Notre protocole a utilisé l’ARN-Seq et les outils bioinformatiques pour découvrir rapidement les gènes conducteurs surexprimés qui contribuent à la formation de tumeurs colorectales en forme de tige. Ce protocole est utilisé pour dépister un gène et des voies de signal exprimés différemment afin d’étudier un mécanisme moléculaire de la stemness du cancer dans un cancer colorectal sélectif. Le septième jour de la culture, utilisez un microscope inversé avec un système d’imagerie cellulaire numérique pour observer et mesurer le diamètre des tumorsphère.
Lorsque les tumorspheres atteignent un diamètre supérieur à 100 micromètres, traiter la culture avec 0,25% trypsine. Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, neutraliser la trypsine avec deux fois le volume du milieu de croissance et compter les cellules à l’aide d’un hémomètre. Recueillir les cellules par centrifugation.
Et résuspendez la pastille à cinq fois 10 aux quatre cellules pour 100 microlitres de concentration moyenne. Ajouter deux microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt à chaque tube et incuber les cellules pendant 30 minutes à température ambiante et 200 révolutions par minute. À la fin de l’incubation, laver chaque tube avec 900 microlitres de PBS et analyser les cellules pour l’expression de la protéine d’intérêt par cytométrie de flux selon les protocoles standard.
Pour l’isolement d’ARN après la collection de trypsine comme juste démontré, résuspendez les cellules à deux fois 10 aux cinquièmes cellules par 50 microlitres de concentration de PBS et lyse chaque échantillon avec 200 microlitres de tampon de lyse complétés avec deux microlitres de bêta mercaptoethanol par tube. Après un bref vortex et une incubation de cinq minutes à température ambiante, recueillir les lysates par centrifugation et ajouter 200 microlitres de 70% d’éthanol à chaque tube. Transférer les échantillons dans des colonnes rapides et retirer le solvant par centrifugation.
Lavez les échantillons avec 400 microlitres de solution de lavage une et 600 microlitres de solution de lavage deux pour éliminer complètement tout non-ARN par centrifugation, suivie d’une centrifugation supplémentaire de deux minutes dans les mêmes conditions de centrifugeuse pour éliminer tout éthanol résiduel. Puis resuspendez les granulés dans 50 microlitres d’eau distillée par tube et centrifugez l’échantillon pendant une minute avant de recueillir l’ARN contenant des supernatants. Étudier l’expression différentielle du gène entre les cellules tumorales par rapport aux cellules tumorales parentales après analyse du séquençage de l’ARN.
Sélectionnez les gènes avec un changement de pli de plus d’un à moins un log2 avec des comptes de lecture supérieurs à 100 dans la tumorsphère et les groupes parentaux. Et utilisez les commandes comme indiqué. Pour obtenir une parcelle volcanique des données pour déterminer l’expression différentielle du gène.
Pour la sélection des gènes d’entraînement chez l’analyste réseau, sélectionnez l’entrée unique du gène et copiez et coller les gènes surexprimés sélectionnés avec l’homme spécifié comme l’organisme et le symbole génétique officiel comme type d’identification. Cliquez sur Télécharger et procéder. Pour insérer et analyser les données à l’aide de l’interaction protéine-protéine, après interaction protéine-protéine génétique, utilisez la base de données interactome STRING avec un score de confiance coupé de 900 pour montrer les gènes des graines.
Relier les gènes téléchargés. Les gènes de semence s’associant à des gènes plus individuels peuvent être sélectionnés comme gènes conducteurs qui peuvent être impliqués dans le maintien de la formation de la tumorsphère. Sélectionnez Procéder dans la vue d’ensemble de cartographie blanc dans l’arrière-plan et l’atlas de force dans le bouton Mise en page.
Sélectionnez ensuite la paire de base PANTHER pour analyser le groupe génétique d’upregulation. Tumorspheres de plus de 100 micromètres de diamètre se forment dans les sept jours de la culture. L’analyse cytométrique de flux indique une augmentation de l’expression de LGR5 et de CD133 dans les tumeurs HT29-dérivées comparées aux cellules parentales de HT29.
Après séquençage de l’ARN, les gènes ayant un changement plus important d’un pli log2 dans leur réglementation à la hausse ou à la baisse avec une valeur P inférieure à 0,05 déterminée par la carte thermique peuvent être tracés pour distinguer les gènes significatifs entre les tumeurs dérivées de HT29 et les cellules parentales HT29. Dans cette expérience représentative, l’analyse des gènes upregulated avec plus d’un pli log2 a abouti à 10 gènes de semences, reliant les réseaux génétiques. L’analyse de paire de base panther a indiqué que deux gènes ont été associés à la régulation négative de l’apoptose.
En outre, les gènes choisis ont été par conséquent validés par PCR quantitatif confirmant leur expression accrue dans les tumeurs HT29-dérivées. La sélection différentielle des gènes est l’étape la plus importante des procédures. N’oubliez pas d’utiliser un changement de pli log2 supérieur à un avec des recomptages supérieurs à 100 comme critères.
En utilisant ce protocole, les gènes sélectionnés parmi les tumeurs dérivées du colorectal peuvent être renversés ou surexprimés pour découvrir leurs rôles potentiels dans la formation de tumorsphère.
