Nous remercions Radek Šindelka pour son aide, et Cas Bresilla pour aider avec la grenouille élevage et la préparation de l&#39;embryon. Ce travail a été financé par le NIH via le R01DE021109 de subvention à HLS Laura Jacox a été financé par le Herschel Smith bourse d&#39;études supérieures à l&#39;Université de Harvard et une subvention F30 bourse individuelle F30DE022989-01 à la NIDCR.

Une. Réactifs Préparation <ol><li> 10x MBS: Préparer 1 L de 10x modification Saline de Barth (MBS) de la solution 17. Reportez-vous au tableau 1, les réactifs, les ingrédients et les instructions. Utilisez de l&#39;eau distillée pour toutes les solutions. Mélanger dans un bol, à l&#39;aide d&#39;une barre d&#39;agitation, jusqu&#39;à complète dissolution. Toutes les solutions doivent être effectuées à température ambiante. </li><li> 1x MBS: Diluer 100 ml de solution 10x MBS dans 900 ml d&#39;eau distillée pour obtenir 1 L de 1x MBS. Ajouter 0,7 ml de solution M CaCl 2 1. </li><li> 0,1 x MBS: Diluer 1x MBS pour préparer 1 L de solution 0.5x MBS et 2 L de 0,1 x MBS solution. Pour 1 L de 0,1 x MBS solution, ajouter 1 ml de 10 mg / ml solution de gentamicine. La solution de MBS de 0,1 x la gentamicine sera utilisé pour la culture d&#39;embryons à long terme. </li><li> Ficoll / MBS: Ajouter 15 g de Ficoll 400 à 500 ml d&#39;une solution 0,5 x MBS. Mélanger vigoureusement. Ajouter une barre d&#39;agitation et mélanger jusqu&#39;à dissolution complète du Ficoll (plusieurs heures). </li><li> 70% d&#39;éthanol: Diluer à 100% d&#39;éthanol à 70% d&#39;éthanol à l&#39;aidede l&#39;eau distillée. </li></ol> 2. Préparation de verre Outils d&#39;exploitation <ol><li> préparation de l&#39;aiguille: Charge tube capillaire dans un extracteur d&#39;aiguilles. <ol><li> Tirez les aiguilles selon les paramètres indiqués dans le tableau 2: les paramètres de traction aiguilles. Les réglages sont pour une micropipette extracteur Sutter Instrument Co. Modèle P-80/PC et tubes capillaires, comme décrit dans le tableau de réactifs et d&#39;équipements spécifiques. Cependant, ces paramètres sont spécifiques à l&#39;aiguille extracteur Sutter, et devront être ajustés pour les autres machines. Les paramètres peuvent être déterminées en utilisant un test de rampe, comme spécifié par le fabricant de la machine. </li><li> Tirer 4-6 aiguilles en vue de la procédure. Les aiguilles doivent être répartis de telle sorte que la partie flexible, les cheveux en forme de l&#39;embout de verre est complètement retiré, ce qui est typiquement de 2 à 3 mm de long. La pointe doit être relativement rigide, mais tout de même suffisamment étroit pour être utilisé comme un outil de coupe. Voir photo d&#39;une aiguille idéal à la figure 1A. </li&gt; <li> Stocker les aiguilles dans une boîte de Pétri avec une bande de terre le long du centre. Appuyez sur l&#39;arbre de chaque aiguille dans l&#39;argile, pour le maintenir en place et de tenir le bout pointu fragile loin du fond et les côtés. </li></ol></li><li> Pour les outils supplémentaires, obtenir une couverture lames de verre, une paire de longues pinces standards de modèle, d&#39;un bec Bunsen, et 3-4 pipettes Pasteur en verre (taille 5 ¾ po). </li><li> outil Pipette: Pour faire un outil de pipette, allumer le brûleur Bunsen et placer la pointe d&#39;une pipette Pasteur en verre dans la partie bleue de la flamme tout en le tournant, de telle sorte que la pointe fond et complètement le trou joints, formant une, extrémité fermée arrondie . Le arrondie, pointe scellée est ensuite utilisé pour faire des dépressions dans le plat en argile qui contient les embryons pendant l&#39;opération. Voir la figure 1B. </li><li> ponts en verre: Pour faire des ponts en verre, utiliser des pinces de modèle à long standard pour rompre avec précaution 3 mm par 3 mm des morceaux de verre lamelle. Tout en maintenant le morceau de lamelle avec tweezers, placer le verre dans la flamme jusqu&#39;à ce que tous les quatre bords et adoucir la courbe vers le bas, formant un dôme de verre minuscule. Les bords ne doivent plus être pointu. Voir la figure 1C. </li><li> Conserver les ponts de glissement de couverture de verre en les insérant, bords vers le bas, en pâte à modeler, recouvrant le fond d&#39;une boîte de Pétri. Insérer les ponts de telle sorte que la partie supérieure du pont reste au-dessus de la surface de l&#39;argile. Ne poussez pas trop dur de sorte que les ruptures de pont, et ne pas intégrer totalement le pont dans l&#39;argile, parce qu&#39;il peut être difficile à enlever. Après la stérilisation à la flamme ou à l&#39;éthanol 70%, les ponts peuvent être réutilisées d&#39;une expérience à. </li></ol> 3. Préparation de l&#39;opération d&#39;embryons <ol><li> Tapisser un petit 60 mm boîte de Petri en plastique de pâte à modeler. Entre deux utilisations, la surface de la boîte et de l&#39;argile est soigneusement lavé avec de l&#39;eau distillée, puis avec 70% d&#39;éthanol. REMARQUE: Utilisez le rouge, blanc ou jaune, Van Aken Plastalina pâte à modeler, qui peut être acheté à un localy ou magasin d&#39;art. Argile noire n&#39;est pas recommandé, car il libère un résidu. </li><li> Remplissez le plat avec 3% de solution de Ficoll 0.5x MBS. La concentration en sel plus élevée empêche la dissociation du tissu, et le Ficoll polysaccharide permet d&#39;épaissir la solution, ce qui contribue à la face de fixation en position. </li><li> Utilisez l&#39;outil de pipette Pasteur flambé (voir la figure 1) de faire peu profondes, 2-3 mm dépressions dans l&#39;argile, de la profondeur d&#39;un corps stade 20 de l&#39;embryon. Assurez 20-30 dépressions, 1-2 mm, de chaque côté de la boîte, il ya donc un total de 40-60 dépressions. Étiqueter un côté LOF / GOF, et l&#39;autre de type sauvage de côté, par la sculpture initiales dans l&#39;argile avec une pince. </li></ol> 4. Préparation Preoperation d&#39;embryons <ol><li> Obtenir et de la culture de Xenopus laevis embryons utilisant des méthodes standards 17. Pour une description détaillée de la grenouille élevage, s&#39;il vous plaît voir Sive et al. 17 <ol><li> Quarante-huit heures avant l&#39;expérimentation bénéficier du droit d&#39;dans les œufs de grenouilles femelles et effectuer la fécondation in vitro. </li><li> Injecter 0,5-1 ng de membrane coiffé GFP ARNm, ainsi que toute l&#39;ARNm désiré ou anti-sens oligonucléotides antisens morpholino modifié (&quot;Morpholinos») au stade d&#39;une cellule ou dans deux cellules au stade 2 cellules. L&#39;un stade cellulaire dure environ 70-90 min. Injecter un volume total de 1-3 nl. A la place de l&#39;ARN codant pour une protéine fluorescente (GFP tel que l&#39;ARN ou DP), on peut injecter FITC dextran marqué ou morpholino marqué par fluorescence. La fluorescence est important pour déterminer si la transplantation de tissus et guérit reste dans la tête. </li><li> Plafonné de l&#39;ARNm peut être préparé à partir d&#39;un plasmide linéarisé à l&#39;aide d&#39;un SP6 mMessage mMachine ou kit T7. Morpholinos peut être conçu et commandé par Gene Tools LLC. La quantité de morpholino requise pour un effet désiré doit être déterminée pour chaque gène 18. </li><li> Stocker les embryons injectés à 15 ° C pendant 48 heures, jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent le stade 19-20. (Fou toutes les étapes ultérieures, des embryons de stade selon la table normale de Xenopus laevis par Nieuwkoop et Faber 19.) NOTE: Le jour de la chirurgie, les deux embryons donateurs et bénéficiaires doivent être dans un stade de l&#39;autre pour les greffes de travailler de manière optimale. Cependant, les embryons injectés avec morpholinos (&quot;morphants») développent parfois plus lentement que le type sauvage ou contrôlent embryons morphant, ce qui rend nécessaire de coordonner les expériences afin que les deux morphant et embryons de type sauvage sont au même stade. Peuvent avoir besoin d&#39;être maintenue à une température plus élevée pendant 12 à 24 heures avant la procédure morphants. Pour augmenter la probabilité que les embryons peuvent être trouvés à des stades correspondants, les embryons peuvent être maintenus à différentes températures. Vingt-quatre heures avant l&#39;expérience, il faut diviser les embryons dans une plusieurs plats, et placer morphants à 18-20 ° C et les embryons de type sauvage à 15-18 ° C. </li></ol></li><li> Le jour de l&#39;expérience de transplantation, remOve les embryons de the15 ° C incubateur et organiser eux selon Nieuwkoop et Faber 19. Si elles sont plus jeunes que la fin neurula (étape 19), les laisser à température ambiante pendant 1-2 heures, jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent le stade 19. </li><li> Tamiser les embryons injectés sous un microscope à fluorescence. Sélectionner des embryons qui montrent uniforme, vive fluorescence pour l&#39;expérience. </li><li> Supprimer l&#39;encombrement et les contaminants possibles à proximité de la zone d&#39;exploitation. Essuyez la surface d&#39;exploitation, stéréoscopique et tous les outils avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Une fois que les embryons sont au stade 19, retirer la membrane vitelline utilisant # 5/45 pince Dumont sous un stéréomicroscope. <ol><li> Retirer la membrane vitelline de 20 à 30 de chacun des donneurs et des embryons hôtes. </li><li> Pour les premières expériences de transplantation de visage, il faut pratiquer avec quelques embryons pour chaque condition. La méthode est difficile et exige de la pratique prudent avant il peut être utilisé sur une plus grande échelle, rapidement et avec succès. On peut u travailp pour faire 20 greffes / expérience. </li></ol></li><li> Déplacer embryons hôtes dans le plat de fonctionnement en utilisant une pipette de transfert en plastique gradué avec l&#39;extrémité coupée de telle sorte que l&#39;ouverture est bien plus large que l&#39;embryon (au moins quelques millimètres). Soyez prudent pour éviter de toucher les embryons de bulles ou de la surface de l&#39;eau, comme les embryons vont exploser dans la tension de surface. </li><li> Utilisation # 5/45 une pince pour insérer les embryons dans les creux en argile, avec la partie postérieure de l&#39;embryon dans l&#39;argile. Fermez doucement l&#39;argile autour des bases de l&#39;embryon à l&#39;aide des pinces, laissant le quart supérieur de l&#39;embryon, la tête, dépassant de la dépression. </li><li> Une fois que tous les embryons hôtes sont fixées dans leurs renfoncements, se déplacer vers l&#39;autre côté de la plaque et commence à insérer les embryons donneurs dans leurs cavités. Répétez le processus de fixation des embryons dans leurs puits. </li></ol> 5. Exécution de la chirurgie de greffe de visage <ol><li> Couteau de coupe: En tant que lame de coupe pour l&#39;enlèvementdu tissu EAD donateurs, utiliser une aiguille capillaire de verre brisé de manière appropriée (voir l&#39;étape 2.3 et la figure 1). NOTE: On peut détenir directement le capillaire entre les doigts (ce qui fonctionne bien pour les personnes ayant de petites mains) ou l&#39;on peut monter l&#39;aiguille dans un porte-broche insecte. Des aiguilles de tungstène Electrosharpened 17 chargés dans un support de broche peuvent être utilisés à la place d&#39;une aiguille de tube capillaire. S&#39;il vous plaît voir supports de quilles proposées et les aiguilles de tungstène dans le tableau des réactifs et des équipements spécifiques. </li><li> Sous un microscope stéréoscopique, insérer l&#39;aiguille dans la tête de l&#39;embryon à la gauche de la glande de ciment. L&#39;aiguille doit être insérée en profondeur, de sorte qu&#39;il passe à l&#39;extérieur à partir de l&#39;embryon, à travers la tête, et dans l&#39;intestin antérieur. Pour transplanter l&#39;ensemble EAD, coupes devraient s&#39;étendre à l&#39;extérieur de l&#39;embryon à l&#39;intestin antérieur. Pour les transplantations de l&#39;ectoderme seule, coupes devraient être moins profonde et étendre seulement par l&#39;ectoderme. <ol><li> Flick l&#39;aiguille à partir de la gauche à la droite de l&#39;diriger, sur toute la largeur de la glande de ciment. La pichenette est important que le mouvement donne une coupe nette. Reportez-vous à la figure 2A pour un résumé de la technique et la figure 2B pour une démonstration des réductions. La glande de ciment et les yeux sont des repères importants pour les coupes. L&#39;ordre des coupes n&#39;affecte pas le résultat et peut varier en fonction de la préférence ou l&#39;impartialité de l&#39;utilisateur. </li></ol></li><li> Placer l&#39;aiguille au début de la coupe précédente, à la frontière gauche de la glande de ciment, et actionner le pointeau vers le haut jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne le fond de l&#39;oeil gauche. Ceci créera une coupe verticale de la bordure gauche de la glande de ciment vers le bas de l&#39;oeil gauche. </li><li> Placer l&#39;aiguille à la frontière droite de la glande de ciment, et actionner le pointeau vers le haut jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne le fond de l&#39;oeil droit. Ceci créera une coupe verticale de la bordure droite de la glande de ciment vers le bas de l&#39;oeil droit. </li><li> Pour exciser complètement le tissu, flick l&#39;aiguille à partir du fond de l&#39;oeil gauche de la partie inférieure de l&#39;oeil droit, la création d&#39;une coupure horizontale qui va libérer le tissu. Coupes peuvent s&#39;étendre à l&#39;extérieur de l&#39;embryon à l&#39;intestin antérieur, y compris à la fois l&#39;ectoderme et l&#39;endoderme dans l&#39;expiant EAD. Sinon, des coupes peu profondes peuvent être utilisés pour ectoderme uniquement greffes EAD. Une fois que le tissu est enlevé EAD, il devrait y avoir un trou rectangulaire de l&#39;extérieur de l&#39;embryon dans l&#39;intestin antérieur, qui s&#39;étend à partir de la glande de ciment à juste au-dessous des yeux (de haut en bas). Le trou devrait s&#39;étendre de la frontière à l&#39;intérieur de l&#39;œil gauche à la frontière à l&#39;intérieur de l&#39;œil droit (côté à l&#39;autre). Voir la figure 2Bb. </li><li> Poussez délicatement le tissu excisé à la pointe de l&#39;aiguille, et soulever à travers le tampon de la partie de la boîte contenant les embryons d&#39;accueil. Ne pas exposer le tissu à l&#39;air à la surface ou il sera endommagé. </li><li> Exciser le même tissu à partir de l&#39;embryon hôte, comme pour le donneur. Jeter l&#39;expiant EAD hôte ou l&#39;enregistrer sur insertiont dans la face des bailleurs de fonds, pour les transplantations réciproques. </li><li> Insérez le explantation des bailleurs de fonds dans le trou de l&#39;hôte résultant en utilisant # 5/45 forceps. </li><li> Une fois le tissu du donneur est correctement positionné et bien insérée, placer soigneusement un pont de verre (voir la figure 1 et la figure 2bc) sur le visage de l&#39;embryon de tenir la greffe en place. Les extrémités du pont doivent insérer dans l&#39;argile, le maintenant en place. Le pont devrait appliquer doucement pression sur le tissu transplanté, tels que la greffe se trouve au ras de la tête de l&#39;hôte, sans coller sur la tête ou se trouvant au fond de la tête. La tête peut être légèrement aplatie par la lamelle, mais attention de ne pas endommager l&#39;embryon avec trop de pression. Greffes doivent être effectués dans les 5 minutes. REMARQUE: Un enquêteur expérimenté peut effectuer une vingtaine de greffes par expérience, plus de 2-3 heures. Pendant cette période, les embryons vont progresser du stade 20-22. Fin de la greffe du visages à l&#39;étape 21 ou 22 n&#39;affecte pas les résultats. Greffes plus tard (aux stades 22-26) peuvent être faites mais sont plus difficiles que la région médiane EAD libre-crête est restreinte comme mouvements de la crête neurale crânienne dans le visage. Cohérence entre les greffes est critique. </li></ol> 6. Greffe du visage de récupération post-opération <ol><li> La guérison prend généralement 2-3 heures. Laissez les embryons à la température ambiante sans être dérangés dans leurs dépressions d&#39;argile avec les ponts de verre tenant le tissu du donneur en place. </li><li> Une fois les greffes ont guéri, retirer soigneusement les ponts en verre, enlever l&#39;argile autour de la base des embryons aide de pinces, et d&#39;utiliser un plastique diplômé pipette de transfert pour aspirer délicatement les embryons de leurs dépressions. </li><li> Mettez les embryons dans une boîte de Petri étiquetés de manière appropriée, à moitié rempli d&#39;MBS 0.1x propres gentamicine. </li><li> Cultiver les embryons à 15 ° C ou 18 ° C pendant plusieurs jours jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent l&#39;alimentation stade de têtard à l&#39;étape 40, wpoule phénotypes faciaux peuvent être marqués. <ol><li> La solution de MBS de 0,1 x la gentamicine doit être changé tous les jours, et les embryons morts doivent être retirés rapidement pour éviter la contamination et de la mort d&#39;autres embryons. </li><li> La bouche s&#39;ouvre à l&#39;étape 40. Au stade 40-41, il faut vérifier que le tissu transplanté reste guérie à la place en regardant sa fluorescence. Greffes de temps en temps tomber, donc il faut veiller à ce que tous les embryons marqués ont le tissu du donneur en place. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Étapes critiques et les limites: La procédure de greffe du visage EAD est temps et un travail intensif. Il exige de la pratique, les mains stables, et la dextérité pour se perfectionner. Le protocole de greffe de la face repose sur la capacité des chercheurs à éliminer efficacement et le tissu de greffe. Si l&#39;on prend trop de temps pour insérer la greffe dans le visage de l&#39;hôte, le visage de l&#39;hôte va commencer à se contracter et à guérir. Pinces peuvent être utilisés pour étendre dé...

Pour comprendre les mécanismes sous-jacents des défauts cranio-faciales congénitales 1-2, tissus importants et leurs contributions de signalisation au cours du développement cranio-facial doit être identifié. Dans la grenouille Xenopus laevis, une partie du visage, y compris la bouche et les narines forme de la &quot;Extreme antérieure de domaine&quot; (EAD), où l&#39;ectoderme et l&#39;endoderme sont directement juxtaposés 3-4. L&#39;EAD agit également comme un centre de signalisation pour influencer les tissus environnants, y compris la crête neurale crânienne, qui forme des mâchoires et d&#39;autres régions du visage 5. Pour identifier les gènes qui contribuent à la fonction de l&#39;EAD, une technique «visage de transplantation» a été développé, où le tissu est transplanté d&#39;un donneur dans un embryon hôte, après le retrait de la région d&#39;hôte correspondant. Après la greffe, ce qui entraîne le développement du visage est évaluée. Ainsi, les effets de la perte de fonction (LOF) ou gain de fonction (GOF) pour un gène spécifique dans la EAD sont analysées localement, où le reste de l&#39;hLire et corps est composé de tissus de type sauvage. La transplantation réciproque peut être effectuée, où le type sauvage tissu est transplanté dans des embryons avec LOF mondiale ou GOF dans les gènes spécifiques. Transplantation a été fréquemment utilisé dans Xenopus et étudie poussin 6. Par exemple, la transplantation de Xenopus a traité homogenetic induction neurale, la lentille et de la compétence de neurones, et la migration de la crête neurale 7-10. Caille-poulet greffe chimère a analysé le développement de la plaque neurale antérieure, crête neurale antérieure, la crête neurale, et les os crâniens 11-14. C&#39;est la première technique de greffe pour l&#39;étude du développement cranio-facial chez Xenopus. Cette technique a démontré un nouveau rôle pour les inhibiteurs de Wnt Frzb1 et du Croissant dans la régulation de la formation de la membrane basale dans la bouche présomptif 5. Xenopus laevis est un modèle idéal pour l&#39;étude du développement cranio-facial que les embryons sont grandes, développer l&#39;extérieur, une le visage est bien visible, ce qui permet la micromanipulation et de l&#39;imagerie de développement. Mécanismes sous-jacents du développement du visage semblent conservés, ce qui indique que les constatations faites dans la grenouille permettent de mieux comprendre le développement humain 4,15-16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="559">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Pasteur pipette</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">VWR</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">14672-400</td>
			<td style="width:128px;">Lime Glass&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Size 5 3/4&#8217;&#8217;</td>
			<td style="width:128px;">Cotton Plugged</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;">Disposable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:195px;">Graduated Transfer Pipette</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">VWR</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">16001-180</td>
			<td style="width:128px;">Disposable&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Polyethylene</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:195px;">#5/45 forceps</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools by Dupont medical</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">11251-35</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;">Angled 45 degrees</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="81" rowspan="3" style="height:81px;width:195px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">11000-20</td>
			<td style="width:128px;">Straight; serrated tip</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:128px;">Stainless Steel;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">20cm long</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="81" rowspan="2" style="height:81px;width:195px;">Capillary Tubing (for needles)</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">FHC</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">30-30-1</td>
			<td style="width:128px;">Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">100mm each</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Cover slip&#160;</td>
			<td rowspan="4" style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">48393 252&#160;</td>
			<td style="width:128px;">24x60mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">micro cover glass</td>
			<td style="width:136px;">or&#160;</td>
			<td style="width:128px;">or&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">(for glass bridges)</td>
			<td style="width:136px;">48393 230</td>
			<td style="width:128px;">24x40mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">No.1.5</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F9378</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">Needle Puller&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">Needle Puller: discontinued Filament: FB300B</td>
			<td rowspan="3" style="width:128px;">The most similar, currently available&#160; needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:195px;">Model P-80</td>
			<td style="width:101px;">Flaming / Brown micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">(discontinued)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Stereomicroscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zeiss Stemi 1000</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:195px;">Stereomicroscope Lighting by Fostec</td>
			<td style="width:101px;">Fostec</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:128px;">Use a light box with 2 fiberoptic arms.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="81" rowspan="2" style="height:81px;width:195px;">Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">26018-17</td>
			<td style="width:128px;">Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Length: 17cm</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="101" rowspan="3" style="height:101px;width:195px;">Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">26016-12</td>
			<td style="width:128px;">Jaw opening Diameter: 0 to 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:128px;">Length: 12cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:195px;">Tungsten Needles</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">10130-05</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;">0.125mm Rod diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Van Aken Plastalina</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Blick&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">#33268-2981</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Modeling Clay- white, red or yellow</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">mMessage mMashine SP6 or T7 Kit</td>
			<td style="width:101px;">Ambion</td>
			<td style="width:136px;">AM1340</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facial transplants in xenopus laevis embryos

Malformations congénitales cranio-faciales se produisent dans 1 sur chaque 700 naissances vivantes, mais l&#39;étiologie est rarement connus en raison de la compréhension limitée de développement cranio-facial. Pour déterminer où les voies de signalisation et les tissus agissent pendant la structuration de la face en développement, une technique «visage de transplantation» a été développé dans les embryons de la grenouille Xenopus laevis. Une région de tissu facial présomptif (le «extrême antérieure de domaine&quot; (EAD)) est retiré d&#39;un embryon donneur à l&#39;étape du bourgeon caudal, et transplanté dans un embryon hôte de la même scène, à partir de laquelle la région équivalente a été éliminée. Ceci peut être utilisé pour générer une face chimérique où le tissu de l&#39;hôte ou d&#39;un donneur a subi une perte ou gain de fonction dans un gène, et / ou comprend une étiquette de lignage. Après la guérison, le résultat du développement est surveillé, et indique les rôles de la voie de signalisation dans le donateur ou tissus de l&#39;hôte environnantes. Xenopus est un modèle précieux pour le développement de visage, comme la région du visage est large et facilement unccessible pour la micromanipulation. De nombreux embryons peuvent être analysés, sur une courte période de temps puisque le développement se fait rapidement. Les conclusions de la grenouille sont pertinents pour le développement humain, car les processus cranio-faciales semblent conservés entre Xenopus et les mammifères.

Tissu transplanté doit être complètement insérée dans la tête de l&#39;hôte après transplantation, comme indiqué sur la figure 3A, et avoir un pont de verre placée de façon appropriée sur le visage de l&#39;embryon, comme le montre la Figure 2bc. Le tissu du donneur transplanté doit être correctement dimensionné pour l&#39;ouverture de l&#39;hôte, pour la transplantation, pour réussir. Le tissu EAD ne doit pas dépasser de la tête, en aucune façon, comme on le voit su...

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Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Une technique de transplantation de &quot;Extreme antérieur domaine&quot; mouchoirs entre les embryons de Xenopus laevis a été développé. Tissu peut être déplacé d&#39;un gène expression fond dans un autre, ce qui permet l&#39;étude des besoins locaux pour le développement cranio-facial et d&#39;interactions entre les régions du visage de signalisation.

Transplantations faciales<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

facial-transplants-in-xenopus-laevis-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

10.2K vues.  Harvard University.  Une technique de transplantation de "Extreme antérieur domaine" mouchoirs entre les embryons de Xenopus laevis a été développé. Tissu peut être déplacé d'un gène expression fond dans un autre, ce qui permet l'étude des besoins locaux pour le développement cranio-facial et d'interactions entre les régions du visage de signalisation. 

Vidéo: Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissection de l&#39;organisateur et explants pôle animal à partir d&#39;embryons de Xenopus laevis et de l&#39;Assemblée d&#39;un test d&#39;adhésion cellulaire

Recherche

Biologie

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastique Embedding et le sectionnement des embryons de Xenopus laevis

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Obtention des oeufs de Xenopus laevis femelles

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Préparation et fractionnement de Xenopus laevis oeufs Extraits

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Détermination des tissus Utilisation de la transplantation Cap animale (ACT) Dosage dans<em&gt; Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Imagerie des cellules vivantes et de l&#39;analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

La production de transgéniques Xenopus laevis Intégration par médiation des enzymes de restriction et de la transplantation nucléaire

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissection de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crête neurale pour<em&gt; In vitro</em&gt; Culture explantation ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Utilisation plusTipTracker Software mesurer microtubules Dynamics<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cônes de croissance

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Transplantations faciales

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

Dissection de l'organisateur et explants pôle animal à partir d'embryons de Xenopus laevis et de l'Assemblée d'un test d'adhésion cellulaire

Plastique Embedding et le sectionnement des embryons de Xenopus laevis

Obtention des oeufs de Xenopus laevis femelles

Préparation et fractionnement de Xenopus laevis oeufs Extraits

Microinjection d'ovocytes de Xenopus laevis

Détermination des tissus Utilisation de la transplantation Cap animale (ACT) Dosage dans

Imagerie des cellules vivantes et de l'analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis

La production de transgéniques Xenopus laevis Intégration par médiation des enzymes de restriction et de la transplantation nucléaire

Dissection de

Utilisation plusTipTracker Software mesurer microtubules Dynamics