Les auteurs ont pas accusés de réception.

Les procédures expérimentales et traitement éthique des animaux a été approuvé par l&#39;Université de Pittsburgh IACUC (protocole # 1104674). 1. Préparation de la G6PD coloration Mélange NOTE: Assurez-vous que la concentration finale de chacun des réactifs est la suivante; 5 mM de glucose-6-phosphate (G6P); 2 mM de NADP, 5 mM de MgCl2, 1 mM de 0,35-méthoxy-5-méthylphénazinium sulfate de méthyle (MMPMS) et 0,8 mM NBT. 1,8,9 Pour chaque réactif, la concentration initiale a été obtenue pour un 40 ml de volume final. Des solutions ont été fraîchement préparés et utilisés chaque jour. <ol><li> Ajouter 2 ml de 200 mM pH 7,4 tampon phosphate (PB) à 35 ml de milieu PTOM un tube de 50 ml et agiter vigoureusement. Confirmez avec du papier pH que la solution est d&#39;environ pH 7,4. Si jetez pas la solution. </li><li> Ajouter 61 mg G6P dissous dans 0,94 ml de PB 200 mM, 61 mg PNDA dissous dans 0,94 ml de PB 200 mM, et 41 mg de MgCl2 dissous dans 0,96 ml de 100 mM PB. Reconfirmons que le pH est de 7,4 ~ esprith papier pH. Sinon ~ 7.4, jeter la solution. </li><li> Ajouter 5 mg de MMPMS dissous dans 0,25 ml de PB 200 mM (pH 7,4). Agiter vigoureusement le mélange réactionnel résultant pour générer un homogénat rouge foncé clair. Si la solution est trouble, le mélange doit être jetée. Le tube contenant le mélange de réaction est enveloppé dans une feuille de minimiser l&#39;exposition à la lumière. Stocker le mélange réactionnel à la température ambiante tandis que le composant final, NBT, est préparé. </li><li> Préparer séparément une solution NBT 5 mM en ajoutant 0,4 ml de formamide de diméthyle (DMF) anhydre et 0,4 ml d&#39;éthanol anhydre à 164 mg de NBT dans un tube de 2 ml avec un couvercle joint torique. Fermez le couvercle lâche (non étanche) et porter la solution à ébullition vigoureuse dans un bain d&#39;huile jusqu&#39;à ce que le NBT est en solution. 8 </li><li> Laisser le NBT solubilisé refroidir à température ambiante puis ajouter toute la solution au mélange de réaction PTOM et agiter vigoureusement pour obtenir une solution claire. Observez le changement de couleur de la solution de rouge-orange initial à un rouge foncé ou purpLe couleur au fil du temps. C&#39;est normal. </li><li> Placez le mélange final G6PD de coloration dans un 37 ° C pièce chaude pendant 1 heure avant utilisation. </li></ol> 2. Traitement des animaux et de collecte de tissus <ol><li> Traiter six semaines d&#39;âge souris C57BL / 6 mâles avec un agent endommageant l&#39;ADN, par exemple, 10 mg / kg azoxymethane (AOM) dans un volume de 200 ul de PBS par injection ip. Traiter les souris témoins avec 200 ul de PBS par injection ip. </li><li> À 90 jours, euthanasier les souris par le CO 2 asphyxie suivie par dislocation cervicale tel qu&#39;approuvé par le protocole IACUC. </li><li> Chirurgicalement ouvrir la cavité abdominale juste au-dessus de l&#39;anus de la base du sternum. Déplacer l&#39;intestin grêle hors de la cavité du corps, mais elle ne exciser. Exciser l&#39;intestin grêle juste en dessous du cæcum au rectum. 10 </li><li> Découper soigneusement le long d&#39;un côté du côlon en utilisant une paire de ciseaux micro-dissection et enlever les matières fécales du côlon ouvert propre par lavage avec du PBS stérile. Swiss roll le accised côlon avec la face luminale tournée vers l&#39;extérieur, et le placer dans un moule de tissu. 10 </li><li> Immerger complètement le côlon dans un PTOM, moyen et lieu moule dans un Dewar contenant de l&#39;azote liquide 2. Tenez le moule de sorte que la base en plastique est juste en contact avec le liquide N 2 jusqu&#39;à ce que le moyen PTOM gelé. </li><li> Rangez le bloc de tissu congelé à -80 ° C jusqu&#39;à la coupe des coupes congelées. Ne pas utiliser de fixateur, ce qui donnerait lieu à l&#39;inactivation de l&#39;enzyme de la G6PD. </li></ol> 3. Préparation des sections congelées <ol><li> Couper des sections de tissus congelés à une épaisseur de 7 pm en utilisant un cryostat à -25 ° C. Couper 4 7 um sections consécutives et placer deux d&#39;entre eux sur la même lame (Figure 1). Préparez 2 toboggans, quatre ou 7 um sections consécutives pour représenter un niveau du côlon (Figure 1). </li><li> Répéter pour le prochain niveau avec une distance minimale de&gt; 50 um à partir de la dernière section de la prEvious niveau. Cette distance est assuré que les cryptes évalués pour chaque niveau ne reproduisent pas les uns les autres. </li><li> Foire essuyer la lame de cryostat avec 100% d&#39;éthanol pour enlever le résidu des PTOM qui accumule pendant la coupe. Avant de sectionnement est reprise, la lame sec est essuyée avec une feuille sèche antistatique pour dissiper la charge statique accumulée. Stocker les lames avec les coupes congelées à -80 o C. </li></ol> 4. La coloration des tissus congelés Section <ol><li> Effectuer la réaction enzyme histochimie dans un 37 ° C chambre chaude avec une humidité élevée. REMARQUE: Tenter la réaction enzymatique dans un four d&#39;incubation ou sur une plus chaud de diapositives a conduit à une mauvaise et incohérente coloration en G6PD. </li><li> Construire des puits pour la coloration des tissus en utilisant deux 1,5 cm x 0,15 cm rondelles d&#39;acier (diamètre intérieur x hauteur) qui sont collées ensemble avec de la graisse de silicone (Figure 1). Couper le parafilm pour correspondre à la base du puits avec le centre découper et le lieu de biend sur la coupe de tissu sur la diapositive. Remarque: le parafilm sur le fond de la rondelle crée un joint entre le coulisseau et la rondelle qui maintient le mélange visqueux G6PD de coloration sur la coupe de tissu. Cette construction donne une bien avec un 0,4 - 0,5 ml de volume de sorte que chaque section de tissu dans l&#39;étude reçoit le même volume du mélange de réaction de coloration de la G6PD. </li><li> Incuber les lames de tissus congelés à 37 o C dans une pièce chaude pendant 10 min. A 37 ° C, ajouter le mélange de réaction G6PD de coloration à chaque section de tissu puits (2 sections par lame) pour 45-50 min. Retirer les lames de pièce chaude, et soulevez délicatement les puits en acier inoxydable au large des diapositives. </li><li> Ensemble lames sur leur grand côté pour permettre au milieu réactionnel au drain. Placer les lames dans 100 mM PB (pH 7,4) pendant 30 à 60 minutes pour éliminer le mélange de réaction G6PD de coloration du tissu sans perturber la coloration des tissus. Plonger les lames dans de l&#39;eau distillée pendant 5-10 min pour éliminer les sels PB </li><li> Sceller le tissu par adjonctioning fluoro-gel à partir d&#39;un compte-gouttes sur le tissu et d&#39;attente ~ 30 min pour le sécher. Éviter les bulles qui peuvent confondre l&#39;identification des cryptes mutés. Remarque: si des bulles se forment, la procédure peut être répétée après enlèvement de la fluoro-gel par trempage dans de l&#39;eau distillée. Ne pas utiliser des lamelles comme ils ont tendance à bulles d&#39;air piège. </li></ol> 5. Détermination de la G6PD Mutant cryptes et Mutation Fréquence <ol><li> Analyser diapositives pour G6PD cryptes mutantes sous un microscope optique. REMARQUE: Les critères utilisés pour identifier une crypte entièrement mutant étaient: (i) la totalité de la crypte était dépourvue de couleur bleue; (ii) la structure externe de la crypte était intact, (iii) le mutant a été observé crypte de 7 um sections adjacentes et, (iv) deux observateurs ont pour identifier le même crypte comme un mutant. Mutants observés sur 7 um sections adjacentes sont comptés comme un seul mutant. </li><li> Chaque image crypte mutant G6PD à un grossissement de 40x et de cataloguer les images à l&#39;aide d&#39;un appareil photo 5,0 mégapixels avecun logiciel d&#39;imagerie. </li><li> Quantifier le nombre total de cryptes examinés dans une souris en sélectionnant une section représentant pour chaque souris à partir du niveau de la surface plus petite et de l&#39;image au moment de grossissement de 10x (figure 1C). REMARQUE: Un niveau représente quatre 7 um sections consécutives (figure 1D), qui en raison de leur proximité montrent souvent mutés cryptes sur plus d&#39;une section. Les niveaux sont séparés par&gt; 50 um à visualiser cryptes de différentes régions du côlon. </li><li> Ouvrez chaque fichier image et comptez visuellement le nombre de cryptes sur un niveau en analysant les fichiers (représentées par des cases dans la figure 1C). Fichiers Images varient dans le nombre de cryptes observées d&#39;aussi peu que 20 à&gt; 300 cryptes dans un seul fichier. </li><li> Multipliez le nombre total des cryptes du niveau sélectionné (figure 1C) pour chaque souris par le nombre de niveaux de dépistage du G6PD cryptes mutantes pour chaque colon. Par exemple, un nombre total de1250 cryptes par niveau choisi multiplié par 8 niveaux projetés pour cryptes mutantes est égal à un nombre total de 10.000 cryptes. Évaluer un minimum de 10.000 cryptes pour chaque colon pour l&#39;analyse statistique. </li><li> Combinez le nombre de mutants observés dans tous les animaux par le nombre total de cryptes projetés pour calculer le MF pour chaque traitement. Le niveau MF de cellules souches de fond dans les souris non traitées est &lt;0.1x10 -4 (tableau 1), qui est proche de celle précédemment rapportée dans C57BL / 6. 11 </li></ol>

<ol>
	<li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry.">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li><li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours.">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li><li>Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+susceptibility+to+colonic+stem+cell+somatic+mutation+in+three+strains+of+mice.">Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice.</a> J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).</li><li>Whetstone, R. D., Gold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cells+Enhance+Stem+Cell+Mutagenesis+in+the+Mouse+Colon.">T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon.</a> Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase.">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency.">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li><li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon:+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation.">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Souvent l&#39;effet génotoxique d&#39;un composé est déterminée par sa capacité à modifier l&#39;ADN. Cela se fait normalement en isolant le tissu et la mesure du niveau global d&#39;adduits d&#39;ADN. Pour AOM, cela impliquerait quantifier O 6 -méthylguanine adduits dans le côlon. En utilisant cette information d&#39;approche sur les dommages dans des types cellulaires spécifiques, comme dans la niche de cellules souches, est perdu. En outre, un produit d&#39;addition d&#39;ADN est pas de même d&#3...

Le cancer du côlon est pensé pour impliquer une exposition à des agents environnementaux et composants alimentaires qui peuvent endommager l&#39;ADN et de produire des mutations activatrices somatiques dans oncogènes (par exemple, la ß-caténine) ou d&#39;inactiver les mutations dans les gènes suppresseurs de tumeurs (par exemple, APC). On suppose que ces mutations se produisent dans les cellules critiques souches du côlon. En raison de l&#39;architecture de la crypte unique de l&#39;épithélium du côlon, il est possible de mesurer des mutations de cellules souches dans le côlon après avoir exposé les animaux à des produits chimiques associés à la cancérogenèse colique. Plusieurs enzymes liées au chromosome X peuvent servir d&#39;indicateurs pour des mutations qui se produisent dans les cellules souches, comme les mutations seront présentes dans toutes les cellules au sein d&#39;une crypte. Auparavant, une procédure a été publiée démontrer que les produits chimiques qui induisent des tumeurs du côlon chez les souris générées également des mutations de cellules souches somatiques dans le côlon par l&#39;intermédiaire d&#39;une analyse de mutations de la glucose-6-phosphate déshydrogénase liée à l&#39;X (G6PD) gène 1-3.La méthode quantifie l&#39;incidence des mutations somatiques aléatoires dans les cellules souches du côlon sans aucune pression de sélection. La procédure implique la production de sections congelées non fixées du côlon de souris traitées et de contrôle et l&#39;identification des cryptes dépourvues de cellules qui produisent l&#39;activité de la G6PD fonctionnel. Ces cryptes mutées, qui apparaissent blancs, indiquent que la mutation a eu lieu dans une cellule souche qui a donné lieu à une progéniture hébergeant également gène G6PD mutant. Dans le dosage enzymatique, G6PD mutant déficient cryptes peuvent pas oxyder le glucose-6-phosphate, qui est nécessaire pour la réduction du nitro bleu de tétrazolium (NBT). Lorsque l&#39;enzyme est fonctionnelle en G6PD, le NBT dans le mélange de coloration est réduite à formazan insoluble et précipités, l&#39;accumulation à l&#39;emplacement de l&#39;enzyme et des cellules &quot;bleues&quot; de coloration. Les cellules qui sont des mutants de la G6PD restent blanchâtre à la différence de cryptes colorés bleus de type sauvage. Cette méthode permet de mesurer les mutations qui ont un phénotype «nulle». Parce que enenzymes, comme la G6PD, peut diffuser hors des cellules sur une section de tissu non fixé si les articles sont placés dans une solution aqueuse, il est nécessaire de stabiliser l&#39;enzyme dans les sections de tissu à analyser. 4 La stabilisation de l&#39;enzyme dans le le tissu ne doit pas interférer avec la diffusion de petites molécules nécessaires à la réaction enzymatique en G6PD de réactifs. Nous avons fait un certain nombre de changements importants dans la procédure initiale. Le milieu pour la coloration enzymatique critique a été modifié à partir de l&#39;alcool polyvinylique à Optimal Cutting Température composé (OCT), ce qui facilite le contrôle du pH et la solubilisation des composants utilisés dans l&#39;essai. La coloration est effectuée en utilisant 0,4 - 0,5 ml puits en rondelles en acier de sorte que chaque section de tissu a reçu le même volume de mélange de réaction de la G6PD. Une procédure a été développée pour estimer le nombre de cryptes dans une section imagée qui fournit un grand échantillonnage du tissu du côlon, sans avoirde compter manuellement&gt; 10 5 cryptes pour chaque colon. L&#39;analyse des coupes de tissus adjacents 7 um permet la visualisation d&#39;une crypte mutant sur plus d&#39;un coulisseau, ce qui permet de réduire des artefacts de coloration potentiels. Ces changements rendent la procédure plus efficace et reproductible. En utilisant ce protocole révisé, nous avons quantifié la fréquence de mutation dans les cellules souches du côlon après exposition des souris C57BL / 6 à azoxyméthane, un cancérogène du côlon bien connu chez les rongeurs. 5-7

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitroblue tetrazolium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose-6-phosphate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope equipped with 5 megapixel camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryostat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm room&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of  colonic stem cell mutations

La capacité de mesurer les mutations de cellules souches est un outil puissant pour quantifier dans une population de cellules critique si, et dans quelle mesure, un produit chimique peut induire des mutations qui conduisent potentiellement à un cancer. L&#39;utilisation d&#39;un dosage enzymatique pour quantifier des mutations de cellules souches dans le gène de la glucose-6-phosphate-déshydrogénase liée au chromosome X a été indiqué précédemment. 1 Ce procédé nécessite la préparation de coupes congelées et incubation du tissu sectionné avec un mélange de réaction qui donne un couleur bleue si les cellules produisent fonctionnelle glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD) enzyme. Si non, les cellules apparaissent blanchâtres. Nous avons modifié le mélange réactionnel en utilisant Optimal Cutting Temperature composé (OCT) moyen à la place de l&#39;alcool de polyvinyle. Ceci facilite la mesure de pH, augmente la solubilisation des composants de coloration de la G6PD et limite la diffusion de l&#39;enzyme G6PD. Pour démontrer que la mutation a eu lieu dans une cellule souche, l&#39;ensemble doit crypte manque G6PD enzymatiqueactivité. Seulement si une cellule souche abrite une mutation G6PD phénotypique sera tout de la descendance dans la crypte manquer activité enzymatique en G6PD. Pour identifier les cryptes avec une mutation de cellules souches, quatre coupes congelées adjacentes consécutives (un niveau) ont été coupées à 7 um d&#39;épaisseur. Cette approche de faire des coupes adjacentes conformation qui fournit une crypte a été entièrement muté depuis la même crypte muté sera observée dans les sections adjacentes. Diapositives avec des échantillons de tissus qui étaient plus de 50 um part étaient prêts à évaluer d&#39;un total de&gt; 10 4 cryptes par souris. La fréquence de mutation est le nombre de mutés (blanc) cryptes Observée ÷ par le nombre de type sauvage (bleu) cryptes dans un groupe de traitement.

La capacité de mesurer les mutations de cellules souches du côlon chez les animaux offre un moyen unique de corréler des mutations à l&#39;induction du cancer. Normalement, il est supposé que l&#39;étape critique dans la carcinogenèse implique l&#39;activation des mutations dans des oncogenes et / ou inactiver les mutations dans les gènes suppresseurs de tumeurs. Nous avons injecté souris C57BL / 6 avec 200 pl de PBS ou de 10 mg / kg AOM dans 200 ul de PBS. AOM est un cancérogène du côlon connue. 5-7</s...

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Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Quantification des souches du côlon mutations de cellules

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

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Research

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Developmental Biology

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Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, they lack hormone responsiveness and the overall procedure is cost-intensive. &#8220;Biological pacemakers&#8221; generated from PSCs may become an alternative, yet the typical content of pacemaker cells in Embryoid Bodies (EBs) is extremely low. The described protocol combines &#8220;forward programming&#8221; of murine PSCs via the sinus node inducer TBX3 with Myh6-promoter based antibiotic selection. This yields cardiomyocyte aggregates consistent of &#62;80% physiologically functional pacemaker cells. These &#8220;induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) are spontaneously contracting at yet unreached frequencies (400-500 bpm) corresponding to nodal cells isolated from mouse hearts and are able to pace murine myocardium ex vivo. Using the described protocol highly pure sinus nodal single cells can be generated which e.g. can be used for in vitro drug testing. Furthermore, the iSABs generated according to this protocol may become a crucial step towards heart tissue engineering.

This protocol describes how to produce functional sinus nodal tissue from murine pluripotent stem cells (PSC). T-Box3 (TBX3) overexpression plus cardiac Myosin-heavy-chain (Myh6) promoter antibiotic selection leads to highly pure pacemaker cell aggregates. These &#8220;Induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) contain over 80% pacemaker cells, show highly increased beating rates and are able to pace myocardium ex vivo.

Génération de stimulateur cardiaque murin agrégats de cellules fondées sur la ES-Cell-programmation en combinaison avec MYH6-promoteur-sélection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

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Biologie du développement

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &amp;#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Automated quantification des cellules hématopoïétiques - Interactions cellulaires stromales dans les images histologiques de décalcifiées os

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Génération des cultures organotypiques de peau génétiquement modifiées en utilisant Dévitalisées derme humain

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

Protocoles pour analyser le rôle des cellules de Paneth dans la régénération de l&#39;intestin murin utilisant conditionnelle<em&gt; Cre-lox</em&gt; Modèles de souris

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingénierie des microenvironnements humanisés de la moelle osseuse dans la souris et leur visualisation par imagerie en direct

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

Évaluation des lésions induites par la sénescence et In Vivo reprogrammation dans le Muscle squelettique

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines en cellules hépatiques

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Analyse du développement de la chambre cardiaque durant l’embryogenèse de souris à l’aide de toute monture épifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro when stem cells are spatially confined onto micropatterns, thus setting up experimental models which offer unique opportunities to identify, in vitro, the fundamental principles of biological organisation.
Here we describe our own implementation of the methodology. We adapted a photo-patterning technique to reduce the need for specialized equipment to make it easier to establish the method in a standard cell biology laboratory. We also developed a free, open-source and easy to install image analysis framework in order to precisely measure the preferential positioning of sub-populations of cells within colonies of standard shapes and sizes. This method makes it possible to reveal the existence of patterning events even in seemingly disorganized populations of cells. The technique provides quantitative insights and can be used to decouple influences of the environment (e.g., physical cues or endogenous signaling), on a given patterning process.

The method presented here uses micropatterning together with quantitative imaging to reveal spatial organization within mammalian cultures. The technique is easy to establish in a standard cell biology laboratory and offers a tractable system to study patterning in vitro.

Cartographier l'organisation spatiale émergente des cellules mammifères à l'aide de micromodèles et d'imagerie quantitative

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...