Cette nouvelle méthode de cultures sphéroïdes peut être utilisée pour étudier la tumorigénicité pour analyser la présence de différentes populations de cellules souches cancéreuses et peut également être bien appliquée pour par le biais d’un dépistage élevé pour de nouveaux médicaments. Il s’agit d’un système de culture robuste et répétitif pour générer un grand nombre de sphéroïdes de taille homogène. De plus, ces sphéroïdes peuvent être utilisés pour étudier les cellules souches cancéreuses.
Cette méthode est mise en place pour étudier la biologie du cancer chronique, mais elle peut être facilement mise en place pour étudier d’autres cancers en modifiant les conditions de culture 3D. Assurez-vous de surveiller les bulles dans le milieu, de ne pas trop déplacer la plaque pendant la formation des sphéroïdes et d’être prudent lors de la récolte des sphéroïdes dans la passoire. Commencez par prétringer les puits d’une plaque de 24 puits avec 500 micro litres de solution de rinçage anti-adhérence par puits.
Après quelques secondes centrifuger la plaque dans le rotor à godet oscillant et rincer chaque puits avec 2 millilitres de milieu basal chaud. Observez la plaque au microscope pour vous assurer que les bulles ont été complètement retirées des micro-puits. Si aucune bulle n’est observée, rincez à nouveau les puits avant d’ajouter un millilitre de milieu matriciel chaud de membrane de sous-sol DMEM à chaque puits.
Pour induire la formation de sphéroïdes, voir la concentration souhaitée de cellules Caco-2 dans une couche mono 2D dans un plat de 10 centimètres dans le DMEM complété avec 10% FBS et 1% antibiotiques. Pour la culture à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans une atmosphère humidifiée. Lorsqu’une confluence de 80% est atteinte, laver les cellules avec cinq millilitres de PBS avant de traiter la culture avec deux millilitres de Trypsine-EDTA pendant deux à cinq minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Lorsque les cellules se sont détachées, neutralisez la trypsine avec quatre millilitres de DMEM complet. Après comptage, recueillir les cellules par centrifugation et ressusciter la palette dans le volume approprié de milieu matriciel de membrane de sous-sol DMEM pour atteindre la concentration souhaitée de cellules dans un millilitre de milieu par puits. Ajoutez un millilitre de cellules à chaque puits de la plaque prépayée de 24 puits, suivi de l’ajout d’un millilitre de milieu matriciel de membrane de sous-sol DMEM à chaque puits.
Après l’ensemencement, centrifugez immédiatement la plaque et utilisez un microscope optique pour vérifier que les cellules ont été réparties uniformément dans les micro-puits. Placez ensuite la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures sans perturber les cellules. Pour récolter les sphéroïdes, à la fin de l’incubation, utilisez une pipette sérologique et la moitié du surnageant dans chaque puits pour déloger doucement les sphéroïdes de leurs micro-puits.
Lorsque tous les sphéroïdes ont été détachés, utilisez la pipette pour transférer soigneusement les cultures 3D de chaque puits vers une passoire réversible de 37 microns au-dessus d’un tube conique de 15 millilitres. Lavez chaque puits trois fois avec un millilitre de milieu basal pré-feu par lavage pour collecter les sphéroïdes restants et ajoutez ces sphéroïdes supplémentaires à la passoire. Après le dernier lavage, vérifiez la plaque au microscope pour confirmer que tous les sphéroïdes ont été retirés des micro-puits.
Ensuite, inversez la passoire sur un nouveau tube de 15 millilitres et lavez le fond de la passoire avec un milieu de matrice de membrane de sous-sol DMEM frais pour recueillir les sphéroïdes dans le tube. Les sphéroïdes s’élèvent de 500 cellules démontrent l’augmentation la plus homogène de la taille au fil du temps. Avec 500 et 600 cellules par sphéroïde, déterminez le nombre optimal de cellules sous lesquelles une bonne croissance et une faible variabilité peuvent être obtenues.
L’ajout de la matrice de membrane de sous-sol améliore la croissance et l’homogénéité de sphéroïde. Dans la culture à long terme, les cellules apparaissent sous forme de multi-couches denses au troisième jour. Alors que les cellules aplatir disposées en couches mono sont clairement visibles au jour 10.
Fait intéressant, une lumière apparaît dans les sphéroïdes à partir du cinquième jour. En outre, une nette augmentation des cellules proliférantes cellules nucléaires antigène positif est observée aux jours cinq et sept qui diminue au jour 10. Étonnamment, Caspace activé 3 est observé dans très peu de cellules aux jours trois et cinq seulement.
Alors que des niveaux élevés d’expression de la bêta-caténoine sont observés à chaque point de temps. Le potentiel des sphéroïdes à se différencier en anterosites est démontré par leur phosphatase alcaline et soluté famille 2A5 ADN messagère expression. En outre, ces sphéroïdes expriment les marqueurs typiques de cellule souche de cancer et répondent aux traitements de chimiothérapie de combinaison habituellement administrés aux cancéreux côlorectaux.
Ainsi, les sphéroïdes sont composés de différentes populations cellulaires. Ils peuvent ensuite être bien utilisés pour analyser les réponses spécifiques des cellules aux stimuli tels que les réfractaires et éventuellement pour les réponses médicamenteuses.
