Pour commencer, placez le tube de 15 millilitres contenant le réactif de digestion cellulaire enzymatique préchauffé dans un incubateur à 37 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Aliquote 500 microlitres de PBS/EDTA fraîchement préparé dans les puits d’une plaque à 24 puits. Sous un microscope à fond clair, observez la croissance d’organoïdes intestinaux humains tridimensionnels différenciés et de transwells.
Transférez les inserts de culture cellulaire du milieu de croissance vers la solution PBS/EDTA. Retirez le milieu de culture du côté apical et remplacez-le par 100 microlitres de PBS/EDTA sans perturber la couche cellulaire. Après avoir jeté le PBS/EDTA, retirez l’insert du puits, épongez-le doucement sur le bord d’une serviette en papier et inversé sur le dessus de la paillasse.
À l’aide d’une lame de scalpel tranchante, coupez autour de la circonférence intérieure de la membrane pour retirer la membrane de l’insert. Transférez la membrane à l’aide d’une pince dans le tube de 1,5 millilitre contenant 200 microlitres de réactif de digestion cellulaire enzymatique préchauffé. Placez la membrane pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone.
Toutes les 10 minutes, pipeter l’ensemble du volume cinq fois à l’aide d’une pipette P 200. Transférez un à deux microlitres de suspension cellulaire sur une lame de verre toutes les 10 minutes pour évaluer la dissociation en évaluant qualitativement le pourcentage de cellules individuelles. Après dissociation, combinez trois puits répliqués par condition dans un seul tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre.
Ajouter 400 microlitres de milieu de différenciation de culture cellulaire contenant 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK et mélanger délicatement par pipetage. Filtrez tout le volume à travers une passoire à pointe de 70 microns, en recueillant le flux dans un tube frais de 1,5 millilitre. Filtrez ensuite le flux obtenu à travers une passoire de 70 microns sur une crépine à pointe de 40 microns.
Ajoutez cinq microlitres de bleu de trypan à 0,4 % à cinq microlitres de suspension cellulaire et comptez les cellules uniques viables. Diluer l’échantillon avec un milieu de croissance WRNE pour obtenir 1 000 cellules par microlitre. Au total, 5 623 cellules uniques ont été isolées à partir d’organoïdes intestinaux humains jéjunaux différenciés cultivés sur des inserts de culture cellulaire membranaire.
