Pour commencer, incubez des œufs de poule fécondés dans un incubateur humidifié à 38 degrés Celsius. Disséquez maintenant les peaux dorsales d’embryons de poulet de stade 30 à 33 dans HBSS. Ensuite, incubez les peaux dans une solution saline deux fois sans calcium et sans magnésium avec 0,25% d’EDTA pendant 15 à 20 minutes.
Séparez soigneusement l’épithélium et le MESENCHYME à l’aide d’une pince d’horloger et déplacez le matériau séparé vers HBSS, placé sur de la glace. Recueillez le mésenchyme séparé dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et ajoutez deux millilitres de trypsine de collagénase à 0,1 % fabriquée dans du PBS. Ensuite, incubez la solution dans un bain-marie.
Ensuite, à l’aide d’une pipette pasteure, dispersez le mésenchyme cutané en une suspension unicellulaire. Ajoutez ensuite huit millilitres de DMEM contenant 10% de sérum de veau fœtal pour arrêter la digestion. Centrifugez les cellules à 233G pendant cinq minutes.
Remettez ensuite la pastille en suspension dans le milieu de culture. Ensuite, placez un insert de culture cellulaire dans un puits d’une boîte à six puits, déposez une gouttelette de 10 microlitres de cellules mésenchymateuses sur l’insert. Dans le puits à l’extérieur de l’insert, pipetez deux millilitres de DMEM avec 10% de sérum de veau fœtal.
Incuber les cellules plaquées à 37 degrés dans un incubateur composé de 5% de dioxyde de carbone et de 95% d’air pendant une heure. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférez l’épithélium intact sur la gouttelette mésenchymateuse plaquée. Aplatir l’épithélium intact sur le mésenchyme pour former l’explant de peau reconstituée.
Laissez une fine couche de médium sur l’insert pour maintenir la peau de l’explant semi-humide. Fournissant une interface air/liquide, incubez l’explant de peau reconstituée à 37 degrés dans un incubateur avec 5% de dioxyde de carbone et 95% d’air environnemental. Les cultures d’organes ex vivo apparaissent homogènes au début, de courts bourgeons de plumes se forment après deux à trois jours de culture et de longs bourgeons de plumes se forment après quatre à cinq jours de culture.
