Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche pour prévenir la cécité (Bourses de développement de carrière à MEZ et ASV et une subvention sans restriction à du Département d&#39;ophtalmologie), la Fondation E. Matilda Ziegler (MEZ et ASV) et le National Eye Institute / NIH (MEZ , les subventions et R01EY015748 R01EY017964).

Partie I. Mise en place pour le test ACT <ol><li> Générer ARN coiffé d&#39;injection tel que suggéré par le fabricant, en utilisant leur phénol: chloroforme méthode de purification (par exemple mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). ARN codant pour une protéine fluorescente est utilisée comme traceur. On supporte transcrire protéine fluorescente jaune (YFP) ou mCherry 5 ADNc, qui est dans un vecteur d&#39;expression pCS2 +. </li><li> Tirez tubes en verre borosilicate capillaires pour former conseils verre conique à l&#39;aide d&#39;un extracteur micropipette. Nous utilisons Sutter Micropipette Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc, Novato, CA), comme décrit précédemment 6. </li><li> Assurez solutions stériles dans le tableau 1 à partir d&#39;un 10 X Marc jour Ringer (ROR) solution mère (10 mM de MgCl2, 20 mM de KCl, 20 mM CaCl2, 50 mM d&#39;HEPES, 1 M de NaCl, ajusté à pH 7,5, autoclave et stockés à RT). </li><li> Isoler les testicules d&#39;un homme grenouille et le tissu stocker à 4 ° C dans une solution stérile de1X MMR / gentamicine (50 pg / ml de sulfate de gentamicine; BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Cela peut se faire jusqu&#39;à une semaine avant le début de l&#39;expérience, mais il est perd de son efficacité au fil du temps. </li><li> Solution de ponte (1X: 150 mM de NaCl, 2,62 mM de KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mM Trizma de base, 2,62 mM NaHCO 3 et 2,75 mM MgSO 4, ajusté à pH 7,6) peut être faite comme un stock 8X, qui peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu&#39;à deux semaines. Remarque: attention à la contamination dans cette solution, car cela aura une incidence sur la qualité de vos oeufs. </li><li> Générer des plaques d&#39;injection. Pour ce faire, faire fondre 1% d&#39;agarose dans ROR 0.4x dans un micro-ondes, ajouter ~ 6 ml solution fondue agarose en 60 plaques mm, doucement dérouler un moule en élastomère (figure 1) au-dessus de la solution pour éviter les bulles et laisser refroidir pendant environ 20 minutes à température ambiante. Pour déterminer le nombre nécessaire, considérez le nombre de conditions expérimentales (par exemple 1, YFP, 2, YFP + Noggin) et le nombre de embry hôte transplanté<html> OS besoin. Pour nos expériences, nous générons au moins 20 embryons transplantés d&#39;accueil pour chaque condition expérimentale. À 18-19 ° C, les embryons seront à l&#39;étape 15 pendant environ une heure. Si cela prend une heure pour effectuer 20 greffes, puis deux points dans le temps de fertilisation sont nécessaires, en supposant que les embryons hôtes acceptent toutes les greffes. Par conséquent, quatre plats d&#39;injection sera nécessaire (2 conditions exp x 2 points dans le temps de fécondation = 4). Stocker les plaques à 4 ° C pendant une semaine. </li><li> Générer des plaques d&#39;isolation en utilisant capitalisation agarose à 1% + 0,7 X MMR avec des moules que pour la plaque d&#39;injection. Faire le même nombre de plaques d&#39;isolation bouchon en plus une injection supplémentaire de points par unité de temps la fécondation (4 + 2 points dans le temps de fécondation = 6). </li><li> Injecter femelles avec 500 unités de gonadotrophine chorionique humaine en fin de journée la veille de la micro-injection. Boutique femelles à 16-18 ° C pendant la nuit. </li></ol> Partie II. La micro-injection d&#39;ARN d&#39;embryons de Xenopus laevis étape &quot;&gt; A. Préparation de la micro-injection <ol><li> Retirer des femmes hormonale induite et les placer dans des réservoirs individuels contenant 1X ponte solution (ELS). Remarque: nous n&#39;utilisons pas les œufs qui ont été dans les ELS plus de deux heures que la qualité des œufs est réduite. Par conséquent, environ une heure avant la fécondation in vitro, nous supprimons tous les œufs dans le bac afin que les œufs fraîchement pondus ne sont collectées. </li><li> Préparer l&#39;aiguille pour la microinjection en coupant la pointe pour obtenir un diamètre de 25 à 35 um. Placer l&#39;aiguille sur le picoinjector et l&#39;étalonner de sorte qu&#39;il distribue 10 nl par injection. </li><li> Définir un incubateur à 14 ° C. </li><li> Une fois que les femelles ont pondu pendant environ une heure, retirer les œufs dans le bac à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert et les placer dans des boîtes de 60 mm de Pétri. Enlever le ELS bien des œufs que possible et remplacer par 1X ROR. Les œufs peuvent être fécondés tout de suite ou rester dans ROR 1X pour jusqu&#39;à une heure. Pour le dosage de transplantation, il estmieux pour fertiliser deux plats, 80% complets d&#39;une seule couche d&#39;œufs dans un maximum de trois lots distincts vers 11 h, midi et 13 heures. Après l&#39;injection, ils seront placés à 14 ° C afin qu&#39;ils atteignent les étapes souhaitées pour l&#39;isolement du bouchon (stade 8,5 à 9) et de la transplantation (étape 15; voir Partie I, n ° 6 ci-dessus). </li><li> Pour vérifier la qualité des testicules, nous procédons à une fertilisation tôt le matin (~ 8 heures), ce qui nous permet d&#39;extraire les testicules d&#39;un autre mâle si le sperme du premier n&#39;est pas viable. Note: nous homogénéiser ~ 0,25 testicules dans 1 ml MMR 1X et ajouter environ 5 à 7 gouttes par plaque d&#39;ovocytes. </li><li> In vitro, la fécondation des oeufs avec des testicules homogénéisés et, une heure plus tard, enlever la couche de gelée sur les oeufs à l&#39;aide de la gelée de solution (1M 164μl TNT + 10 ml de Tris 1M, pH 8,8 à 50 ml d&#39;eau nanopure à l&#39;autoclave). Attendez jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent deux cellules étape pour commencer le tri, ce qui prend environ 2 heures à 18 ° C ou 1,5 heures à température ambiante (22 ° C). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un transfoer pipette, en quelque sorte uniformément pigmentés et uniformément divisant embryons, comme indiqué dans le chapeau animale gauche de la figure 3, dans le puits d&#39;injection d&#39;un plat rempli de 0.4x ROR + 6% de Ficoll. </li></ol> Microinjection B. <ol><li> Étirer Parafilm sur le dessus du couvercle d&#39;une boîte de Petri de 60 mm. Prélever 2 l de votre échantillon d&#39;ARN d&#39;abord sur le Parafilm et aspirer l&#39;aide de la PLI-100 pour remplir votre aiguille d&#39;injection. N&#39;oubliez pas de vérifier que l&#39;aiguille est encore distribuer 10 nL d&#39;échantillon avant de commencer l&#39;injection. </li><li> Injecter 20-30 embryons au stade de deux cellules (blastomères deux) avec 500 pg d&#39;ARN YFP dans un plat et votre gène d&#39;intérêt (par exemple 20 pg d&#39;ARN Noggin) plus YFP ARN dans un autre plat 7. </li><li> Lieu 100-200 non injectables embryons par point de temps à autre plat d&#39;injection de la solution de Ficoll. Les déplacer dans et hors de l&#39;incubateur en même temps que les embryons injectés. Ce sont les hôtes qui seront utilisés dans la partie IV. </li><li> Après l&#39;injection, incuber tous les embryons à 14 ° C overnight. Répétez l&#39;opération pour tous les points dans le temps. </li></ol> Partie III. Isoler calottes animales à partir d&#39;embryons injectés <ol><li> Arrivez tôt le matin pour organiser les embryons. Le point plus tôt devrait être à l&#39;étape 9. Supprimer ceux qui n&#39;ont pas survécu. Poursuivre avec les étapes de travail suivantes à chaque point dans le temps par lots. </li><li> Décanter la solution de Ficoll à partir de chaque assiette et ajouter MMR retour 0.7X / solution de gentamicine. Pour un plat d&#39;isolation plafond, ajouter une quantité généreuse de 0,7 X MMR / gentamicine solution. Déloger les embryons de leurs puits d&#39;injection de plat à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert et le placer dans le plat isolement bouchon fraîchement préparé. </li><li> Isoler calottes animales en 0.7X MMR solution + gentamicine, avec 2 ou 3 embryons intacts pour la mise en scène. Soit le Gastromaster, muni d&#39;une pointe jaune plié à 400 um, ou une paire de pinces 5 Numéro forte peut être utilisé. </li><li> Placer des bouchons de retour dans 14 incubateur ° C jusqu&#39;au lendemain. Les embryons d&#39;accueil devraient être retirées de l&#39;incubateuren même temps que les chapeaux de les garder au même stade de développement que le tissu du donneur. </li></ol> Partie IV. La transplantation de bouchons sur le flanc <ol><li> Retirer les capuchons et les embryons du point première fois de l&#39;incubateur 14 ° C et organiser les embryons. Trier par uniformes jaune ou rouge fluorescent positifs casquettes, selon le traceur injecté (figure 2). </li><li> Comptez le nombre de caps et de supprimer le double du nombre d&#39;étages 12 à 13 embryons dans un plat fraîchement préparée avec injection de 0,7 X MMR / gentamicine solution. Avec des pinces ° 5 pointues, retirez la membrane vitelline de chacun. Transférez-les sur la plaque avec les bouchons, mais soyez prudent. Sans leurs membranes vitellines, les embryons peuvent rapidement se dissocient à la surface de l&#39;eau. </li><li> Utilisation de la gastromaster (pointe jaune, 200 250 pm fil plié, réglage le plus élevé) ou n ° 5 pinces, retirez de 200 um carrés sur le côté de l&#39;embryon au stade 14-15 (figure 3). Ensuite, coupez un chapeau de moitié (à l&#39;gastromaster ou til # 5 forceps) et de placer le tissu dans le trou pratiqué dans l&#39;embryon hôte. Tournez l&#39;embryon contre le bien pour permettre la cicatrisation. Faites cela pour que les embryons que vous pouvez alors qu&#39;ils sont à l&#39;étape 15. Répétez l&#39;opération pour tous les points dans le temps. </li><li> L&#39;embryon se guérissent habituellement dans les 30 minutes. Éliminer les cellules mortes (blanc) avec un léger mouvement de brossage avec une pince n ° 5. Cultivez-les à 18 ° C pendant la nuit. </li><li> Sous la loupe binoculaire à fluorescence, les embryons de tri avec marquée par fluorescence, tissu transplanté. Remettez-les à 18 ° C pour se développer jusqu&#39;au stade 42-43. </li><li> Anesthésier les animaux dans tricaïne. À ce stade, vous pouvez prendre des photos sous un microscope à fluorescence de dissection. Une fois que vous avez terminé, fixer, section et coloration immunologique ou d&#39;effectuer l&#39;hybridation in situ en utilisant des marqueurs pour votre tissu d&#39;intérêt. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Conception de plexiglass pour la coulée de la m élastomèreancien utilisé pour la fabrication des plats de détention d&#39;embryons. A 38 x 38 mm carré aux angles arrondis (~ 5 mm de profondeur) a été acheminé sur un morceau de plexiglas qui est de 50 x 50 mm carré et de 25 mm d&#39;épaisseur. Circulaire, régulièrement espacés les puits (1,5 mm de diamètre) ont été forés 1 mm de profondeur dans la matière plastique. Pour faire le moule en élastomère pour les plats micro-injection, nous avons versé élastomère Sylgard dans le plexiglas et lui a permis de se solidifier, selon les instructions du fabricant. Ce moule en élastomère est utilisé pour fabriquer des plaques d&#39;isolation par injection et le chapeau. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Bouchon de tri des animaux avant la transplantation est importante, car l&#39;expression peut varier. Bouchon animale sur la gauche exprime mCherry uniformément dans les tissus tandis que l&#39;explant sur ​​le droit a l&#39;expression inégale et seront rejetées. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Un hôte TADPole a développé une structure oculaire comme sur son flanc transplantés à partir de cellules de la coiffe des animaux. Une image fluorescente a été superposée sur l&#39;image en fond clair.

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	<li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+cloning+of+noggin,+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos.">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li><li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin.">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li><li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Methods+in+Developmental+Biology:+Xenopus+&#38;+Zebrafish.">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus &#38; Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , (1999).</li><li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells.">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells.">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li></ol>

Dans cette vidéo, nous avons démontré notre version de techniques classiques utilisées par les biologistes de Xenopus, qui nous réarrangés pour créer le test greffe animale bouchon. A température ambiante, les embryons de xénope se développer très rapidement à travers les étapes 9 et 15. En les plaçant à 14 ° C, le développement de l&#39;embryon est ralentie et beaucoup d&#39;autres greffes peuvent être effectuées en une seule expérience. S&#39;il est nécessaire d&#39;augmenter les...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd"><html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"><div><table border="1"><thead><tr><th> Nom du produit </th><th> Type </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commenter </th></tr></thead><tbody><tr><td> mMessage mMachine SP6 Kit </td><td></td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td><tr><td> Tubes capillaires en borosilicate (1.0mm x 0.5mm OD ID) </td><td></td><td> FHC, Inc </td><td> 27-30-1 </td><td></td><tr><td> Sutter Micropipette Puller </td><td></td><td> Sutter Instruments, Inc </td><td> P-97 </td><td></td><tr><td> Sulfate de gentamicine [50 mg / ml] </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> BW17-528Z </td><td></td><tr><td> Sylgard / Kit élastomère £ 1,1 </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> NC9644388 </td><td></td><tr><td>60 x 15 mm boîte de Pétri en polystyrène </td><td></td><td> USA Scientific </td><td> 8609-0160 </td><td></td><tr><td> gonadotrophine chorionique humaine </td><td></td><td> Intervet </td><td> 22219 </td><td></td><tr><td> Pico-injecteur systèmes de microinjection </td><td></td><td> Harvard Apparatus </td><td> 650003 </td><td></td><tr><td> Torrey Pines Scientific Incubateur ECHOtherm </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> 11-680-21 </td><td></td><tr><td> Transfert de pipette </td><td></td><td> Krackeler </td><td> 6290-20635A </td><td></td><tr><td> Dumostar ° 5 Pince </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> 11295-10 </td><td></td></tbody></table></div>

tissue determination using the animal cap transplant (act) assay in xenopus laevis

De nombreuses protéines jouent un double rôle dans le développement embryonnaire. Celles qui régissent la détermination du destin cellulaire dans un tissu spécifique peut également affecter le développement d&#39;une grande région de l&#39;embryon. Cela rend la définition de son rôle dans un tissu particulier difficile à analyser. Par exemple,<em&gt; Caboche</em&gt; Surexpression dans<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons provoque la dilatation de l&#39;ensemble de la région antérieure, y compris l&#39;oeil<sup&gt; 1,2</sup&gt;. De ce fait, on ne sait pas si Noggin joue un rôle direct dans la détermination de l&#39;œil ou en provoquant une expansion du tissu neural, Noggin affecte indirectement la formation de l&#39;œil. Ayant ce phénotype complexe rend l&#39;étude de son œil le rôle spécifique dans la détermination du destin cellulaire difficiles à analyser. Nous avons développé un test qui permet de surmonter ce problème. Profitant du caractère pluripotent de l&#39;<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Animaux bouchon<sup&gt; 3</sup&gt;, Nous avons développé un test pour tester l&#39;aptitude du produit du gène (s), comme<em&gt; Caboche</em&gt; Ou les facteurs de transcription (oeil de champ EFTFs), pour transformer les bouchons dans un tissu particulier ou des types de cellules en transplantant ce tissu sur le côté de l&#39;embryon<sup&gt; 4</sup&gt;. Bien que nous ayons constaté qu&#39;il s&#39;agisse du traitement de protéine Noggin ou un ensemble de facteurs de transcription peuvent déterminer le destin des cellules rétiniennes dans les calottes animales, cette procédure pourrait être utilisée pour identifier le produit du gène (s) impliqué dans la spécification d&#39;autres tissus ainsi.

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Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animaux bouchons surexprimant le produit du gène (s) sont transplantées dans le flanc de développement<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons afin d&#39;établir si le tissu est déterminée.

Détermination des tissus Utilisation de la transplantation Cap animale (ACT) Dosage dans<em&gt; Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

12.1K vues.  SUNY Upstate Medical University. Animaux bouchons surexprimant le produit du gène (s) sont transplantées dans le flanc de développement Xenopus laevis Embryons afin d'établir si le tissu est déterminée.

Vidéo: Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissection de l&#39;organisateur et explants pôle animal à partir d&#39;embryons de Xenopus laevis et de l&#39;Assemblée d&#39;un test d&#39;adhésion cellulaire

Recherche

Biologie

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastique Embedding et le sectionnement des embryons de Xenopus laevis

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Obtention des oeufs de Xenopus laevis femelles

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Préparation et fractionnement de Xenopus laevis oeufs Extraits

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Mammaires épithéliales procédure de greffe

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

La production de transgéniques Xenopus laevis Intégration par médiation des enzymes de restriction et de la transplantation nucléaire

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Transplantations faciales<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissection de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crête neurale pour<em&gt; In vitro</em&gt; Culture explantation ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Utilisation plusTipTracker Software mesurer microtubules Dynamics<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cônes de croissance

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...