau d&#39;expression de ERCC1 comme indiqué ici. </li><li> Pour orienter nos observations, des coupes de tissus obtenus à partir de biopsies de patients atteints de néoplasie du côlon ne sont observés pour des niveaux d&#39;expression de PMS2, ERCC1, CCOI ou Ku86 dans la muqueuse colique normale. Nous pouvons observer tous les cryptes dans une section de tissu normal, avec un objectif 40x, comme nous avons lentement passer par une section de tissu ensemble et souligner les cryptes, les cellules interstitielles, toute nodules lymphoïdes sur la lame, et la musculeuse (si présent dans la biopsie). </li><li> Nous rappelons également qu&#39;il ya juste plusieurs cellules à la base de la crypte qui sont les cellules souches. Ces cellules souches générer tous les environ 2.000 cellules de la crypte complète. Une cellule souche présentant une mutation ou d&#39;une epimutation peut prendre en charge la niche de cellules souches entier. Puis la crypte l&#39;ensemble peut avoir modifié coloration pour une enzyme d&#39;intérêt (conversion crypte) comme nous le montrons dans cette nouvelle diapositive, où nous voyons les cryptes toute déficientes pour CCOI côté de cryptes qui ont une expression élevée de CCOI. </li><li> Ensuite, nous montrons une diapositive à partir d&#39;un patient avec un cancer du côlon ou un adénome avec néoplasie avancée. Sur cette diapositive, certains ont des cryptes normales haut niveau d&#39;expression de ERCC1 et certains ont des niveaux inférieurs de l&#39;expression. Tous les cryptes dans la section des tissus sont photographiés à basse résolution avec un objectif 10x, et les images sont carrelées de sorte que la section de tissu entier est vu dans une seule image. Les cryptes sont ensuite numérotées. </li><li> Les cryptes avec une expression élevée de l&#39;enzyme, typique des cryptes dans les biopsies de loin BOFm toute forme de cancer, sont appelés au niveau «4» coloration. Les autres niveaux sont «0» s&#39;il n&#39;ya pas d&#39;expression détectable, &quot;1&quot; si l&#39;expression à peine détectable est évident, &quot;2&quot; s&#39;il n&#39;y est présent l&#39;expression, mais à un niveau beaucoup plus bas que le niveau 4, et &quot;3&quot; si l&#39;expression est présent à un niveau inférieur à 4, mais assez forte. Nous points chaque diapositive sur le bleu d&#39;image à faible résolution pour 4, vert pour 3, jaune pour 2, orange pour une et rouge pour 0. Ici, nous montrons en passant par une section d&#39;une biopsie à l&#39;aide d&#39;un objectif 40x. Nous parsèment les cryptes de l&#39;image à faible résolution. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Une crypte colique montrant une expression élevée de ERCC1 dans les noyaux des cellules des cryptes. Toutes les couleurs de cette image ont été aussi renforcée dans le contraste et la saturation, à l&#39;aide de Paint Shop Pro 5. Les résultats représentatifs <ol><li> Les sections de tissus de remplacement sur des lames séparées nous permettre de regarder les cryptes coliques mêmes, avec une expression de deux protéines différentes montré par immunohistochimie. L&#39;image de l&#39;un coloré crypte pour PMS2 et le teint même crypte pour ERCC1 est indiqué sur les microscopes adjacente avec des écrans d&#39;ordinateur adjacentes. Cela nous permet de déterminer s&#39;il ya carence conjointe de deux protéines ou si les déficiences dans chacune des protéines, alors que chacun est fréquente, se produit de façon indépendante. Nous avons trois sections de tissu par lame, de sorte que toute lacune apparente dans l&#39;expression d&#39;une protéine peut être vérifiée comme étant déficient à plus d&#39;une section, et non due à un artefact. Dans les tissus environnants cancers du côlon, où il ya une anomalie du champ donnant lieu à un cancer, il ya une fréquence élevée des cryptes déficientes pour ERCC1 et PMS2. </li><li> Nous avons également utilisé l&#39;immunohistochimie pour trouver la fréquence des cryptes déficientes pour Ku86 et CCOI. Sur cette diapositive, nous passons par une section de tissu ensemble immunocolorées pour Ku86, en utilisant un objectif 40x, et nous pouvons voir que quelques cryptes sont déficientes pour Ku86 dans cette section des tissus. </li><li> De même, sur cette diapositive, nous passons par une section de tissu ensemble immunocolorées pour CCOI, en utilisant un objectif 40x, et nous pouvons voir que seul un nombre modéré de cryptes sont déficientes pour CCOI. </li></ol>

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	<li>Slaughter, D. P., Southwick, H. W., Smejkal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+cancerization+in+oral+stratified+squamous+epithelium;+clinical+implications+of+multicentric+origin.">Field cancerization in oral stratified squamous epithelium; clinical implications of multicentric origin.</a> Cancer. 6, 963-968 (1953).</li><li>Vauthey, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+field+cancerisation+in+clinical+oncology.">Importance of field cancerisation in clinical oncology.</a> Lancet Oncol. 1, 15-16 (2000).</li><li>Bernstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+defects+in+progression+to+gastrointestinal+tract+cancers.">Field defects in progression to gastrointestinal tract cancers.</a> Cancer Lett. 260, 1-10 (2008).</li><li>Calabrese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+pretumor+progression+before+and+after+loss+of+DNA+mismatch+repair.">Colorectal pretumor progression before and after loss of DNA mismatch repair.</a> Am J Pathol. 164, 1447-1453 (2004).</li><li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Pms2+expression+in+non-neoplastic+flat+mucosa+from+patients+with+colon+cancer+correlates+with+reduced+apoptosis+competence.">Reduced Pms2 expression in non-neoplastic flat mucosa from patients with colon cancer correlates with reduced apoptosis competence.</a> Appl Immunohistochem Mol Morphol. 14, 166-172 (2006).</li><li>Huang, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+1+is+a+marker+for+normal+and+malignant+human+colonic+stem+cells+(SC)+and+tracks+SC+overpopulation+during+colon+tumorigenesis.">Aldehyde dehydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells (SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis.</a> Cancer Res. 69, 3382-3389 (2009).</li><li>Kim, K. M., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+reveals+a+niche:+stem+cell+succession+in+human+colon+crypts.">Methylation reveals a niche: stem cell succession in human colon crypts.</a> Oncogene. 21, 5441-5449 (2002).</li><li>Greaves, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+are+established+in+human+colonic+stem+cells,+and+mutated+clones+expand+by+crypt+fission.">Mitochondrial DNA mutations are established in human colonic stem cells, and mutated clones expand by crypt fission.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 714-719 (2006).</li><li>Nara, K., Nagashima, F., Yasui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+elevated+ultraviolet-induced+mutation+frequency+in+isolated+Chinese+hamster+cell+lines+defective+in+nucleotide+excision+repair+and+mismatch+repair+proteins.">Highly elevated ultraviolet-induced mutation frequency in isolated Chinese hamster cell lines defective in nucleotide excision repair and mismatch repair proteins.</a> Cancer Res. 61, 50-52 (2001).</li><li>Payne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxycholate+induces+mitochondrial+oxidative+stress+and+activates+NF-kB+through+multiple+mechanisms+in+HCT-116+colon+epithelial+cells.">Deoxycholate induces mitochondrial oxidative stress and activates NF-kB through multiple mechanisms in HCT-116 colon epithelial cells.</a> Carcinogenesis. 28, 215-222 (2007).</li><li>Lim, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+induced+by+reactive+oxygen+species+in+hepatocellular+carcinoma:+methylation+of+the+E-cadherin+promoter.">Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma: methylation of the E-cadherin promoter.</a> Gastroenterology. 135, 2128-2140 (2008).</li><li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+as+carcinogens+in+human+gastrointestinal+cancers.">Bile acids as carcinogens in human gastrointestinal cancers.</a> Mutat Res. 589, 47-65 (2005).</li><li>Payne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hydrophobic+bile+acids,+genomic+instability,+Darwinian+selection,+and+colon+carcinogenesis.">hydrophobic bile acids, genomic instability, Darwinian selection, and colon carcinogenesis.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 1, 19-47 (2008).</li></ol>

<ol><li> Il est très important d&#39;avoir trois sections de tissu par lame. Bulles peuvent survenir lors de l&#39;application des médias portant l&#39;anticorps, de sorte que certains des cryptes ou des portions de cryptes ne peut pas être colorées de manière adéquate juste parce qu&#39;une bulle empêché l&#39;anticorps réagissant avec la coupe de tissu. Cryptes sont d&#39;environ 60 microns de diamètre, et des coupes de tissus sont 4 microns d&#39;épaisseur, donc il pourrait y avoir jusqu&#39;à 15 coupes de tissus à travers la même crypte. Il est généralement possible de trouver la même crypte, en utilisant la morphologie de la crypte comme un guide, sur coupes de tissus multiples placé sur une lame. </li><li> Dans nos études récentes, des échantillons de tissu de grandes, de coloration dans une Sequenza ne peut pas donner une couverture bon anticorps au tissu. Dans ces cas, on peut préférer utiliser la main coloration du tissu, où une baisse des supports contenant l&#39;anticorps est la main placée au-dessus de chaque échantillon de tissu. </li><li> Pour voir clairement la coloration brune montrant l&#39;expression de la protéine immunocolorés, et la coloration au bleu montrant l&#39;ADN nucléaire sur l&#39;écran de l&#39;ordinateur, le logiciel photomicroscope Motic est ajusté comme suit: Gain 0, offset 0, Améliorer 0, 255, Gamma 1,00, 0, Netteté 1, 7 Correction des couleurs R, G, B Gain 1,00 et R, G, B Luminosité 0. La résolution est fixé à 1024 x 768, et la balance des blancs est activé. </li><li> Notre méthode pourrait être utilisée avec toutes les protéines jugées importantes dans la progression d&#39;un cancer du côlon, d&#39;évaluer leur fréquence de la carence, voire la surexpression, dans les anomalies du champ entourant les cancers du côlon ou adénomes avec néoplasie avancée. </li><li> Des anomalies du champ sont une partie de la progression vers le cancer Le &quot;cancérisation champ&quot; terme a été utilisé par Slaughter et al. En 1953 pour décrire une une zone ou un «champ» de l&#39;épithélium qui a été préconditionnés par des processus largement inconnus (à l&#39;époque) afin de le prédisposer au développement d&#39;un cancer. L&#39;utilisation initiale était dans le contexte des cancers buccaux. Depuis lors, le «champ de cancérisation» et «une anomalie du champ» ont été utilisés plus largement pour décrire n&#39;importe quel tissu pré-malignes dans lequel de nouveaux cancers sont plus susceptibles de survenir, et le concept de champ de cancérisation en oncologie clinique a reçu une attention croissante 2 . Nous avons récemment passé en revue les preuves pour des anomalies du champ dans le cancer gastro-intestinal 3. Sont inclus dans cette étude ont été les résultats d&#39;une douzaine d&#39;études fournissant des preuves des anomalies du champ dans le côlon. Des anomalies du champ dans la muqueuse colique proviennent probablement par la sélection naturelle des cellules mutantes ou des cellules épigénétiquement altéré parmi les cellules souches d&#39;une crypte telle que l&#39;on survit à 4 cellules souches relève de niche. L&#39;instabilité génétique ou d&#39;un phénotype mutateur, peut-être due à la réduction de la réparation par excision de nucléotides ADN ou ADN de réparation des mésappariements, permettrait d&#39;accélérer ce processus (et un défaut fréquent dans PMS2 a été précédemment rapporté dans les zones entourant les cancers du côlon 5). Si, dans une population normale de cellules souches dans la muqueuse colique, une cellule acquiert un avantage sélectif par le biais d&#39;une mutation ou d&#39;une epimutation, il aura tendance à élargir clonale au détriment des cellules souches voisines. Dans la muqueuse du côlon, la niche de cellules souches est occupé par ≤ 5 6 cellules qui donnent ensuite naissance à tous (environ 2000), les cellules de la crypte. Une reprise de la niche de cellules souches par un mutant ou des résultats épigénétiquement modifié le type de cellules dans la &quot;conversion crypte&quot; 7. La propagation de clones mutés (cryptes converties) dans l&#39;épithélium du côlon peuvent surviennent le plus souvent par la fission crypte 8. Un exemple de la fission crypte est montré dans la figure 2. De cette façon, un patch de tissu anormal survient. Dans un tel patch, une seconde mutation peut se produire de telles sorte que la crypte donnée acquiert un avantage par rapport à d&#39;autres cryptes au sein du patch, et cette crypte élargira clonale formant un patch secondaires dans le patch d&#39;origine. Dans ce nouveau patch, le processus peut être répété plusieurs fois plus, peut-être au fil des décennies, jusqu&#39;à ce qu&#39;une cellule souche maligne qui se développe par clonage pose un cancer. Si cela est le processus général par lequel sporadiques adénocarcinomes coliques surviennent, puis d&#39;adénocarcinomes du côlon général devrait être associé à, et être précédé d&#39;, les champs de l&#39;anormalité. Ainsi, un correctif de cryptes converties pourrait s&#39;attendre à avoir des défauts décelables dans les alentours d&#39;un adénome avec néoplasie avancée, ou autour d&#39;un cancer du côlon. A partir de ce modèle de pré-progression tumorale, on pourrait s&#39;attendre à trouver des altérations génétiques ou épigénétiques liées à la pré-tumorales progression parmi les échantillons de tissus provenant de la muqueuse du côlon non néoplasiques dans les zones entourant les lésions néoplasiques du côlon qui sont susceptibles d&#39;évoluer vers un cancer . En particulier, les défauts dans les enzymes de réparation d&#39;ADN ou de protéines nécessaires à l&#39;apoptose, pourrait contribuer à la progression en augmentant l&#39;instabilité génomique, et on pourrait s&#39;attendre à trouver dans un champ défectueux. </li><li> Sélection de carence en PMS2 lorsque les cellules sont deficient pour ERCC1 et soumis à un agent endommageant l&#39;ADN Nara et coll. 9 ont augmenté de 25 cultures de cellules ovariennes de hamster chinois 43-3B, le tout avec une mutation inactivant le gène ERCC1 réparation de l&#39;ADN, et les cultures traitées avec un agent endommageant l&#39;ADN, MNNG. Parmi les cellules survivantes dans le traitement des dommages de l&#39;ADN, une seule cellule a été isolée de chaque culture et a permis de former un clone. Tous les clones isolés ont été environ 10 fois plus résistant à la tuer par MNNG que la souche parentale. Parmi les clones isolés, 22 ont été se sera avéré défectueux dans la réparation de mésappariements de l&#39;ADN (MMR). Cinq de ces 22 clones ont été testés par séquençage, et trois des cinq étaient déficientes pour PMS2. Cette sélection pour défaut de PMS2 était vraisemblablement parce PMS2 carences causées résistance à l&#39;apoptose, et donc la capacité de survivre à l&#39;endommagement de l&#39;ADN dans les cellules restantes ajouté lors ERCC1 était absent. (Normalement, PMS2 niveaux sens dommages à l&#39;ADN, les cellules et les causes de subir l&#39;apoptose lors dommages à l&#39;ADN est excessive.) Ainsi, une carence en PMS2 est sélectionné pour quand ERCC1 cellules déficientes sont soumis à des dommages à l&#39;ADN. Clones défectueuse dans les deux ERCC1 et PMS2 ont démontré qu&#39;ils ont un taux d&#39;environ 500 à 1000 fois plus grande mutation lorsqu&#39;il est irradié par UV que les cellules parentales. </li><li> Les acides biliaires provoquent un stress oxydatif, sont des agents endommageant l&#39;ADN et sont importantes dans la progression d&#39;un cancer du colon Acide désoxycholique, un acide biliaire, augmente le stress oxydatif grâce à la génération d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ERO) par plusieurs processus, y compris dommageables de 10 mitochondries. Il ya des preuves récentes que les ROS causer des changements épigénétiques 11, et au moins 15 études ont montré que les acides biliaires, à l&#39;augmentation des concentrations qui accompagne un régime riche en graisses, provoquer des dommages à l&#39;ADN 12. Comme examiné par Bernstein et al. 12, il existe une association positive entre la consommation de graisses alimentaires et l&#39;incidence du cancer du côlon. Les acides biliaires sont sécrétés dans le tractus intestinal en réponse à la graisse dans l&#39;alimentation, et des acides biliaires agissent comme des détergents pour aider à la digestion des graisses. Ainsi, une alimentation riche en graisse est associé à la sécrétion d&#39;acides biliaires augmente. Fécaux concentrations d&#39;acides biliaires sont élevés dans les populations avec une incidence élevée de cancer du côlon, et une exposition excessive aux acides biliaires est considérée comme un facteur de risque majeur pour la cancérogenèse colique 13. Les acides biliaires peut être une cause des anomalies du champ dans le côlon. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Un fission crypte colique en 3 cryptes. Conclusion Nous avons trouvé une fréquence élevée de cryptes déficiente dans les gènes de réparation de l&#39;ADN et de ERCC1 PMS2 (PMS2 est également requise pour l&#39;apoptose) dans les anomalies du champ entourant grande cancers du côlon. Carences en ERCC1 et PMS2 (en raison de modifications épigénétiques ou mutations) peuvent être les premières étapes de l&#39;instabilité génétique au cœur de la progression vers le cancer du côlon.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PMS2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>556415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ERCC1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>MS-671-P1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ku86 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotech.</td>
<td>SC-9034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CcO1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>459600</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated secondary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAKO</td>
<td>E0413</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22% BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Informagen, Inc.</td>
<td>2327</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sniper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocare Medical</td>
<td>BS966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectastain ABC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Labs</td>
<td>PK-6100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>34001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>20605</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal XYL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48212-196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

deficient pms2, ercc1, ku86, ccoi in field defects during progression to colon cancer

En cancérogenèse, le «défaut de terrain&quot; est reconnu cliniquement en raison de la forte propension des victimes de certains cancers de développer d&#39;autres tumeurs malignes du type même tissu, souvent dans un endroit à proximité. Ces anomalies du champ ont été indiqués dans le cancer du côlon. Les anomalies moléculaires qui sont responsables d&#39;une anomalie du champ dans le côlon doit être détectable à haute fréquence dans le tissu histologiquement normal autour d&#39;un adénocarcinome du côlon ou autour d&#39;un adénome présentant une néoplasie avancée (bien sur la voie à un cancer du colon), mais à basse fréquence dans la muqueuse colique de patients sans néoplasie du côlon. En utilisant l&#39;immunohistochimie, cryptes totalité dans les 10 cm de chaque côté d&#39;adénocarcinomes du côlon ou avancé néoplasies coliques ont été trouvés pour être fréquemment réduite ou absente dans l&#39;expression de deux protéines de réparation de l&#39;ADN, PMS2 et / ou ERCC1. PMS2 est une protéine double rôle, actif dans la réparation de mésappariements de l&#39;ADN ainsi que nécessaires dans l&#39;apoptose des cellules avec des dommages à l&#39;ADN en excès. ERCC1 est actif dans la réparation de l&#39;ADN par excision de nucléotides. L&#39;expression réduite ou absente des deux ERCC1 et PMS2 serait de créer des cellules à la fois avec une capacité accrue pour survivre (résistance à l&#39;apoptose) et augmentation du niveau de la mutabilité. L&#39;expression réduite ou absente des deux ERCC1 et PMS2 est probablement une des premières étapes dans la progression vers le cancer du côlon. Gène Ku86 réparation de l&#39;ADN (actif dans l&#39;ADN non homologue fin de rejoindre) et sous-unité cytochrome c oxydase I (impliqués dans l&#39;apoptose) avaient chacun été signalé à être diminué dans son expression dans les zones proches de la muqueuse du côlon. Toutefois, l&#39;évaluation immunohistochimique de leurs niveaux d&#39;expression ont montré que de faibles fréquences aux modestes de cryptes d&#39;être déficient dans leur expression dans une anomalie du champ entourant le cancer du côlon ou autour avancés néoplasies coliques. Nous montrons, ici, notre méthode d&#39;évaluation des cryptes pour l&#39;expression de ERCC1, PMS2, Ku86 et CCOI. Nous montrons que la fréquence des cryptes toute déficientes pour PMS2 et ERCC1 est souvent plus grande que 70% à 95% dans 20 cm de long zones entourant une néoplasie du côlon, tandis que la fréquence des cryptes déficient en Ku86 a une valeur médiane de 2% et la fréquence des cryptes déficient en CCOI a une valeur médiane de 16% dans ces domaines. La totalité du côlon est de 150 cm de long (environ 5 pieds) et a environ 10 millions de cryptes dans sa couche muqueuse. Le défaut de PMS2 et ERCC1 entourant un cancer du côlon peut donc inclure 1000000 cryptes. Il est d&#39;une crypte défectueux qui pose le cancer du côlon.

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Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

Expression réduite / absent du PMS2 et / ou ERCC1 dans des cryptes entière est un événement fréquent dans les 10 cm de chaque côté d&#39;adénocarcinomes du côlon, probablement la base d&#39;une anomalie du champ avec la mutabilité élevée et la progression vers le cancer. La carence en Ku86 ou CCOI est beaucoup moins fréquent dans ces anomalies du champ.

PMS2 insuffisantes, ERCC1, Ku86, CCOI des défauts sur le terrain pendant la progression du cancer du colon

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

deficient-pms2-ercc1-ku86-ccoi-field-defects-during-progression-to

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K vues.  University of Arizona, Tucson. Expression réduite / absent du PMS2 et / ou ERCC1 dans des cryptes entière est un événement fréquent dans les 10 cm de chaque côté d'adénocarcinomes du côlon, probablement la base d'une anomalie du champ avec la mutabilité élevée et la progression vers le cancer. La carence en Ku86 ou CCOI est beaucoup moins fréquent dans ces anomalies du champ.

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Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and functional tissue. Matrix associated stem cell implants (MASI) aim to regenerate cartilage defects due to arthritic or traumatic joint injuries. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into cells of the chondrogenic lineage and have shown promising results for cell-based articular cartilage repair technologies. Autologous MSCs can be isolated from a variety of tissues, can be expanded in cell cultures without losing their differentiation potential, and have demonstrated chondrogenic differentiation in vitro and in vivo1, 2.
In order to provide local retention and viability of transplanted MSCs in cartilage defects, a scaffold is needed, which also supports subsequent differentiation and proliferation. The architecture of the scaffold guides tissue formation and permits the extracellular matrix, produced by the stem cells, to expand. Previous investigations have shown that a 2% agarose scaffold may support the development of stable hyaline cartilage and does not induce immune responses3.
Long term retention of transplanted stem cells in MASI is critical for cartilage regeneration. Labeling of MSCs with iron oxide nanoparticles allows for long-term in vivo tracking with non-invasive MR imaging techniques4.
This presentation will demonstrate techniques for labeling MSCs with iron oxide nanoparticles, the generation of cell-agarose constructs and implantation of these constructs into cartilage defects. The labeled constructs can be tracked non-invasively with MR-Imaging.

Goal of the presentation is to demonstrate a highly reproducible method to generate matrix associated stem cell implants in cartilage defects, which can be visualized with MR imaging. Stem cells are labeled with FDA-approved Ferumoxides, mixed with agarose, implanted into cartilage defects and imaged with a 7T MR scanner.

Implantation de Ferumoxides Étiqueté cellules souches mésenchymateuses humaines dans les lésions du cartilage

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Recherche

Biologie

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

Détermination de la contribution des systèmes d&#39;énergie pendant l&#39;exercice

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Analyse rapide de la génétique des épithélio-mésenchymateuse signalisation lors de la régénération des cheveux

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Mesure de la force lors de la contraction d&#39;évaluer la fonction musculaire en poisson zèbre

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolation des myofibroblastes primaires de souris et de tissus du côlon humain

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Détection de l&#39;épissage alternatif durant la transition épithéliale-mésenchymateuse

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Suivi temporel de la progression du cycle cellulaire par cytométrie en flux, sans la nécessité pour la synchronisation

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

Le murin déficients en Choline, additionné d’éthionine (CDE) alimentation modèle d’atteinte hépatique chronique

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction defects can be assessed by tracking methylene blue dye flow within the urinary system. Methylene blue dye is injected into the renal pelvis of perinatal embryonic kidneys and dye flow is monitored from the renal pelvis of the kidney through the ureter and into the bladder lumen after applying hydrostatic pressure. Dye accumulation will be evident in the bladder lumen of the normal perinatal urinary tract, but will be constrained between the renal pelvis and the end point of an abnormal ureter, if urinary tract obstructions occur. This method facilitates the confirmation of urinary tract junction obstructions and visualization of hydronephrosis and hydroureter. This manuscript describes a protocol for methylene blue dye injection into the renal pelvis to confirm urinary tract junction obstructions.

Methylene blue dye injection into the renal pelvis facilitates the assessment of urinary tract junction obstruction defects during mouse embryonic urinary tract development. Here, a protocol for methylene blue dye injection into the renal pelvis is described.

Évaluation des voies urinaires Junction Obstruction défauts par Injection de colorant de bleu de méthylène

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction ...