Ce travail a été soutenu par des fonds provenant du Midwest University College of Health Sciences Facilitation de la recherche Grant attribué à EEH et du Midwest Bureau Université de recherche et des programmes intra-muros Sponsored subvention accordée à KJL.

Ce protocole est conforme aux principes de bien-être des animaux AVMA pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) à l&#39;Université du Midwest. 1. Préparation d&#39;anesthésie, équipement, et médias <ol><li> Déchlorer environ 1,5 L d&#39;eau du robinet en utilisant soit un agent commercial de déchloration (disponible dans les magasins pour animaux de compagnie) ou en laissant reposer l&#39;eau pendant 24 heures. Obtenez trois béchers 1 L et remplir chacune avec 500 ml d&#39;eau déchlorés. Label One pour la tenue de poissons avant toute procédure et l&#39;autre pour la récupération. Pour la troisième bêcher, ajouter 100 pg / ml de méthanesulfonate de tricaïne; cela devient le bécher dans laquelle les poissons seront anesthésiés. </li><li> Remplir un plateau peu profond avec de la glace, chauffer le milieu de culture (RPMI 1640, 10% de FBS (sérum fœtal bovin), 50 ug / ml de gentamycine, 100 ug / ml de kanamycine, HEPES 25 mM) à la température ambiante, et recueillir les pincettes de bijoutier propre. Pinces propres par immerchanter les conseils dans 70% d&#39;éthanol et passer à travers un bec Bunsen, permettant à l&#39;éthanol pour brûler. </li><li> Décider si la procédure sera effectuée sans grossissement, avec un, table éclairée loupe commercial avec 2 - grossissement 10X, ou binoculaire (entièrement dépendante de préférence personnelle). </li></ol> 2. Établir cultures d&#39;explants <ol><li> Attrapez le nombre désiré de poissons et le placer dans un bécher de maintien. Transférer un seul poisson dans le bécher d&#39;anesthésie; il est préférable pour anesthésier les poissons individuellement. </li><li> Surveiller les effets de l&#39;anesthésie en observant la piscine et les branchies mouvement du poisson. Comme l&#39;anesthésie progresse, le mouvement des branchies ralentit et le poisson nagera erratique et souvent la tête en bas; envisager de poissons anesthésiés dès qu&#39;un mouvement maillant cesse. Ne laissez pas le poisson pendant de longues périodes dans le bain de l&#39;anesthésie car cela peut entraîner la mort des poissons. </li><li> Retirer le poisson du bécher d&#39;anesthésie et de transfertà la glace, plaçant le poisson horizontalement avec la queue en face de la tenue des pincettes main. Si l&#39;expérience avec la technique et si plusieurs poissons doivent être utilisés pour faire des explants, envisager de placer le poisson prochaine dans le bécher d&#39;anesthésie à ce moment. </li><li> Pour enlever les écailles, pincettes de position parallèle au poisson avec pointe à bord de l&#39;échelle. Appuyer sur le côté plat de la pince légèrement sur le côté du poisson pour amener l&#39;échelle d&#39;élever à partir du corps du poisson. Saisissez échelle avec des pincettes, arrache, et le lieu (sans inversion) en boîte de culture de tissu. Répétez la procédure, la suppression d&#39;un maximum de 12 échelles d&#39;un adulte de grande taille (six de chaque côté), en évitant la région des branchies, la ligne latérale, et les nageoires. </li><li> Placer le poisson dans le bécher de récupération et de surveiller pour se assurer qu&#39;il se remet des effets de l&#39;anesthésie. A cette époque, les poissons peuvent être transférés à un réservoir individuel. Laisser le poisson pour récupérer pendant au moins 21 jours pour permettre une régénération complète de l&#39;échelle. </li><li> En fonction de laconception expérimentale, placer jusqu&#39;à 20 échelles par boîte de culture de tissu traité 35 mm en plastique ou 4-6 échelles par verre plat en bas. Échelles permettent d&#39;adhérer à l&#39;antenne avant d&#39;ajouter doucement les médias afin de ne pas détacher échelles de le plat. NOTE: Avec l&#39;expérience, plusieurs poissons peuvent être traitées avant que le média est ajouté au premier plat. </li><li> Ajouter 1,2 ml de milieu complet (voir 1.2 ci-dessus) dans chaque boîte de 35 mm. </li><li> De préférence incuber les cultures d&#39;explants à 28 ° C dans 5% de CO2 pendant la période de temps désirée avec ou sans traitement supplémentaire. En variante, incuber les cultures sur une platine de microscope ou chauffé dans une chambre de culture de cellules vivantes pour la microscopie vidéo. </li></ol> 3. Brightfield et vidéo microscopie <ol><li> plats de position contenant feuilles de cellules sur la platine du microscope et initialement mise au point avec l&#39;objectif 4X. NOTE: Supérieur grossissements peuvent être utilisées, en fonction de l&#39;expérience. Marquer l&#39;emplacementchaque feuille et / ou l&#39;orientation de l&#39;antenne sur la scène cellule faciliteront la prise d&#39;images au cours du temps avec les feuilles à peu près la même orientation. </li><li> Retirez les plats de l&#39;incubateur et la photographie à divers points de temps, en fonction de chaque protocole expérimental et remettez-le dans l&#39;incubateur si seulement les images fixes sont nécessaires sur la période expérimentale. </li><li> En effectuant la microscopie vidéo, faites attention à ce qui suit: <ol><li> Positionner la feuille de cellules échelle / émergeant à l&#39;intérieur du champ de vision de telle sorte que la feuille de cellules migration reste dans le champ de vue pour la durée de la vidéo. NOTE: Cela peut prendre une certaine expérience en observant la façon dont les cellules migrent sous l&#39;échelle. Pour de courtes vidéos, ce est moins préoccupante que pour des vidéos plus longues. </li><li> Pour des délais plus courts, incuber à RT. Pour des délais plus longs (18+ RH), utiliser un stade chauffé ou une chambre d&#39;incubation pour maintenir la température, l&#39;équilibre du pH, et de minimiser l&#39;évaporation de la culture moyen. </li></ol></li></ol> 4. Fixation pour immunofluorescence Microscopie <ol><li> Préparer et pré-chaudes toutes les solutions à 28 ° C. Pour voir kératocytes sous fluorescence, développer les cultures d&#39;explants comme décrit ci-dessus en utilisant 35 mm boîtes de culture de tissus à fond de verre. Vous pouvez également utiliser les diapositives de la chambre de verre. </li><li> Ajouter 0,8 ml de 4% de paraformaldehyde dans PBS 1,1x à chaque plat. Ne pas retirer d&#39;abord le milieu de culture. Incuber à température ambiante pendant 5 min, puis aspirer pour éliminer la solution. </li><li> Ajouter 0,8 ml de 4% de paraformaldehyde dans PBS 1,1x à chaque plat. Incuber à température ambiante pendant 5 min, puis aspirer pour éliminer la solution. </li><li> A moins d&#39;utiliser des ligands externes ou extérieures, des epitopes des cellules perméabiliser par addition de 0,5 ml de 0,2% de Triton X-100 dans du PBS 1X. Incuber à température ambiante pendant 5 min, puis aspirer pour éliminer la solution. </li><li> Ajouter 0,5 ml de BSA à 1% dans du PBS 1x et incuber pendant 1 heure (à température ambiante) ou O / N (à 4 ° C). REMARQUE: Selon les conditions expérimentales, phalloidin peut être ajouté à cette étape. </li><li> Après incubation, aspirer la solution pour supprimer et procéder à la coloration des anticorps. Alternativement, stocker les boîtes de culture en ajoutant au moins 1-2 ml de 1% de BSA dans PBS 1x pour 3-4 semaines à 4 ° C. </li></ol> 5. Protocole d&#39;immunofluorescence <ol><li> Préparation des solutions d&#39;anticorps primaires et secondaires selon les recommandations du fabricant. REMARQUE: si les recommandations du fabricant ne sont pas disponibles, une bonne dilution de départ d&#39;anticorps primaires (à 1% de BSA dans du PBS 1x) est de 1: 500 pour polyclonaux et 1: 1000 pour les anticorps monoclonaux; une bonne dilution de départ pour des anticorps secondaires est de 1: 1000. Régler ces dilutions du stock d&#39;origine obtenu du fabricant plus élevé si le signal est faible, plus faible si le signal est fort et le fond est un problème. </li><li> Aspirer la BSA à 1% dans une solution PBS 1x. Ajouter 0,5 ml de solution d&#39;anticorps primaire et incuber pendant 1 heure (à température ambiante) ou O / N (à 4 ° C). </li&gt; <li> Retirer la solution d&#39;anticorps primaire, placer dans un récipient propre et étiqueté tube de 1,5 ml microcentrifugeuse, et congeler à -20 ° C. REMARQUE: Ceci permet la réutilisation de l&#39;anticorps primaire, si nécessaire. </li><li> Laver la capsule 3-5 fois avec du PBS 1x, l&#39;élimination et le rejet du PBS après chaque lavage. </li><li> Ajouter 0,5 ml de solution d&#39;anticorps secondaire. Si désiré, ajouter phalloïdine marquée par fluorescence (suite à la concentration recommandée de ne importe quel fabricant) pendant cette étape. Incuber pendant 1 heure (à température ambiante) ou O / N (à 4 ° C). NOTE: L&#39;utilisation de phalloïdine marquée par fluorescence permet la visualisation des filaments d&#39;actine; nous avons constaté que 488 phalloïdine marquée fonctionne le mieux dans nos kératocytes poisson zèbre, mais d&#39;autres fluorophores peut être utilisé. </li><li> Retirez et jetez la solution d&#39;anticorps secondaire. </li><li> Laver la capsule 3-5 fois avec du PBS 1x, l&#39;élimination et le rejet du PBS après chaque lavage. NOTE: Le plat peut être stocké, couverte de la lumière, à 4 ° C se il est incapable de rivaliserw immédiatement; assurez-vous que 1x PBS est ajouté dans le plat avant de le ranger pour assurer les cellules ne se dessèchent pas, mais réchauffer à température ambiante (20 à 30 min), puis retirer la PBS juste avant de passer à l&#39;étape suivante. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à observer, ajouter 2 à 3 gouttes d&#39;un milieu de montage, avec ou sans DAPI, selon les besoins expérimentaux, dans le plat et laisser reposer pendant 10 min à température ambiante. NOTE: Nous utilisons, un milieu de montage à base de glycérol disponible dans le commerce avec DAPI, mais d&#39;autres milieux de montage peut être utilisé. Permettre 10 min pour le milieu de montage de se asseoir dans le plat facilite le retrait facile de la lamelle de verre du fond du plat. </li><li> Après incubation, presser doucement sur les côtés du plat pour desserrer et retirer la lamelle. Ajouter une baisse supplémentaire de milieu de montage sur une lame de verre et placer la lamelle, cellules vers le bas, sur la lame. REMARQUE: Pensez à sceller la lamelle à la diapositive à l&#39;aide du vernis à ongle clair si la lame doit être maintenu pendant plus de 1-2 jours. </li><li> Observer la lame sous un microscope à fluorescence. REMARQUE: La plupart de nos images ont été prises avec un objectif 40X ou 63X objectif sous huile, mais l&#39;objectif spécifique utilisé dépendra du protocole expérimental. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).</li><li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture.">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li><li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis.">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., &amp; Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li><li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics.">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li></ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

L&#39;étape la plus critique pour le succès de la culture d&#39;expiant kératocyte permet à l&#39;échelle d&#39;adhérer à la boîte de culture pendant environ 2-3 min avant l&#39;addition du milieu de culture. Environ 75% des échelles va adhérer et de grandir feuilles (le nombre de cultures établies pour chaque expérience devra être ajustée en conséquence). les feuilles de kératocytes ne forment pas autour de chaque échelle présente dans le poisson et mis en culture pour plusieurs raisons. Tout d&#39;ab...

<html> Les études de motilité cellulaire sont traditionnellement concentrées sur cellules en migration individuellement. Kératinocytes cultivées à partir de poissons et d&#39;amphibiens explants se sont révélés être un système modèle puissant pour étudier les mécanismes de la motilité cellulaire utilisant la modélisation expérimentale et mathématique approches 1-6. Les travaux expérimentaux sur les cellules migrent individuellement est aidée par le mouvement de glisse rapide, lisse des cellules, tout en maintenant un uniforme forme, la vitesse, et la direction. Cependant, in vivo, les cellules se déplacent collectivement fréquemment, tout en maintenant les jonctions cellule-cellule, en particulier au cours de l&#39;embryogenèse, la cicatrisation des plaies, et les métastases. Ainsi, la migration cellulaire collective est une zone de croissance et de plus en plus important de la recherche dans le domaine de la migration cellulaire. La migration collective de ces cellules a été récemment décrit 7 et il a de nombreuses caractéristiques uniques qui en font un système puissant pour étudier la migration cellulaire collective dans un modèle de cicatrisation. ove_content &quot;&gt; Lorsque échelles sont cueillies à partir d&#39;un poisson zèbre adulte anesthésié, certains tissu épithélial reste attaché à la face inférieure de l&#39;échelle. Lorsque milieu de culture cellulaire est ajouté, ces cellules épithéliales, ou kératinocytes, migrent rapidement une unité collective de l&#39;échelle. La culture d&#39;expiant peut être considérée comme un modèle de cicatrisation de l&#39;épithélium de la plaie, dans lequel les cellules migrent loin de l&#39;explant comme ils le feraient à travers la matrice provisoire d&#39;un lit de la plaie pour rétablir un epithelium intact. Des données récentes suggèrent que cette ex vivo imite de culture de nombreuses caractéristiques de in vivo la cicatrisation chez le poisson zèbre adulte. Les taux de fermeture de plaies 8 traduisent par une vitesse de migration similaire à celle observée dans l&#39;ex vivo système 7. En outre, dans une plaie modèle in vivo de guérison, le traitement par warfarine suggère que l&#39;hémostase n&#39;a aucun effet sur ​​le taux de guérison, tandis que le traitement par hydrocortisone pour diminuer la réponse immunitaire ne tardez pas réépithélialisation 8 </sup&gt;. Comme le poisson zèbre ne saigne pas lorsque l&#39;échelle est retiré de l&#39;animal, l&#39;hémostase ne est pas un acteur majeur. Bien que nous avons trouvé des cellules immunitaires dans les explants, nous ne avons pas étudié les effets qu&#39;ils pourraient avoir sur la migration cellulaire collective. Le protocole présenté ici décrit comment établir cultures kératocyte d&#39;explants de poisson zèbre qui assurent la cohérence et la reproductibilité pour une utilisation dans de nombreux dosages biologiques. Ces cultures d&#39;explants sont particulièrement convaincante modèle in vitro pour la migration cellulaire collective pour plusieurs raisons. Tout d&#39;abord, les kératinocytes de poisson zèbre sont des cellules primaires utilisées dans les heures d&#39;établir cultures d&#39;explants. Par conséquent, ces cellules ne ont pas subi les changements morphologiques et génétiques expression associée à passage de cellules primaires 9-13. D&#39;autre part, ce système constitue un modèle pour l&#39;étude de réépithélialisation en réponse à blessant 14 et, dans le cadre de la réponse à une blessure, un épithéliale mésenchymateuses à transition (EMT) processus est lancé comme en témoignent les changements dans l&#39;expression des gènes et des réarrangements du cytosquelette 14,15. Ainsi, les modifications de fond de l&#39;expression génique et la motilité qui se produisent dans les cellules non traitées ont été caractérisés et fournir un contexte pour interpréter les changements avec le traitement. En outre, le kératocytes du poisson et le kératinocyte humain sont fonctionnellement équivalents; les deux sont des cellules épithéliales primaires de leurs espèces respectives et jouent un rôle clé dans la cicatrisation epitheliale. Troisièmement, le poisson zèbre adulte sont plus en plus reconnue comme un système modèle pour une variété de maladies humaines 16-18 y compris le mélanome et d&#39;autres cancers 19-21, plaies cutanées guérison 8,14 et la régénération des tissus 22-24. Les avantages techniques de ce système de modèle sont tout aussi convaincants. Un nombre croissant de lignées mutantes et transgéniques sont disponibles auprès but non lucratif, des installations centralisées. Plus précisément, le projet Mutation poisson zèbre (ZMP) Au Wellcome Trust Sanger Institute vise à créer un allèle de KO dans chaque codant pour la protéine gène dans le génome du poisson zèbre. Actuellement, ils ont muté 11.892 gènes, environ 45% du génome, avec 24 088 alleles caractérisés. En outre, ZMP accepte les propositions et générera gratuitement knock-out. Des méthodes récentes de knockdown de gènes dans des larves et des adultes poisson zèbre 25-28 offrent une flexibilité pour étudier la fonction des gènes importants pour le développement pour lesquels des approches transgéniques sont problématiques ou impraticable. En raison de leurs taux extrêmement rapides de la motilité de ~ 145 um / h peu après l&#39;établissement de cultures 29, les essais peuvent être achevées rapidement (généralement en 24 heures ou moins). Comme les expériences peuvent être achevées rapidement et les cultures poussent bien à la température ambiante, plusieurs des obstacles techniques associés à des mammifères essais de migration cellulaire impliquant la microscopie vidéo sont évités. En outre, à l&#39;ère de resserrement des budgets de recherche, zebrafish sont facilement et économiquement maintenue. La structure et le comportement de l&#39;explant est complexe. Comme les poissons ne saignent pas lorsque l&#39;échelle est supprimé, il est peu probable que beaucoup plus que les couches superficielles de l&#39;épiderme sont retirés avec l&#39;échelle. Kératocytes semblent être le type cellulaire prédominant dans l&#39;expiant lorsque les échelles sont d&#39;abord retirés du poisson comme la grande majorité des cellules apparaissent pour colorer avec un anticorps anti-E-cadhérine 14. En outre, il ne existe aucune preuve de fibroblastes dans la culture initiale en juger par l&#39;absence de coloration par immunofluorescence de la vimentine 14. Cependant, avec suppression répétée à grande échelle, il semble y avoir de nombreux neutrophiles dans l&#39;expiant (voir vidéo 1). Nous avons déterminé que ces cellules neutrophiles à partir d&#39;observations morphologiques de leur taille, la motilité rapidement, et leur migration hors de la feuille de cellules quand ils sont exposés au LPS (données non présentées). En outre, ces cellules se colorent brillamment l&#39;esprith un anticorps au facteur cytosolique des neutrophiles ainsi que d&#39;une variété d&#39;anticorps IgG secondaires, ce qui indique qu&#39;ils ont FcR abondants sur leur surface (données non présentées). Plusieurs couches de cellules sont présentes dans l&#39;expiant. La microscopie confocale révèle la présence d&#39;une seule couche à proximité du bord d&#39;attaque de plus de deux couches de kératinocytes à proximité de l&#39;échelle avec les neutrophiles visibles ci-dessus, en dessous et entre les feuilles de kératocytes cellulaire. Aux points de temps précoces, les cellules sur le bord de la multi-couche explant polariser, initiant la migration collective des kératinocytes de l&#39;explant à des taux initiaux de ~ 145 um / h. La zone couverte par l&#39;explant augmente rapidement, ce qui conduit à la propagation cellulaire, la tension à l&#39;intérieur de la feuille, et une diminution du taux de l&#39;avance du bord d&#39;attaque. Interconversions rapides entre les cellules de leader et suiveur sont observés à la pointe lors de la formation et de la fermeture de trous formés spontanément au sein de la feuille 7. Comme leEMT processus initié avec l&#39;expiant continue, les fragments de feuilles et les kératinocytes perdent leur spécialisé, la motilité rapide. L&#39;expression des gènes et des changements morphologiques compatibles avec EMT, la cicatrisation des plaies, et les réponses inflammatoires se produisent dans les 7 jours de culture avec des explants étant considérées comme viables pendant environ 10 jours 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:320px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35GC-1.5-14-C</td>
			<td style="width:320px;">1.5 mm&#160; thickness is best for coverslip removal.&#160; 14 mm diameter provides more culture area.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21909-460</td>
			<td style="width:320px;">We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

En raison de leurs propriétés uniques mobiles, kératocytes de poissons dissociées des cultures d&#39;explants ont longtemps été utilisés pour étudier les mécanismes de la migration d&#39;une cellule unique. Toutefois, lorsque explants sont établis, ces cellules se déplacent également collectivement, le maintien de nombreuses fonctionnalités qui rendent individuelle kératocytes un modèle attrayant pour étudier la migration: les taux rapides de la motilité, vaste lamelles d&#39;actine riche avec un câble d&#39;actine perpendiculaire, et la vitesse relativement constante et direction de la migration. Au début des explants, l&#39;interconversion rapide des cellules qui migrent individuellement avec ceux qui émigrent collectivement permet l&#39;étude du rôle des adhérences cellule-cellule pour déterminer le mode de la migration, et souligne les liens moléculaires entre les deux modes de migration. Les cellules dans les explants ultérieures perdent leur capacité à migrer rapidement et collectivement en tant que transition épithélio-mésenchymateuse se produit et les gènes associés à la guérison de la plaie et l&#39;inflammation sont exprimés différentiellement. Ainsi, kératocytes explants peuvent servir comme un modèle in vitro pour la réépithélialisation qui se produit lors de la cicatrisation des plaies cutanées et peuvent représenter un système unique d&#39;étudier les mécanismes de la migration cellulaire collective dans le cadre d&#39;un programme défini de changements dans l&#39;expression génique. Une variété de lignes de poisson zèbre mutantes et transgéniques sont disponibles, ce qui permet explants à établir à partir de poissons avec différents fonds génétiques. Ceci permet le rôle des protéines différentes à l&#39;intérieur de ces processus à traiter de manière unique. Les protocoles décrits ici décrivent une méthode simple et efficace pour l&#39;établissement de ces cultures d&#39;explants pour une utilisation dans une variété d&#39;essais liés à la migration cellulaire collective.

Comme illustré sur la figure 1, des feuilles de kératinocytes peuvent être observées migration de dessous de l&#39;échelle dans les heures suivant l&#39;établissement de la culture de l&#39;explant. Occasionnellement, une kératocyte migration individuelle qui se est détaché de la feuille migration collectivement peut être observée. En outre, dans l&#39;expiant a été établie à partir d&#39;un poisson qui a été préalablement pincées, il existe abondantes neutrophiles migrent à travers ...

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Kératocytes poisson zèbre migrent en feuilles de cellules à partir d&#39;explants et fournissent un modèle in vitro pour l&#39;étude des mécanismes de la migration cellulaire collective dans le contexte de la guérison de la plaie épithéliale. Ces protocoles détail un moyen efficace de mettre en place des cultures d&#39;explants primaires pour une utilisation dans des essais collectifs de migration cellulaire.

Poisson zèbre kératocyte explants d&#39;étudier la migration cellulaire collective et réépithélialisation dans la cicatrisation cutanée plaies

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

zebrafish-keratocyte-explants-to-study-collective-cell-migration

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K vues.  Midwestern University.  Kératocytes poisson zèbre migrent en feuilles de cellules à partir d'explants et fournissent un modèle in vitro pour l'étude des mécanismes de la migration cellulaire collective dans le contexte de la guérison de la plaie épithéliale. Ces protocoles détail un moyen efficace de mettre en place des cultures d'explants primaires pour une utilisation dans des essais collectifs de migration cellulaire. 

Vidéo: Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Optimisation du dosage Blessure Scratch pour détecter les changements dans murin mésenchymateuses stromales migration cellulaire Après Dommages par Soluble Extrait Cigarette Smoke

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Recherche

Biologie du développement

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonnaires explants à étudier les caractéristiques du développement précoce Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

en cours d&#39;analyse<em&gt; In Vivo</em&gt; Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Développement d&#39;un fibrotique du foie Modèle induite de l&#39;éthanol en Zebrafish pour étudier de cellules souches médiée hépatocytes Régénération

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Adénovirus thérapie génique diabétique Kératopathie: Effets sur la cicatrisation des plaies et des cellules souches Marker Expression dans Human cornées Organ-culture et de cellules épithéliales limbiques

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Un dispositif pour effectuer la migration cellulaire / Wound Healing dans une plaque à 96 puits

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Hybridation in situ à monture entière chez les embryons de poissons zèbres et l’essai de formation de tubes dans iPSC-ECs pour étudier le rôle de l’Endoglin dans le développement vasculaire

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

Un modèle de Drosophila pour étudier la polyploïdisation induite par les plaies

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.