Nous remercions David Theilmann (Pacific Agri-Food Research Centre, à Summerland, en Colombie-Britannique) pour fournir les AcMNPV baculovirus et de discussion utile. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation canadienne pour l&#39;innovation (FCI), les Instituts canadiens de recherche en santé du Canada (IRSC), la Fondation Michael Smith pour la recherche en santé (MSFHR), et les sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) .

Partie 1: Préparation des ovocytes de Xenopus pour la microinjection <ol><li> Placer un petit morceau (environ 2 cm) de Xenopus laevis ovaire dans un tube conique de 50 ml contenant 20 ml de solution de collagénase (5 mg / ml de collagénase en calcium sans modification Barth salin: 88 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 0,82 mm MgSO 4, 10 mM Hepes, pH 7,5). La collagénase est utilisée pour enlever les cellules folliculaires qui entourent l&#39;ovocyte. </li><li> Placer le tube sur une plateforme shaker et le rock en douceur (à 100 RPM) pendant une heure. Cette fois-ci varie en fonction de différents lots de la collagénase. Ainsi, après une heure, prendre un petit échantillon d&#39;ovocytes et de les examiner sous un microscope à dissection. Correctement de-folliculated ovocytes doivent être bien séparés les uns des autres, et il devrait être facile à insérer une aiguille de verre dans l&#39;ovocyte. Si les ovocytes ne sont pas suffisamment dé-folliculated, ils sont laissés dans la solution de collagénase et vérifié à nouveau toutes les cinq minutes. </li><li> Lavez les ovocytes à trois reprises avec une solution saline modifiés Barth (MBS: 88 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 0,82 mM MgSO 4, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 0,41 mM de CaCl2, 10 mM Hepes, pH 7,5), et de les transférer un plat de 100 mm de diamètre de Petri contenant MBS majoré de 1% de pénicilline / streptomycine. Les ovocytes sont maintenant prêtes à être microinjectés. Si la micro-injection sera effectuée sur un autre jour, de stocker les ovocytes à 4 ° C jusqu&#39;à une semaine. </li><li> En utilisant un microscope à dissection, sélectionnez matures ovocytes stade VI pour la microinjection. Ces ovocytes sont grandes, avec un bon contraste entre l&#39;hémisphère animal noir et de l&#39;hémisphère de couleur crème végétale. </li><li> Transférer les ovocytes matures stade VI dans une plaque de microtitration (Nunc, volume 10 ul bien). Cela devrait être fait avec soin, en utilisant une pipette de 200 pl avec une pointe de pipette qui a été coupé à la fin pour permettre d&#39;aspiration sans perturbation des ovocytes. </li></ol> Partie 2: microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus <ol><li> Préparer le substrat d&#39;importation soit microinjectés en ajoutant une petite quantité de bleu de bromophénol à 1%, pour aider à la visualisation de la micro-injection. Par exemple, nous ajoutons 1 pl de bleu de bromophénol à 10 ul de substrat. </li><li> Placer une petite bande de Parafilm sur un plat de 100 mm de diamètre de Petri, et dispenser une baisse de 5 pl de la solution à injecter sur la bande de Parafilm. </li><li> Remplir une aiguille d&#39;injection préalablement étalonné (obtenu en tirant un 6,6-ul micropipette Drummond avec la Injecter + Matic Puller) avec la solution à injecter. Pour cela, le microinjecteur est réglé sur le mode d&#39;aspiration. Pour calibrer l&#39;aiguille d&#39;injection faire des marques de points sur l&#39;aiguille tous les 0,5 mm, ce qui correspond à un volume de 50 nl. </li><li> Pour l&#39;injection cytoplasmique, insérez la pointe de l&#39;aiguille dans un ovocyte dans l&#39;hémisphère végétatif, très proche de l&#39;hémisphère animal, à un angle d&#39;environ 45 degrés. Tournez le réglage microinjecteur d&#39;microinject et microinject chaque ovocyte avec 50 nl du substrat à l&#39;importation. Les marques de point sur l&#39;aiguille sont utilisés pour contrôler la quantité de substrat qui a été injecté. </li><li> Transfert des ovocytes injectés à un petit (35 mm de diamètre) boîte de Pétri remplie de MBS, et incuber à température ambiante pour la quantité désirée de temps (le temps des points sont choisis de manière à permettre l&#39;observation du substrat à l&#39;importation associés avec les PNJ, ce qui se produit entre 10 et 30 minutes pour les protéines et les virus qui sont activement transportés vers les PNJ, ce temps dépend aussi sur le site d&#39;injection et de la taille de la protéine / virus). </li><li> Lorsque l&#39;incubation est terminée, le transfert d&#39;ovocytes dans un flacon en verre de 4 ml contenant du glutaraldéhyde à 2% en MBS, et de fixer une nuit à 4 ° C. </li></ol> Partie 3: Dissection d&#39;ovocytes de Xenopus <ol><li> Le lendemain, lavez les ovocytes 3 fois avec MBS. </li><li> Transfert des ovocytes à une petite boîte de Petri remplie avec le tampon de faible teneur en sel (LSB: 1 mM de KCl, 0,5 mM MgCl2, 10 mM d&#39;HEPES, pH 7,5). En utilisant un microscope à dissection et la dissection des pinces à épiler, retirez le pôle végétal de chaque ovocyte. Il est utile pour stabiliser l&#39;ovocyte étant disséqués avec une paire de pincettes, tandis que l&#39;autre paire est utilisée comme des ciseaux pour enlever le pôle végétal. A ce stade, il est possible d&#39;évaluer le succès de la micro-injection par la présence d&#39;une teinte bleue dans le cytosol. Le protocole est poursuivi uniquement pour les ovocytes qui ont été microinjectés succès. En outre, si les échantillons doivent être préparés pour EM, cette étape de dissection, il est beaucoup plus facile de trouver le noyau lors de la coupe et la coupe des échantillons. </li><li> Fixer les ovocytes disséqués à nouveau avec du glutaraldéhyde à 2% en LSB pendant une heure à température ambiante. </li><li> Après fixation, laver les ovocytes disséqués à trois reprises avec LSB. </li></ol> Partie 4: Préparation des ovocytes injectés pour l&#39;intégration et EM-mince de sectionnement <ol><li> Transfert des ovocytes disséqués sur une lame de dépression. Aspirer le plus de liquide que possiblesible, puis rapidement (afin qu&#39;elles ne se dessèchent pas) couvrir les ovocytes disséqués avec 2% d&#39;agarose à faible point de fusion. Alors que l&#39;agarose est encore molle, utilisez une pointe de pipette pour séparer les uns des autres ovocytes, et de s&#39;assurer que chaque ovocyte est face vers le haut ou vers le bas (pas de côté). </li><li> Laisser l&#39;agarose à solidifier pendant environ 10 minutes. Une fois que l&#39;agarose se solidifie, utiliser une lame de rasoir pour couper l&#39;agarose en petits morceaux, chacun contenant un ovocyte disséqués. </li><li> Placez les ovocytes d&#39;agarose-incorporé dans un flacon en verre de 4 ml, et les après-fixer avec 1% OsO 4 en LSB pendant une heure à température ambiante. </li><li> Laver l&#39;échantillon à trois reprises en LSB. Si nécessaire, conserver l&#39;échantillon à 4 ° C la nuit et continuer le protocole le jour suivant. </li><li> Séquentiellement déshydrater les échantillons dans une série ascendante de l&#39;alcool (50, 70 et 90% d&#39;éthanol pour 20 minutes chacun). Il est suivi par deux changements dans l&#39;éthanol à 100% pendant 15 min chacune. Enfin déshydrater les échantillons avec de l&#39;acétone à 100% pendant 15 min. </li><li> Infiltrez les échantillons avec un mélange 1:1 d&#39;Epon (Fluka) et l&#39;acétone pendant une heure, suivie d&#39;une infiltration avec un mélange 2:1 d&#39;Epon et de l&#39;acétone pendant deux heures, et enfin dans le plus pur Epon pendant au moins six heures. </li><li> Placer les échantillons dans des moules plats intégrant rempli de frais et pur Epon. Les ovocytes sont orientés de telle façon que le côté du noyau plus proche du site d&#39;injection - dans ce cas le côté de l&#39;ovocyte qui a été disséqué - sera sectionné en premier. Cette étape permet d&#39;optimiser les chances de visualiser l&#39;importation du substrat choisi. </li><li> Enfin, la polymérisation de la Epon pendant deux jours à 60 ° C. </li><li> Afin de visualiser les échantillons, les blocs sont taillés, puis sectionnés à l&#39;aide un ultramicrotome. Les articles sont transférés sur des grilles EM, teinté en utilisant la procédure standard, et visualisées avec un microscope électronique à transmission. Nous n&#39;allons pas montrer cette partie du protocole car elle est la procédure standard EM. </li></ol> Partie 5: Résultats du représentant: Si le protocole a été un succès, puis l&#39;enveloppe nucléaire (NE) et les PNJ doivent être clairement visibles dans EM micrographies. Selon le injecté substrat et la quantité de temps entre l&#39;injection et la fixation, le substrat doit être visible à la face cytoplasmique de l&#39;APN, dans le PNJ, ou sur le front nucléaire de l&#39;APN. La figure 1 montre une coupe transversale NE à cytoplasme adjacent (c) et le noyau (n) à partir d&#39;un ovocyte de Xénope qui a été injecté avec des capsides de l&#39;AcMNPV de baculovirus, incubée à 4 ° C pendant quatre heures, et traitées pour l&#39;intégration et de section mince EM tel que décrit. Pointes de flèches point à des PNJ. Un accueil capside à la face cytoplasmique d&#39;un PNJ est indiquée par une flèche blanche. En revanche, la figure 2 montre une coupe transversale NE à cytoplasme adjacent (c) et le noyau (n) à partir d&#39;un ovocyte de Xénope qui a été injecté avec le virus minute parvovirus de la souris (MVM), incubée à température ambiante pendant quatre heures, et traitées pour l&#39;intégration et de section mince EM tel que décrit. En utilisant cette technique, nous avons constaté que MVM induit des perturbations de la NE (Cohen et Pantè, 2005). Les parenthèses indiquent des ruptures dans le NE. Pointes de flèches point à des PNJ. Capsides MVM putatifs associés à la NE sont indiquées par des flèches blanches. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="Figure 1" width="600" height="459" /> Figure 1: Micrographie électronique d&#39;un NE section transversale cytoplasme adjacent (c) et le noyau (n) à partir d&#39;un ovocyte de Xénope qui a été injecté avec des capsides du baculovirus Ac MNPV, incubée à 4 ° C pendant quatre heures, et traitées pour enrobage et de lames minces EM tel que décrit. Pointes de flèches point à des PNJ. Capsides sont indiquées par des flèches blanches. Barre d&#39;échelle: 100 nm. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="Figure 2" width="600" height="264" /> Figure 2: Micrographie électronique d&#39;un NE section transversale cytoplasme adjacent (c) et le noyau (n) à partir d&#39;un ovocyte de Xénope qui a été injecté avec le virus minute parvovirus de la souris (MVM), incubée à température ambiante pendant quatre heures, et traitées pour l&#39;intégration et de section mince EM tel que décrit. Pointes de flèches point à des PNJ. Les parenthèses indiquent des ruptures dans le NE. Capsides MVM putatifs associés à la NE sont indiquées par des flèches blanches. Barre d&#39;échelle: 100 nm.

<ol>
	<li>Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies.">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li><li>Pant&#233;, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm.">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li><li>Rabe, B., Vlachou, A., Pant&#233;, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome.">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li><li>Cohen, S., Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+Envelope:+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope.">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li><li>Pant&#233;, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy.">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li></ol>

Microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus combinée avec de fines coupes-EM est un outil très efficace pour étudier le transport nucléocytoplasmique. Ce système a été utilisé pour cartographier les étapes distinctes de l&#39;importation par le NPC, d&#39;interaction exemple d&#39;un substrat import nucléaire avec des composants structurels de l&#39;APN, comme les filaments cytoplasmiques et nucléaires panier (revu par Pantè, 2006). Il a également été utilisée pour étudier l&#39;import nucléaire ...

microinjection of xenopus laevis oocytes

Microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus laevis suivie mince sectionnement microscopie électronique (EM) est un excellent système pour étudier le transport nucléocytoplasmique. En raison de son gros noyau et une forte densité de complexes des pores nucléaires (NPC), transport de matières nucléaires peuvent être facilement visualisés dans l&#39;ovocyte de Xénope. Beaucoup de perspicacité dans les mécanismes de l&#39;importation et l&#39;exportation nucléaire a été acquise grâce à l&#39;utilisation de ce système (revu par Pantè, 2006). En outre, nous avons utilisé la microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus pour disséquer les voies import nucléaire de plusieurs virus qui se répliquent dans le noyau hôte. Ici nous démontrer la micro-injection cytoplasmique des ovocytes de Xenopus avec un substrat import nucléaire. Nous montrons aussi la préparation des ovocytes injectés pour la visualisation par de minces coupes-EM, y compris la dissection, la déshydratation, et l&#39;inclusion des ovocytes dans une résine époxy intégration. Enfin, nous fournissons des résultats représentatifs pour les ovocytes qui ont été micro-injecté avec la capside du nucléopolyhédrovirus baculovirus Autographa californica (AcMNPV) ou le virus minute parvovirus de la souris (MVM), et de discuter des applications potentielles de cette technique.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes at JoVE.com

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Ici nous démontrons micro-injection cytoplasmique de la<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Ovocytes avec un substrat import nucléaire, ainsi que la préparation des ovocytes injectés pour la visualisation par microscopie électronique mince sectionnement.

Microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Research

JoVE Journal

Biology

22.8K vues.  University of British Columbia - UBC. Ici nous démontrons micro-injection cytoplasmique de la Xenopus laevis Ovocytes avec un substrat import nucléaire, ainsi que la préparation des ovocytes injectés pour la visualisation par microscopie électronique mince sectionnement.

Vidéo: Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastique Embedding et le sectionnement des embryons de Xenopus laevis

Recherche

Biologie

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Obtention des oeufs de Xenopus laevis femelles

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Préparation et fractionnement de Xenopus laevis oeufs Extraits

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Enregistrement Patch Clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualisation de localisation de l&#39;ARN Xenopus Les ovocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

La fertilisation des Ovocytes de Xenopus En utilisant la méthode de transfert d&#39;hôte

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Détermination des tissus Utilisation de la transplantation Cap animale (ACT) Dosage dans<em&gt; Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Imagerie des cellules vivantes et de l&#39;analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Transplantations faciales<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Utilisation plusTipTracker Software mesurer microtubules Dynamics<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cônes de croissance

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...