Le financement de notre travail est fourni par le NIH, le Mars of Dimes, et l&#39;American Cancer Society.

Des versions modifiées de cette approche de transgenèse ont été initialement décrites en 1 et 2. A. Préparation des noyaux de sperme Cette méthode de préparation des noyaux est adapté de Murray 3, mais les inhibiteurs de protéase ont été omises car elles interfèrent avec le développement ultérieur des œufs transplantés avec des noyaux de spermatozoïdes. Des aliquotes sont congelés à -80 ° C et peuvent être utilisés pour des transplantations d&#39;environ 6 mois. Toutes les solutions doivent être préparées et placées sur la glace avant le début de la préparation. <ol><li> Anesthetize 1-2 mâle adulte X. laevis par immersion dans tricaïne pendant au moins 20 min suivie du jonchage; retirer les testicules. </li><li> Rouler les testicules sur une serviette en papier pour enlever le sang, les vaisseaux sanguins et de graisse du corps, lavez-les brièvement dans un plat de 60 mm de Petri contenant 1XMMR, et enlever toute pièce supplémentaire de la graisse corporelle. Prenez soin de ne pas percer les testicules, car cela libère le sperme. </li><li> Transfert des testicules à une sèche de 60 mm boîte de Pétri et laisser macérer des testicules avec des pinces jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y morceaux visibles. La macération doit être fait de manière aussi approfondie que possible afin d&#39;obtenir des rendements élevés de noyaux. </li><li> Ajouter 2mls tampon froid préparation nucléaire (CNLC; 1X de stock) pour le macérat et doucement la pipette de haut en bas. </li><li> Squirt macérer dans environ 4 épaisseurs de gaze sur un entonnoir, recueillant dans un tube de 15 ml (par exemple Falcon 2059); Rincez plat avec 8mLs de la CNLC et de mettre ce rinçage à travers la gaze, en la recueillant dans le tube. Avec les mains gantées presser le fromage pour recueillir le liquide restant dans le tube. </li><li> Pellet le sperme à 3000 rpm pendant 10 min. à 4 ° C dans un rotor swing (1480g par exemple dans un Sorvall HB-rotor 4 ou équivalent) avec les adaptateurs de tube approprié. Décanter le surnageant, ajouter 8 ml CNLC à ce tube et la pipette de haut en bas avec une pipette de 10 mL à Resuspendre le culot; Isoler à nouveau comme ci-dessus et décanter le surnageant. Equilibrer 1mL de la CNLC à température ambiante pendant la rotation. </li><li> Resuspendre le culot dans 1 ml CNLC température ambiante en utilisant une pointe de 1 mL pipetteman, ajouter 50 pl de la lysolécithine 10mg/ml fraîchement préparé, mélangez délicatement et incuber pendant 5 min. à température ambiante. </li><li> Ajouter 10 ml de BSA à froid 1XNPB 3% sur le tube pour arrêter la réaction lysolécithine, mélanger délicatement et spin bas pendant 10 min à 3000 rpm dans un rotor swing. Décanter le surnageant. Le culot lysolécithine traité devrait ressembler un peu plus translucide (moins opaque blanc) qu&#39;il a fait avant le traitement lysolécithine. </li><li> Décanter le surnageant et remettre le culot dans 5 ml de BSA à froid CNLC 0.3%, mélanger délicatement avec une pipette de 10 ml et centrifuger pendant 10 min à 3000rpm comme ci-dessus. </li><li> Décanter le surnageant et remettre le culot dans 500μl de tampon de stockage du sperme et le transfert d&#39;un tube de 1,5 ml. C&#39;est maintenant votre stock noyaux. Store sur la glace pendant que vous vérifiez le rendement de noyaux. </li><li> Pour vérifier le rendement des noyaux, placer 98 ul de tampon de dilution du sperme (PSD), 1 pl du stock nucléaire et 1 microlitre de 1:100 dilution du stock de Hoechst dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Mélanger le bouillon nucléaires très bien à l&#39;aide d&#39;un rasoir-coupées (ou grande ouverture) pointe de la pipette juste avant d&#39;enlever l&#39;ul 1. Mélanger la dilution SDB / Hoechst / noyaux très bien et laissez une petite quantité de s&#39;écouler dans la chambre d&#39;un hématimètre de Neubauer améliorée par capillarité. Comptez noyaux dans un carré de l&#39;hématimètre sous un microscope composé. D&#39;un homme, vous devriez obtenir le nombre d&#39;au moins 100-200 (X10 4 cellules / mL) pour cette dilution 1:100 du stock pour une concentration d&#39;actions non dilué de 1-2X10 5 cellules / ul. Si votre stock est moins concentré, laissez les noyaux se contenter de quelques heures, retirer certaines de surnageant, et de raconter. Laisser les noyaux à 4 ° C pendant la nuit pour permettre à la glycérine pour pénétrer pour mieux la cryoconservation, puis mélanger le matériel nucléaire bien avec une pointe de pipette large orifice, de préparer des aliquotes 20 pi, et congeler dans l&#39;azote liquide. </li></ol> B. Préparation de l&#39;extrait de High Speed Cette méthode est adaptée de Murray trois et produit un extrait cytosolique interphase qui favoriseront décondensation chromatine enflure et partielle des noyaux de spermatozoïdes ajouté. Extrait peuvent être congelés en petits aliquots à -80 ° C et décongelés avant utilisation. <ol><li> 3-5 jours avant l&#39;injection de HCG, le Premier 8-12 femelle adulte X. laevis en injectant 50 U de PMSG dans le sac lymphatique dorsal. Le soir, avant la préparation d&#39;extraire, d&#39;injecter chaque grenouille avec 500 unités HCG et placer 2 grenouilles / conteneur en 2 1XMMR litres. Comme une grenouille avec lyse ou l&#39;activation des œufs peuvent compromettre la préparation d&#39;extrait, il est conseillé de séparer les grenouilles en paires pour l&#39;ovulation. </li><li> Le lendemain matin, préparer et réfrigérer toutes les solutions avant de commencer la préparation. Doucement, la main d&#39;expulser les oeufs de chaque grenouille dans de grandes beakers contenant 1X ROR. Screen les oeufs de chaque conteneur et omettre tous les lots d&#39;œufs avec des signes de marbrures, lyse ou l&#39;activation (visualisé par la contraction de la pigmentation dans l&#39;hémisphère animal) de la procédure. Collecter les œufs ininterrompue, même avec la pigmentation. Bonne oeufs peuvent aussi être collectées à partir du ROR 1X dans les seaux de grenouille. Le volume total d&#39;œufs doit être&gt; 100 ml de les 8-12 femelles. </li><li> De la gelée des oeufs. Pour ce faire, retirez ROR autant que possible, ajoutez une petite quantité de solution de cystéine, et faire tournoyer les œufs. Remplacer avec une solution de cystéine frais à plusieurs reprises pendant de-gélifiant. De la gelée de chaque lot d&#39;œufs séparément et jetez lots avec la rupture ou l&#39;activation d&#39;oeuf. Combinez le reste des oeufs. </li><li> Laver les œufs à quatre reprises en ~ 35 mL de tampon de l&#39;extrait (HB), puis deux fois dans 25 ml de LCR-XB avec des inhibiteurs de protéase. </li><li> Pour emballer les oeufs: transférer les oeufs dans des tubes ultraclear Beckman. Laisser les œufs à régler. Retirer autant CSF-XB que possible. Centrifuger les oeufs en utilisant un Beekman SW 40 Ti rotor (ou rotor similaire) à 1000 rpm (150g) pour ~ 60 sec à 4 ° C. Retirer l&#39;excès de solution par le haut des oeufs emballés. </li><li> Pour écraser les oeufs et générer cytoplasmique extrait: centrifuger les oeufs à 10000 rpm (16.000 g) pendant 10 min à 4 ° C. Les œufs doivent se séparer en trois couches: des lipides (en haut), le cytoplasme (centre), et le jaune (en bas). Recueillir la couche cytoplasmique de chaque tube avec une aiguille de calibre 18 en insérant l&#39;aiguille dans le tube à la base de la couche cytoplasmique. Transfert dans le cytoplasme d&#39;un nouveau tube ultraclear Beckman sur la glace. </li><li> Ajouter les inhibiteurs de protéase dans le cytoplasme isolé à une concentration finale de 1X. Recentrifuger le cytoplasme à 16.000 g pendant 10 min à 4 ° C. Recueillir le cytoplasme clarifié comme décrit ci-dessus. S&#39;attendre à obtenir de 0,75 à 1 cytoplasme mL / grenouille. </li><li> Ajouter 1 / 20 du volume extrait de mix énergétique à l&#39;échantillon. Transfert du cytoplasme dans des tubes à paroi épaisse en polycarbonate pour la Beckman TL-100 ultracentrifugation. Tubes détiennent environ 3 ml chacun et doit être au moins à moitié plein. </li><li> Ajouter 1 M CaCl 2 dans chaque tube à une concentration finale de 0,4 mM. Incuber les tubes pendant 15 min à température ambiante. Cette inactive LCR et pousse l&#39;extrait dans l&#39;interphase. </li><li> Équilibrer les tubes et les centrifugeuses dans un Beckman TL-100 en utilisant une ultracentrifugeuse TLA-100.3 rotor à 70000 rpm (200000 g) pendant 1,5 h à 4 ° C. Le cytoplasme se fractionnent en quatre couches, de haut en bas: des lipides, le cytosol, membrane / mitochondries, et le glycogène / ribosomes. </li><li> Retirez la couche cytosolique de chaque tube (~ 1 mL si 2-3 mL a été chargée dans le tube) en insérant une seringue dans le haut du tube à travers la couche lipidique. Transfert de la fraction cytosolique des tubes frais et recentrifuger les échantillons à 70 000 rpm (200 000 g) pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Aliquoter le surnageant dans 25 ul aliquotes dans des tubes de 0,5 mL. Quick-geler les aliquotes dans l&#39;azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. Afin de déterminer si l&#39;extrait est efficace, les noyaux des spermatozoïdes peuvent être incubés dans l&#39;extrait et colorés avec Hoechst pour déterminer si les noyaux visiblement houle (épaissir et allonger) dans les 10 min de plus à température ambiante. </li></ol> Réaction de transgénèse C et le transfert nucléaire Important: Vérifiez que les solutions, l&#39;équipement et des grenouilles sont tous prêts avant le début d&#39;une réaction. Une fois que vous commencez, vous devez procéder à la réaction en utilisant le calendrier approximatif décrit ci-dessous, car de nombreux éléments ne restent pas stables pendant&gt; 30 minutes. Alors que le stock de noyaux de sperme est conservé sur la glace, les réactions de transgénèse (dilué et concentré) doit être conservé à température ambiante. <ol><li> Premier grenouilles femelles. Le soir avant de transgénèse, injecter plusieurs (3-5) femelles adultes grenouille avec 800 unités HCG dans le sac lymphatique dorsal d&#39;obtenir fraîchement oeufs pondus dès le lendemain. </li><li> Le jour de la procédure de la transgénèse, de préparer ou mettre à température les solutions nécessaires pour la transgénèse: <ol class="lalpha"><li> Cystéine fraîchement préparé (2,5% en 1XMMR, pH 8,0). Vous aurez besoin de plusieurs centaines de millilitres d&#39;être utilisés ce jour-là. </li><li> Ficoll 0.2XMMR 6% pour les plats de la transplantation et la récupération des embryons transgéniques et 0.2XMMR 100 pg / ml de gentamicine (sans Ficoll) pour élever des embryons. Les solutions doivent pas être plus chaud que 18-21 ° C et d&#39;embryons transgéniques doivent être soulevées par les clivages au début à des températures entre 16 et 21 ° C, car des températures plus élevées nuisent à la fois la fréquence de la transgénèse et le développement embryonnaire. </li><li> Décongeler et s&#39;équilibrer à température ambiante aliquotes congelés de la SDB (tampon de dilution du sperme) en vue de transplantations de la journée, le dégel de l&#39;extrait à haute vitesse et placer sur la glace, et de préparer une solution de MgCl2 100 mM. </li><li> Sortez èmeplats d&#39;injection électronique d&#39;agarose et remplir avec MMR / Ficoll solution, et mis en place et de pré-lancer la pompe à perfusion afin de stabiliser le débit. </li><li> Vérifiez que les grenouilles femelles pondent des oeufs et sont de haute qualité. Idéalement, les oeufs doivent avoir un cortex entreprise (tenir la forme, après de-gélifiant). </li></ol></li><li> Mettre en place une réaction transgénèse: <ol class="lalpha"><li> Très doucement (à l&#39;aide d&#39;une pipette épointés) mélanger les stocks des noyaux et de combiner dans un tube Eppendorf de 1,5 ml: Noyaux 4μl (~ 4-8X10 5 noyaux) 2μl plasmide linéarisé (100ng/μl) Incuber 5 minutes à température ambiante. </li><li> tout d&#39;incubation est de procéder, diluer 0.5μl d&#39;enzyme de restriction dans 4.5μl H 2 O et ajouter 1 microlitre d&#39;enzyme diluée à 18μl du PSD, 2μl de MgCl 2 et 2μl d&#39;extrait à grande vitesse. Ajouter ce mélange à la réaction des noyaux-plasmide. Incuber 10 minutes de plus à gonfler les noyaux. </li><li> Pendant cette incubation, presser les œufs de grenouilles et de 2 à 3 de la gelée dans une solution de cystéine. Lavez-les bien (5X) avec 1XMMR, et l&#39;utilisation d&#39;une pipette grand diamètre pour transférer 400 à 500 oeufs à chaque dejellied agarose contenant 0,2 x plat bien ROR Ficoll 4%. Cela prend habituellement environ 10 minutes, donc une fois les plats d&#39;oeufs sont préparées de la réaction est généralement prêt à diluer. </li><li> Environ 15-20 minutes après le début de l&#39;étape a, mélanger délicatement la réaction (noyaux / / extrait l&#39;ADN) avec une pointe coupée et ajouter environ 5uL à 150 PSD ul à température ambiante. Noyaux dans ce mélange dilué est stable pendant environ 1h., Alors qu&#39;ils ne conservent pas la capacité de la transplantation tant quand on les laisse dans le mélange concentré. </li></ol></li><li> Chargez l&#39;aiguille: Mélanger la réaction diluée préparée ci-dessus très doucement avec une pipette large orifice, puis charger l&#39;aiguille rapidement, comme des noyaux se déposent rapidement dans le tube. Pour backloading l&#39;aiguille, placez un morceau de tuyau Tygon fine sur la fin d&#39;un embout de pipette 200 pl coupés. Aspirer la solution dans l&#39;embout de la pipette, puis fixez le tuyau à l&#39;aiguille et laisser la solution d&#39;entrer dans l&#39;aiguille par gravité ou délicatement sur le piston pipette. </li><li> Fixer l&#39;aiguille à la pompe tuyaux et commencent transplantations de noyaux. Les injections doivent être rapides, peu profondes et à peu près perpendiculaire à la membrane plasmique de l&#39;œuf pour éviter de faire des dégâts. A la vitesse d&#39;écoulement suggéré (10nl/sec), laisser l&#39;aiguille dans l&#39;œuf pour ~ 0,5 secondes. Vous devez compléter 1-2 plats de transplantations en 20-30 minutes. </li></ol> Après les injections, laissez les plats à 16-20 ° C jusqu&#39;à ce que les embryons ont atteint le stade de la cellule 4-8. Trier les embryons clivage loin de leur non-clivage voisins en transférant (avec une pipette Pasteur en verre avec une pointe à peu près le même diamètre que l&#39;œuf) à un plat frais de Ficoll grande 0.2XMMR 4%. Subdiviser les embryons clivage en petits groupes (10-15 embryons / puits d&#39;une plaque à 6 puits) et de la culture 0.2XMMR (pas de Ficoll) 100 mg / ml de gentamicine dans le développement précoce. Les embryons doivent être vérifiés pendant la gastrulation avec tout embryons meurent enlevé rapidement et les médias changé dès que nécessaire. Dépannage: <ol><li> Aiguille est bloquée: débit de la solution de l&#39;aiguille doit être apparente au cours des transplantations. Si l&#39;aiguille est bloquée par les particules visibles, le changement d&#39;aiguilles ou d&#39;essayer d&#39;éliminer les débris par clipsage la pointe avec une pince et en poussant solution à travers l&#39;aiguille. </li><li> Aucun clivage oeufs sont obtenus: vérifier que les dilutions des noyaux de spermatozoïdes et le volume d&#39;injection sont appropriés et que l&#39;aiguille n&#39;a pas été bloquée pendant la transplantation. Si le volume d&#39;injection est trop élevée, les œufs peuvent aussi ne pas cliver et de plutôt montrer la pigmentation décolorées ou des dommages. </li><li> Embryons Beaucoup meurent pendant la gastrulation. Plusieurs facteurs peuvent améliorer la survie des embryons: <ol><li> prendre soin avec les noyaux pendant la préparation et la réaction enzymatique. Noyaux décondensée sont fragiles et ont besoin d&#39;être transplantés à l&#39;aide du calendrier ci-dessus. Ne pas les placer sur la glace. </li><li> Les altérations chromosomiques soutenue par les noyaux des spermatozoïdes lors de la réaction enzymatique et le transfert nucléaire affecte à la fois la fréquence de la transgénèse et le développement normal des embryons. Lésions chromosomiques dans les noyaux améliore l&#39;efficacité de la transgénèse, mais affecte négativement la survie / développement normal. Diminuer ou en omettant d&#39;enzyme de restriction pendant l&#39;incubation enzyme peut améliorer le taux de développement normal, mais peut diminuer la fréquence de la transgénèse ou le nombre de copies du plasmide introduit dans le génome d&#39;embryons. </li><li> Si la fin de blastula travers embryons gastrula montrer des signes de décoloration ou de mort cellulaire, il est également possible que d&#39;un réactif utilisé pour les transplantations était toxique pour les oeufs. En outre, si l&#39;œufs n&#39;ont pas un cortex cabinet, ils peuvent subir exogastrulation et ne parviennent pas à générer la normale après-gastrula embryons. </li></ol></li><li> Le nombre d&#39;embryons exprimant le transgène est faible. Augmenter la quantité d&#39;enzyme de restriction. </li></ol> Représentant Résultats embryon transgénique <img src="/files/ftp_upload/2010/2010fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Embryons transgéniques résultant des transferts nucléaires devrait être soulevée jusqu&#39;à l&#39;expression du promoteur d&#39;intérêt est visible. Dans la figure 1 ci-dessus, un promoteur de l&#39;actine musculaire entraîne l&#39;expression de la protéine fluorescente verte dans les somites de ce têtard transgéniques.

<ol>
	<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122, 3173-3183 (1996).</li><li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos.">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods Mol Biol. 97, 393-414 (1999).</li><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hartley, K. O., Hardcastle, Z., Friday, R. V., Amaya, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+reveal+that+anterior+neural+development+requires+continued+suppression+of+BMP+signaling+after+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos reveal that anterior neural development requires continued suppression of BMP signaling after gastrulation.</a> Developmental Biology. 238, 168-184 (2001).</li><li>Karaulanov, E., Kn&#246;chel, W., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+BMP4+synexpression+in+transgenic+Xenopus.">Transcriptional regulation of BMP4 synexpression in transgenic Xenopus.</a> EMBO J. 23, 844-856 (2004).</li><li>Ogino, H., Fisher, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+a+head-field+selector+Otx2+and+Notch+signaling:+a+mechanism+for+lens+specification.">Convergence of a head-field selector Otx2 and Notch signaling: a mechanism for lens specification.</a> Development. 135, 249-2458 (2008).</li><li>Taylor, J. J., Wang, T., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf-+and+Vent-binding+sites+regulate+neural-specific+geminin+expression+in+the+gastrula+embryo.">Tcf- and Vent-binding sites regulate neural-specific geminin expression in the gastrula embryo.</a> Developmental Biology. 289, 494-506 (2006).</li><li>Marsh-Armstrong, N., Huang, H., Berry, D. L., Brown, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+transgenes+in+Xenopus+laevis.">Germ-line transmission of transgenes in Xenopus laevis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14389-14393 (1999).</li><li>Offield, M. F., Hirsch, N., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Xenopus+tropicalis+transgenic+lines+and+their+use+in+studying+lens+developmental+timing+in+living+embryos.">The development of Xenopus tropicalis transgenic lines and their use in studying lens developmental timing in living embryos.</a> Development. 127, 1789-1797 (2000).</li></ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le soin des animaux et utilisation comité à la Washington University School of Medicine.

Pour chaque construction transgénique à être testé, nous avons généralement greffe noyaux dans les œufs 500-1000; à cette échelle, nous pouvons générer des embryons transgéniques exprimant jusqu&#39;à 10 différentes constructions par jour, selon le nombre de femelles sont induits à pondre des oeufs. Parmi ces transplantations, environ un tiers de la cliver les œufs et 60-80% de ces embryons clivage passer par la gastrulation normalement. Selon les conditions de réaction utilisées, entre 10-50% de ces e...

A. Préparation des noyaux de sperme Réactifs: <ol><li> 1X ROR (2mm CaCl 2, 5 mM d&#39;HEPES, pH 7,5, 2 mM de KCl, 1 mM MgCl2, 100 mM NaCl). </li><li> 0,1% tricaïne méthanesulfonate (MS222, ester éthylique d&#39;acide aminobenzoïque, Sigma A-5040), du bicarbonate de sodium à 0,1%. Dissoudre dans l&#39;eau. </li><li> 2X Beurre Préparation nucléaire (CNLC). Le jour de la préparation des noyaux de spermatozoïdes, représentent 30 ml de 2X la CNLC à partir des aliquotes des solutions stocks conservés congelés: 500 mM de saccharose (1,5 M d&#39;actions), 30 mM HEPES (stock 1M; titrer avec KOH pour que le pH est à 7,7 15 mm), 1 mM trichlorhydrate de spermidine (Sigma S-2501, 10 mm Stock), 0,4 mM de spermine tétrachlorhydrate (Sigma S-1141, 10 mm Stock), 2 mM de dithiothréitol (Sigma D-0632; stock de 100 mm), 2 mM EDTA (EDTA 500 mM, pH 8,0). </li><li> Utilisez le 2XNPB faire a. 30ml 1X CNLC, b. 10ml 1XNPB 3% de BSA (fraction V, Sigma A-7906), c. 5ml BSA 1XNPB 0,3%. </li><li> Lysolécithine: 100 ul de 10 mg / ml de L-α-lyso-lécithine, jaune d&#39;oeuf (Calbiochem, 440154); dissoudre à la température ambiante, juste avant utilisation. Magasin de stock de solide à 20 ° C. Jeter de la poudre d&#39;actions si elle devient collante. </li><li> Albumine sérique bovine (BSA): 10% (p / v) de BSA (fraction V, Sigma A-7906) représentent 5 ml dans l&#39;eau le jour de la préparation des noyaux de spermatozoïdes. </li><li> Le sperme de stockage tampon (1 ml) 1X CNLC, glycérol 30%, BSA 0,3%. </li><li> Tampon de dilution du sperme: 250 mM de saccharose, 75 mM KCl, 0,5 mM trichlorhydrate de spermidine, spermine 0,2 mM tétrachlorhydrate. Titrer à pH 7.3 à 7.5 et stocker de 0,5 à 1 ml aliquotes à 20 ° C. </li><li> Hoechst n ° 33342 (Sigma B-2261): 10 mg / ml d&#39;actions en DH 2 O, de stocker dans un récipient étanche à la lumière à 20 ° C. </li></ol> Equipement: <ul><li> Rotor swing et centrifuger </li><li> étamine </li><li> des outils de dissection (pinces et ciseaux) </li><li> microscope à fluorescence </li><li> entonnoir </li><li> des gants </li><li> hémocytomètre </li><li> aiguilles (calibre 26) </li><li> serviettes en papier </li><li> des boîtes de Pétri (60 mm) </li><li> Pipettes </li><li> plastique (5 et 10 ml) </li><li> Pipetman conseils (1 ml et 200 pl) </li><li> Seringues (1 ml) </li><li> tubes (14 ml; Falcon, 2059) </li><li> tubes </li><li> microcentrifugeuse (1,5 ml) </li></ul> B. Préparation de l&#39;extrait de High Speed Réactifs: <ol><li> 1X Marc modification Ringer (TMM): 100 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM de CaCl 2, 5 mM d&#39;HEPES, pH 7,5. Préparer un stock de 10X, et ajuster le pH avec NaOH à 7,5. </li><li> Extrait 20X tampon (HB) de bouillon de sel: 2 M de KCl, 20 mM MgCl2, 2 mM de CaCl2, filtre-stériliser et conserver à 4 ° C. </li><li> Extrait de tampon (XB; fraîchement préparés et stockés sur glace): 1X sels XB, 50 mM de saccharose, HEPES 10 mM (1 M d&#39;actions, titré avec du KOH de sorte que le pH est de 7,7 lorsque dilué à 15 mM; filtre à stériliser et stocker en aliquots à 20 ° C). Préparer 100 ml environ. </li><li> 2% (p / v) de L-cystéine chlorhydrate 1-hydrate: Fabriqué en 1X sels XB avant de l&#39;utiliser et titré à pH 7,8 avec NaOH. Préparer 300 ml environ. </li><li> LCR-XB: 1X sels XB, MgCl2 1 mM (en plus de MgCl 2 présents dans les sels de XB; concentration finale de 2 mM), 10 mM d&#39;HEPES, pH 7,7, 50 mM de saccharose, 5 mM EGTA, pH 7,7. Préparer 50 ml. </li><li> Les inhibiteurs de protéase: Mélange de leupeptine, chymostatine et pepstatine, chaque dissous à une concentration finale de 10 mg / ml dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver dans de petites aliquotes à 20 ° C. </li><li> 1 M de CaCl 2. </li><li> Mix énergétique: 150 créatine phosphate mM, 20 mM d&#39;ATP, 20 mM MgCl 2. </li><li> Jument gravide gonadotrophine sérique (PMSG): 100 U / ml PMSG (PG600 ®, Intervet, Inc, 021825). Dissoudre dans l&#39;eau et stocké à 20 ° C. </li><li> La gonadotrophine chorionique humaine (HCG): 1000 U / ml d&#39;hCG (CHORULON ®, Intervet, Inc, 057176). Dissoudre dans l&#39;eau et stocké à 4 ° C. </li></ol> Equipement: <ul><li> Xenopus laevis femelles </li><li> Aiguilles (18 et calibre 26) </li><li> Pipette Pasteur </li><li> largeur alésage </li><li> Seringues (1 ml) </li><li> Tubes, microcentrifugeuse (0,5 ml) </li><li> Tubes, à paroi épaisse en polycarbonate (Beckman, 349 622) </li><li> Tubes, UltraClear (14 x 95 mm; Beckman, 344 060) </li><li> Ultracentrifuger et rotors (par exemple, Beckman TL-100 avec des rotors SW 40 Ti et TLA-100.3) </li><li> Béchers pour la collecte des œufs </li><li> Seaux ou des récipients pour la tenue de grenouilles femelles (par exemple, 4-L gobelets en plastique avec couvercle mesh). </li></ul> C. transplantation nucléaire. Réactifs: <ol><li> 2,5% d&#39;agarose dans 0.1XMMR (pour faire des plats d&#39;injection) </li><li> La cystéine 2,5% en 1XMMR, PH 8,0, préparé sur la journée d&#39;utilisation </li><li> Ficoll </li><li> 10 mg / ml de gentamycine (stock 1000X) </li><li> haute vitesse de l&#39;extrait d&#39;œufs (voir ci-dessus) </li><li> 100 MgCl 2 </li><li> ROR 10X (voir ci-dessus) </li><li> Enzyme de restriction (par exemple Notl de New England Biolabs) </li><li> Tampon de dilution du sperme (PSD; voir ci-dessus) et des noyaux de spermatozoïdes (voir ci-dessus) </li><li> La gonadotrophine chorionique humaine (HCG) comme ci-dessus </li><li> huile minérale (Sigma, M8410) </li><li> Plasmide linéarisé d&#39;être présenté comme le transgène: Préparer plasmide linéarisé à une concentration d&#39;environ 100 ng / ul dans stérile, eau sans nucléase (nous évitons de Tris EDTA et contenant des tampons, qui sont un peu toxique pour les embryons). L&#39;enzyme de restriction utilisée pour linéariser le plasmide n&#39;a pas à être le même que celui utilisé dans la réaction de transfert nucléaire. Nous utilisons habituellement Notl pour toutes les réactions, indépendamment de ce plasmide est linéarisé par. Certains de calibrage de la dilution de l&#39;enzyme utilisée dans la réaction peut être nécessaire, des enzymes comme trop peut entraîner des effets néfastes sur le post-gastrula développement. Plasmide peut être purifié de plusieurs manières différentes: nous utilisons habituellement le kit Qiagen QIAquick PCR Purification selon les directives des fabricants; purification d&#39;une bande unique à partir d&#39;un gel n&#39;est pas nécessaire. Si plasmide est purifié à l&#39;aide de phénol / chloroforme et précipitation extractions éthanol, être certain d&#39;éliminer toutes traces de matières organiques et l&#39;éthanol. </li></ol> Equipement: Plats Agarose pour l&#39;injection: Dans une boîte de Pétri de 60 mm en plastique, posez une petite 35mmX35mm pèsent bateau sur fondue de 2,5% d&#39;agarose en 0.1XMMR eau pour créer une dépression avec un fond d&#39;agarose enduits pour le remplissage avec des oeufs. Une fois gélose a durci, l&#39;envelopper dans du parafilm et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. Faire 2-3 plats à l&#39;avance pour chaque réaction transgéniques vous envisagez de faire. Pompe à perfusion: Nous utilisons une pompe seringue de perfusion de Harvard Apparatus, équipé avec une seringue cc 3 / aiguille rempli d&#39;huile minérale (Sigma M-8410). Blunt bout de l&#39;aiguille de seringue (pour l&#39;empêcher de perforer le tube) et attacher le tuyau Tygon fine. Faites fonctionner la pompe à ~ 10nl/sec, ce qui suppose que le temps de l&#39;aiguille est dans chaque œuf ne sera pas supérieure à 1 sec. La pompe doit être pré-tourner pendant plusieurs minutes avant de transgénèse de départ pour la journée afin de s&#39;assurer que le piston de la seringue est à fleur avec le piston et ce flux positifs de l&#39;huile du tube est en cours. Aiguilles pour les transferts nucléaires. L&#39;utilisation d&#39;un extracteur de micropipette, générer des aiguilles avec une longue pointe en pente. Clip avec une pince à ces sous un microscope à dissection équipé d&#39;un micromètre oculaire pour obtenir une ouverture ~ microns 80 avec une forme biseautée. Autres équipements: Xenopus laevis femelles, stéréomicroscope, incubateur, micromanipulateur, extracteur d&#39;aiguilles de microinjection (par exemple le modèle P-87, Sutter), aiguilles de seringues (26 gauge), les aiguilles de microinjection verre, micromètre oculaire pour la tonte des pointes d&#39;aiguille calibrée au diamètre 80μm microinjection, des boîtes de Pétri, peser bateaux 35mm, tube Tygon (ID = 1 / 32 po, OD = 3 / 32 po)

production of transgenic xenopus laevis by restriction enzyme mediated integration and nuclear transplantation

L&#39;intégration stable de produits de gène cloné dans le génome de Xenopus est nécessaire de contrôler l&#39;heure et le lieu d&#39;expression, d&#39;exprimer des gènes à des stades ultérieurs du développement embryonnaire, et de définir comment les amplificateurs et les promoteurs régulent l&#39;expression génique au sein de l&#39;embryon. Le protocole démontré ici peuvent être utilisés pour produire efficacement transgéniques Xenopus laevis embryons. Cette approche implique la transgénèse trois parties: 1. Noyaux spermatozoïdes sont isolés des adultes X. testicule laevis par traitement avec lysolécithine, qui perméabilise la membrane plasmique des spermatozoïdes. 2. Extraire des oeufs est préparé par centrifugation à faible vitesse, ajout de calcium pour provoquer l&#39;extrait de progresser vers l&#39;interphase du cycle cellulaire, et une centrifugation à haute vitesse pour isoler cytosol interphase. 3. Transplantation nucléaire: les noyaux et extraire sont combinés avec l&#39;ADN plasmidique linéarisé d&#39;être présenté comme le transgène et une petite quantité d&#39;enzyme de restriction. Lors d&#39;une réaction très court, extrait d&#39;oeuf décondense partie de la chromatine des spermatozoïdes et l&#39;enzyme de restriction génère cassures chromosomiques qui favorisent la recombinaison du transgène dans le génome. Les noyaux des spermatozoïdes traités sont ensuite transplantées dans les œufs non fécondés. L&#39;intégration du transgène se produit habituellement avant le premier clivage embryonnaire tels que les embryons qui en résultent ne sont pas chimériques. Ces embryons peuvent être analysées sans qu&#39;il soit nécessaire de se reproduire à la prochaine génération, permettant la génération rapide et efficace des embryons transgéniques pour des analyses de promoteur et de la fonction des gènes. Adulte X. laevis résultant de cette procédure également propager le transgène dans la lignée germinale et peut être utilisé pour générer des lignées d&#39;animaux transgéniques à des fins multiples.

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Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Ce protocole vidéo montre une méthode pour générer des transgéniques<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Par l&#39;introduction de transgènes dans les noyaux des spermatozoïdes suivie par transplantation nucléaire dans les œufs non fécondés.

La production de transgéniques Xenopus laevis Intégration par médiation des enzymes de restriction et de la transplantation nucléaire

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

production-transgenic-xenopus-laevis-restriction-enzyme-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

11.8K vues.  University of Manchester. Ce protocole vidéo montre une méthode pour générer des transgéniques Xenopus laevis Par l'introduction de transgènes dans les noyaux des spermatozoïdes suivie par transplantation nucléaire dans les œufs non fécondés.

Vidéo: Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastique Embedding et le sectionnement des embryons de Xenopus laevis

Recherche

Biologie

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Obtention des oeufs de Xenopus laevis femelles

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Préparation et fractionnement de Xenopus laevis oeufs Extraits

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Assemblée nucléaire utilisant fractionnée extraits d&#39;œufs de Xénope

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Imagerie des cellules vivantes et de l&#39;analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Transplantations faciales<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissection de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crête neurale pour<em&gt; In vitro</em&gt; Culture explantation ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Utilisation plusTipTracker Software mesurer microtubules Dynamics<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cônes de croissance

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis comme un modèle pour identifier traduction Dépréciation

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...